In Situ Chemotaxis Assay zur Untersuchung des mikrobiellen Verhaltens in aquatischen Ökosystemen

Zusammenfassung

Hier wird das Protokoll für einen In-situ-Chemotaxis-Assay vorgestellt, ein kürzlich entwickeltes mikrofluidisches Gerät, das Studien des mikrobiellen Verhaltens direkt in der Umwelt ermöglicht.

Zusammenfassung

Mikrobielle Verhaltensweisen wie Motilität und Chemotaxis (die Fähigkeit einer Zelle, ihre Bewegung als Reaktion auf einen chemischen Gradienten zu verändern), sind in den bakteriellen und archaealen Bereichen weit verbreitet. Chemotaxis können in heterogenen Umgebungen erhebliche Vorteile beim Erwerb von Ressourcen mit sich bringen. Es spielt auch eine entscheidende Rolle bei symbiotischen Wechselwirkungen, Krankheiten und globalen Prozessen, wie biogeochemische Radfahren. Aktuelle Techniken beschränken jedoch die Chemotaxis-Forschung auf das Labor und sind im Feld nicht leicht anwendbar. Hier wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für den Einsatz des In-situ-Chemotaxis-Assays (ISCA) vorgestellt, einem Gerät, das eine robuste Abfrage von mikrobiellen Chemotaxis direkt in der natürlichen Umgebung ermöglicht. Die ISCA ist ein mikrofluidisches Gerät, das aus einem 20-Well-Array besteht, in das Chemikalien von Interesse geladen werden können. Einmal in wässrigen Umgebungen eingesetzt, diffundieren Chemikalien aus den Brunnen und erzeugen Konzentrationsgradienten, die Mikroben spüren und darauf reagieren, indem sie über Chemotaxis in die Brunnen schwimmen. Der Brunneninhalt kann dann beprobt und verwendet werden, um (1) die Stärke der chemotaktischen Reaktionen auf bestimmte Verbindungen durch Durchflusszytometrie zu quantifizieren, (2) isolierbare und kulturresponsive Mikroorganismen zu isolieren und (3) die Identität und das genomische Potenzial der antwortenden Populationen durch molekulare Techniken zu charakterisieren. Die ISCA ist eine flexible Plattform, die in jedem System mit wässriger Phase eingesetzt werden kann, einschließlich Meeres-, Süßwasser- und Bodenumgebungen.

Einleitung

Verschiedene Mikroorganismen verwenden Beweglichkeit und Chemotaxis, um lückenhafte Nährstoffumgebungen auszubeuten, Wirte zu finden oder schädliche Bedingungen zu vermeiden^1,2,3. Diese mikrobiellen Verhaltensweisen können wiederum die Raten der chemischen Transformation beeinflussen⁴ und symbiotische Partnerschaften in terrestrischen, Süßwasser- und marinen Ökosystemen fördern^2,5.

Chemotaxis wurde in den letzten 60 Jahren unter Laborbedingungen ausgiebig untersucht⁶. Die erste quantitative Methode zur Untersuchung von Chemotaxis, der Kapillar-Assay, beinhaltet ein Kapillarrohr, das mit einem vermeintlichen Chemolockant gefüllt ist, das in eine Suspension von Bakterien eingetaucht ist⁶. Die Diffusion der Chemikalie aus dem Rohr erzeugt einen chemischen Gradienten, und chemotaktische Bakterien reagieren auf diesen Gradienten, indem sie in die Röhre⁷wandern. Seit der Entwicklung des Kapillar-Assays, der heute noch weit verbreitet ist, wurden viele andere Techniken entwickelt, um Chemotaxis unter zunehmend kontrollierten physikalisch-chemischen Bedingungen zu untersuchen, wobei die jüngste mit der Verwendung von Mikrofluidik^8,9,10.

Mikrofluidik, zusammen mit Hochgeschwindigkeits-Videomikroskopie, ermöglicht die Verfolgung des Verhaltens einzelner Zellen als Reaktion auf sorgfältig kontrollierte Gradienten. Obwohl diese Techniken unser Verständnis von Chemotaxis erheblich verbessert haben, wurden sie auf den Einsatz im Labor beschränkt und übersetzen sich nicht leicht in den Einsatz in Umweltsystemen. Infolgedessen wurde die Fähigkeit natürlicher Bakteriengemeinschaften, Chemotaxis in natürlichen Ökosystemen zu verwenden, nicht untersucht; Daher ist das derzeitige Verständnis der potenziellen ökologischen Bedeutung von Chemotaxis auf künstliche Laborbedingungen und eine begrenzte Anzahl von laborkultivierten bakteriellen Isolaten ausgerichtet. Die kürzlich entwickelte ISCA überwindet diese Einschränkungen¹¹.

Die ISCA baut auf dem allgemeinen Prinzip des Kapillar-Assays auf; Es nutzt jedoch moderne Mikrofabrikationstechniken, um eine hochgradig replizierte, leicht einsetzbare experimentelle Plattform für die Quantifizierung von Chemotaxis zu Verbindungen zu liefern, die für die natürliche Umwelt von Interesse sind. Es ermöglicht auch die Identifizierung und Charakterisierung von chemotaktischen Mikroorganismen durch direkte Isolierung oder molekulare Techniken. Während das erste Arbeitsgerät selbstgefertigt und aus Glas und PDMS¹¹gebaut wurde, besteht die neueste spritzgegossene Version aus Polycarbonat, wobei ein hochstandardisiertes Herstellungsverfahren verwendet wird (für Interesse an der neuesten Version des Geräts können die entsprechenden Autoren kontaktiert werden).

Der ISCA ist Kreditkartengröße und besteht aus 20 Brunnen, die in einem 5 x 4-Well-Array verteilt sind, die jeweils durch einen kleinen Port (800 m Durchmesser) mit der äußeren aquatischen Umgebung verbunden sind. Abbildung 1). Vermeintliche Chemoattractants, die über den Hafen in die Brunnen geladen werden, diffundieren in die Umgebung, und chemotaktische Mikroben reagieren, indem sie durch den Hafen in den Brunnen schwimmen. Da viele Faktoren das Ergebnis eines ISCA-Experiments in der natürlichen Umgebung beeinflussen können, wird dieses Schritt-für-Schritt-Protokoll neuen Benutzern helfen, potenzielle Hürden zu überwinden und effektive Bereitstellungen zu erleichtern.

Protokoll

Wir empfehlen, Abschnitt 1 vor Feldversuchen auszuführen, um die Ergebnisse zu optimieren.

1. Laboroptimierung

HINWEIS: Die im Optimierungsverfahren beschriebenen Volumina reichen für eine einzelne ISCA (bestehend aus 20 Brunnen) aus.

1. Herstellung der Chemikalie von Interesse
   HINWEIS: Die optimale Konzentration für jeden Chemo-Plünderer muss oft unter Laborbedingungen vor Feldeinsätzen bestimmt werden. Das Feld der chemischen Konzentration wird mit der Entfernung von der Quelle (ISCA-Brunnen) in der Größe abnehmen, was bedeutet, dass die Konzentration von Mikroorganismen in der Umgebung niedriger sein wird als die konzentration, die im Inneren des Geräts vorhanden ist. Die optimale Konzentration im ISCA-Gut hängt von der Diffusionsrate des Chemoattraktions ab. Wenn die Konzentration im Brunnen zu niedrig ist (nahe der Nachweisgrenze der Mikroben), werden keine positiven Chemotaxis beobachtet. Umgekehrt, wenn die Konzentration im Brunnen zu hoch ist, wird die Konzentration auch in der unmittelbaren Umgebung hoch sein und mikrobielle Akkumulation wird über den ISCA-Brunnen statt im Inneren auftreten. Daher sollten Verdünnungsreihen unter Laborbedingungen für jede Verbindung durchgeführt werden, um die optimale Konzentration für Feldeinsätze zu bestimmen. Idealerweise sollte auch ein Konzentrationsbereich vor Ort getestet werden, um Laborergebnisse zu bestätigen.
   1. 2,5 L eines geeigneten Mediums mit der entsprechenden Salzkonzentration (z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung [PBS] oder künstliches Meerwasser) vorbereiten. Filtern Sie das Medium mit einem 0,2-mm-Filter mit einer Peristaltik- oder Vakuumpumpe und einem Autoklaven.
   2. Bereiten Sie eine 10 mM Lösung von Chemoattractant in 1 ml des sterilen Mediums vor. Filtern Sie die Chemoattractantlösung mit einem 0,2 m Spritzenfilter, um Partikel und mögliche Verunreinigungen zu entfernen.
      HINWEIS: Idealerweise sollten in der keine anderen organischen Verbindungen als das Chemoattractant vorhanden sein.
2. Konzentrationsbereich nach Verdünnungsreihen
   1. Verdünnen Sie die gefilterte Chemolockant-Stammlösung in Reihe, die z.B. von 10 mM bis 100 m reicht.
      HINWEIS: Pro getesteter Konzentration wird mindestens ein Endvolumen von 0,7 ml benötigt.
3. IsCA geladen
   1. Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit dem gefilterten Chemoattractant und schließen Sie sie an eine 27 G Spritze an. Halten Sie die ISCA mit dem Port nach oben, langsam injizieren Sie die Substanz, bis ein kleines Tröpfchen auf dem Hafen erscheint.
      ANMERKUNG: 1) Jede Verdünnung oder Substanz muss mit einer separaten Spritze und Einer Nadel injiziert werden, um eine Kreuzkontamination zu verhindern. 2) Dieses kleine Tröpfchen ist wichtig, weil es sicherstellt, dass keine Luftblase im Hafen gefangen ist, was die Fähigkeit von Mikroben beeinträchtigen könnte, durch den Hafen zu migrieren. 3) Es wird empfohlen, eine ganze Reihe pro Stoff oder Konzentration (fünf Brunnen) zu füllen, um ein ausreichendes Mindestvolumen für weitere Analysen bereitzustellen. 4) Eine Zeile pro ISCA sollte als Negativkontrolle fungieren und mit dem gefilterten Medium gefüllt werden, in dem die Mikroben ausgesetzt werden. Diese Behandlung erklärt die Wirkung der zufälligen Beweglichkeit durch Mikroben in die ISCA-Brunnen und sollte verwendet werden, um die Behandlungen zu normalisieren, die ein Chemoattraktionsmittel enthalten.
4. Einsatz im Labor
   1. Über Nacht eine 5 ml Kultur mit 1% Meeresbrühe (für Meeresbakterien) oder 1% Lysogenybrühe (LB, für Süßwasserbakterien) angereichert.
      HINWEIS: Motile bakterielle Isolate oder natürliche Bakteriengemeinschaften können für Laboreinsätze verwendet werden.
   2. Inkubieren Sie die Kultur für 12 h bei Raumtemperatur (RT) und 180 Rpm. Nach 12 h, stellen Sie sicher, dass die mikrobiellen Gemeinschaften durch direkte Beobachtung unter dem Mikroskop motil sind.
   3. Die Kultur bei 1.500 x g für 10 min abdrehen und 1/100 in 150 ml geeignetem Medium (z.B. gefiltertes Meerwasser, gefiltertes Süßwasser) wieder aufsetzen.
   4. Legen Sie zwei kleine Stücke doppelseitigen Klebebandes auf die flache Oberfläche eines 200 ml Fassungsfachs (die Deckel von 1 ml Spitzenboxen haben dafür die idealen Abmessungen und können leicht autoklaviert werden). Platzieren Sie einen ISCA oben, um sicherzustellen, dass es sicher am Band befestigt wird. Füllen Sie das Einsatztablett mit einer 50 ml serologischen Pipette langsam mit der bakteriellen Lösung.
      HINWEIS: Füllen Sie das Fach, bis der ISCA unter ca. 1–2 cm Flüssigkeit getaucht ist. Wenn Sie mehrere Trays verwenden, verwenden Sie das gleiche Volume für alle.
   5. Lassen Sie die ISCA für 1 h brüten, um bakterielle Chemotaxis zu ermöglichen. Nach 1 h, entfernen Sie das Medium sehr sanft mit einer 50 ml serologischen Pipette, um turbulenten Fluss zu minimieren.
   6. Rufen Sie die ISCA aus dem Bereitstellungstask ab, ohne die obere Oberfläche zu berühren. Verwenden Sie eine Pipette und Einweg-Wischer, um die verbleibende Flüssigkeit auf der ISCA-Oberfläche zu entfernen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, die Ports während dieses Prozesses nicht zu berühren, da die daraus resultierenden Druckänderungen Bakterien aus der äußeren Umgebung entfernen oder in den Brunnen einbringen können und dadurch die bakterielle Dichte und Zusammensetzung im Brunnen verzerrt werden.
5. Abruf der Proben
   1. Halten Sie die ISCA mit dem Nachdruck nach unten, holen Sie das Volumen der Brunnen mit einer sterilen 27 G Spritzennadel, die an einer 1 ml Spritze befestigt ist.
      HINWEIS: Jede Zeile (wenn sie denselben Stoff enthält) kann gepoolt werden, um eine Arbeitsprobe von ca. 550 l bereitzustellen. Diese Probe kann anschließend je nach den erforderlichen nachgeschalteten Anwendungen in verschiedene Rohre eingegliedert werden.
   2. Bestimmen Sie die Anzahl der Bakterien, die zu jeder Chemoattraktionskonzentration angezogen werden, indem Sie die Proben mit Durchflusszytometrie¹²analysieren. Wählen Sie die Konzentration von Chemoattractant, die Chemotaxis für nachfolgende Feldeinsätze maximiert.

2. Vorbereitung auf den Einsatz vor Ort

HINWEIS: Die Vorbereitung des Materials und die Konstruktion des Strömungsdämpfungsgehäuses (Abschnitt 2) müssen vor dem Einsatz durchgeführt werden.

1. Herstellung von Materialien
   1. Bereiten Sie alle in Tabelle 1aufgeführten Materialien vor.
      HINWEIS: Materialmengen werden für einen ISCA bereitgestellt.
2. Konstruktion und Vorbereitung des Strömungsdämpfungsgehäuses
   HINWEIS: Das Strömungsdämpfungsgehäuse minimiert unerwünschte Turbulenzen, die sonst das Auftreten chemischer Gradienten verhindern, die von der ISCA ausgeht.
   1. Schneiden Sie die Teile für das Einsatzgehäuse mit einem Laserschneider aus einer 3 mm Acrylfolie.
      HINWEIS: Die Datei für die Stücke kann unter dem folgenden Link gefunden werden: .
   2. Montieren Sie die lasergeschnittenen Stücke, wie in Abbildung 2 mit Acrylkleber gezeigt.
      HINWEIS: Montieren Sie die Teile mit Sorgfalt. Bohrungen oder Fehlausrichtungen können bei der Bereitstellung zu Lecks führen, was sich direkt auf die Datenqualität auswirkt.
   3. Lassen Sie das montierte Gehäuse über Nacht trocknen.
   4. Waschen Sie das Gehäuse mit entionisiertem Wasser.
   5. Identifizieren Sie mögliche Leckagen, indem Sie entionisiertes Wasser in das Gehäuse gießen. Beheben Sie mögliche undichte Verbindungen, indem Sie mehr Acrylkleber hinzufügen, und wiederholen Sie dann die Schritte 2.2.3–2.2.5.
   6. Schneiden Sie die Schraubgewinde in das Acrylstück, das zur Sicherung des ISCA verwendet wird. Dies kann mit einem Wasserhahn mit einem Durchmesser und einer Steigung erreicht werden, die zu den Befestigungsschrauben passt.
      1. Zuerst den Wasserhahn in einen Hahnenschlüssel anbringen und dann das Acrylstück sichern, das in einem Tischschrauber angezapft wird. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, stellen Sie sicher, dass das Acrylstück so eben wie möglich ist. Stellen Sie sicher, dass der Hahn senkrecht zum Acrylstück ist, und drehen Sie den Hahnenschlüssel (im Uhrzeigersinn), indem Sie leichten Druck auf den Wasserhahn ausüben.
      2. Nach mehreren vollen Umdrehungen im Acrylstück die Drehung des Wasserhahns (gegen den Uhrzeigersinn) für ein Viertel einer Drehung umkehren, um Acryl aus dem Wasserhahn zu löschen. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gesamte Tiefe des Acrylstücks angezapft ist.
      3. Entfernen Sie schließlich den Wasserhahn (gegen den Uhrzeigersinn drehen) und testen Sie die Gewinde mit einer Schraube.

3. Verfahren vor Ort

1. Wasserfiltration
   1. Sammeln Sie Wasser vom Feldgelände, wenn Sie bereit sind, das Experiment zu starten. Filtern Sie 5 ml Wasser pro ISCA durch einen 0,2 m Spritzenfilter (mit einer 50 ml Spritze) in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr.
      HINWEIS: Ungefähr 3 ml gefiltertes Wasser sind erforderlich, um alle Brunnen eines ISCA zu füllen; Es wird jedoch empfohlen, 1) 5 ml pro Gerät zu filtern, um Verluste während des Vierfachfiltrationsprozesses zu berücksichtigen, und 2) Aliquots der Filtrate als Negativkontrollen sowohl für die Durchflusszytometrie als auch für molekulare Verfahren beizubehalten.
   2. Filtern Sie das Filtrat zweimal durch eine hydrophile GP-Filterpatrone von 0,2 m (beide Male mit derselben) mit einer neuen 50 ml Spritze in ein neues 50 ml konisches Zentrifugenrohr. Filtern Sie das Filtrat durch einen 0,02 m Spritzenfilter (mit einer neuen 50 ml Spritze) in ein neues 50 ml konisches Rohr.
      HINWEIS: Diese Vierfachfiltration sollte fast alle Mikroorganismen und Partikel aus dem Wasser entfernen. Halten Sie das endgültige Filtrat von jeder Wärmequelle fern, bis sie verwendet werden. Dieses Wasser wird verwendet, um alle in der ISCA verwendeten Chemikalien wieder auszusetzen, und es sollte bei der gleichen Temperatur wie das Wasser am Einsatzort gehalten werden. Konvektive Ströme, die durch Temperaturunterschiede zwischen den ISCA-Brunnen und der Außenumgebung ausgelöst werden, können andernfalls auftreten.
   3. Verwenden Sie Aliquots des Filtrats, um alle (typischerweise trocken) Chemopaugen auf die gewünschten Konzentrationen in 15 ml konischen Zentrifugenrohren auszusetzen.
   4. Filtern Sie die resuspendierten Chemoattractants durch einen 0,2 m Spritzenfilter mit einer 10 ml Spritze in sterile 15 ml konische Zentrifugenröhrchen, um unerwünschte Partikel oder wasserunlösliche Verbindungen (bei Verwendung von Extrakten) zu entfernen.
      HINWEIS: Filtern Sie vorsichtig, um zu verhindern, dass Partikel durch den Filter gelangen. Es ist wichtig, die Chemolockanten im ultragefilterten Wasser vom Feldplatz aus auszusetzen und nicht in andere Lösungen zu überweisen. Die Verwendung von Wasser aus dem Feldgelände ist notwendig, um (1) die gleiche Salzkonzentration in den Brunnen zu erhalten wie im Massenumweltwasser, um einen dichtegetriebenen Fluss zu verhindern und (2) sicherzustellen, dass der Nährstoffgehalt im Hintergrund innerhalb und außerhalb des Brunnens gleich ist.
2. ISCA-Füllung
   1. Führen Sie Abschnitt 1.3 aus, um die ISCA auszufüllen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, eine Reihe (fünf Brunnen) pro Substanz zu füllen (d. h. drei verschiedene Substanzen pro ISCA und eine ultrafiltrierte Meerwasserkontrolle).
3. Einsatz vor Ort
   1. Schrauben Sie den ISCA (Abbildung 3A) auf Stück 9 des Gehäuses (Abbildung 2K und Abbildung 3B).
      HINWEIS: Das oben beschriebene Strömungsdämpfegehäuse kann zwei ISCAs nebeneinander oder einen ISCA in der Mitte enthalten.
   2. Schließen Sie das Gehäuse (Abbildung 3C) und versiegeln Sie es mit Klebeband (Abbildung 3D).
      HINWEIS: Falten müssen vermieden werden, um eine perfekte Versiegelung zu gewährleisten. Versiegeln Sie zuerst alle Seiten, dann (in einem zweiten Schritt) die Seitenlöcher, die verwendet werden, um Wasser aus dem Gehäuse am Ende der Probenahme abzuleiten. Versiegeln Sie die oberen und unteren Löcher nicht. Stellen Sie die ISCA nicht auf den Kopf, da dichtegetriebene Strömung in Brunnen auftreten kann, die Chemolockanten enthalten, was die Anzahl der Zellen in den Brunnen verzerrt.
   3. Da das Gehäuse während des Einsatzes stabil bleiben muss, wird empfohlen, es mit Bungee-Schnüren an von Menschenhand (z. B. Pontoon, Leiter) zu befestigen.
      HINWEIS: Das Gehäuse kann mit Bungee-Kabeln vor dem Eintauchen in das Wasser an einem Einsatzarm (hier eine modifizierte Klemme mit senkrechter Plattform) befestigt werden. Alternativ kann das Gehäuse mit geringem Gewicht auf flachen Substraten befüllt und gesichert werden. Wenn Einsätze im pelagischen Ozean vorgesehen sind, kann das Gehäuse an einem Netz mit einer Boje auf der einen Seite und Tauchgewicht auf der anderen Seite befestigt werden.
   4. Tauchen Sie das Gehäuse vollständig ein, um mit dem Füllen zu beginnen. Halten Sie das Gehäuse während der Füllung fest, um übermäßige Wasserbewegungen im Inneren zu verhindern. Sobald der Wasserstand die Oberseite des Gehäuses erreicht hat, stellen Sie sicher, dass keine Luft im Inneren eingeschlossen ist.
      HINWEIS: Falls einige Luftblasen eingeschlossen sind, neigen Sie das Gehäuse sanft mit dem nach oben gerichteten Entlüftungsloch, wodurch die Blasen entweichen können.
   5. Nach vollständiger Vollung die unteren und oberen Löcher mit zwei Steckern versiegeln, die aus Silizium oder Gummi hergestellt werden können, oder durch Abdichten der Extremitäten von 20 L Pipettenspitzen (Abbildung 4).
      HINWEIS: Dieser Schritt verhindert den Fluss innerhalb des Gehäuses während der Probenahme.
   6. Lassen Sie die ISCA für 1-3 h an Ort und Stelle für die Probenahme.
      HINWEIS: Die ideale Einsatzzeit wird in erster Linie durch die Temperatur des Wassers und die Verdoppelung der Zeit der Bakteriengemeinschaft bestimmt. Wenn die Wassertemperatur über 20 °C liegt, wird es nicht empfohlen, die ISCA für mehr als 1 h einzusetzen, da die Zellteilung in den Brunnen auftreten kann, die Chemolockanten enthalten, nach 1,5–2,0 h. Die optimale Einsatzzeit kann jedoch vor dem ISCA-Experiment getestet werden, indem natürliche Gemeinschaften mit den geladenen Chemikalien geändert und die Anzahl der Zellen im Laufe der Zeit quantifiziert werden.
   7. Entfernen Sie das Gehäuse aus dem Wasser. Legen Sie es über einen Behälter, so dass das Wasser aus dem Gehäuse abgelassen werden kann.
   8. Entfernen Sie den oberen Teil des Klebebandes sehr sanft von den vorderen Löchern.
      HINWEIS: Der Wasserfluss, der das Gehäuse verlässt, muss mit einer Tropfengeschwindigkeit sein. Fahren Sie ein Loch nach dem anderen fort, von der Oberseite des Gehäuses bis zum Boden. Es sollte etwa 10–15 min dauern, um das Gehäuse vollständig zu entleeren.
   9. Sobald die Wasserlinie unter der Oberseite des ISCA verläuft, entfernen Sie den unteren Stecker und entleeren Sie den Rest des Wassers.
   10. Während die ISCAs noch am Gehäuse befestigt sind, entfernen Sie vorsichtig das Wasser, das auf der OBERSEITE der ISCA gefangen ist, mit einer 1 ml Pipette.
   11. Entfernen Sie den ISCA, ohne die obere Oberfläche zu berühren, und entfernen Sie mit einem Einwegtuch die verbleibende Flüssigkeit auf der Oberfläche.
       HINWEIS: Es ist wichtig, die Ports während dieses Prozesses nicht zu berühren, da die daraus resultierenden Druckänderungen Massenbakterien in den Brunnen entfernen oder hinzufügen können und die Bakterienzahlen verzerrt.
   12. Rufen Sie die Beispiele aus der ISCA ab, indem Sie Schritt 1.5.1 wiederholen.

4. Nachgelagerte Anwendungen

HINWEIS: Volumes werden basierend auf einer 550-L-Probe (eine Zeile eines ISCA) angegeben.

1. Fix ieren Sie 100 l Brunnengehalt mit Glutaraldehyd (2% Endkonzentration) für die Durchflusszytometrie, um Chemotaxis zu jedem Lockmittel zu quantifizieren.
   HINWEIS: Auf Eis (oder bei 4 °C) aufbewahren und die Proben am selben Tag analysieren. Alternativ können Proben nach der Fixierung in flüssigem Stickstoff eingefroren werden, wenn eine Analyse am selben Tag nicht möglich ist. Durchflusszytometrie ist die empfohlene Methode, um die Anzahl der Zellen in den ISCA-Brunnen zu quantifizieren, da sie einfach, schnell und genau ist¹².
2. Snap Freeze 300 l Brunnengehalt in flüssigem Stickstoff für die nachfolgende DNA-Extraktion und -Analyse¹¹.
   HINWEIS: Bewahren Sie die Proben bis zur Analyse bei -80 °C auf.
3. Fügen Sie 90 L Well-Inhalt zu 10 l TE-Glyzerinpuffer hinzu und fangen Sie die Proben für die einzellige Genomik¹³ein.
4. Auf Agarplatten, die das gewünschte Medium für die bakterielle Isolierung enthalten, 10–20 l verteilen.

Ergebnisse

Dieser Abschnitt stellt Laborergebnisse mit der ISCA vor, um die chemotaktische Reaktion von Marinemikroben auf einen Konzentrationsbereich von Glutamin zu testen, einer Aminosäure, die bekanntermaßen Bodenbakterien anzieht¹⁴. Die Konzentration von Glutamin, die die stärkste chemotaktische Reaktion in den Labortests auslöste, wurde verwendet, um einen Chemotaxis-Assay in der Meeresumwelt durchzuführen.

Zur Durchführung der Labortests wurden Meerwassergemeinschafte...

Diskussion

Auf der Skala der aquatischen Mikroorganismen ist die Umwelt bei weitem nicht homogen und ist oft durch physikalische/chemische Gradienten gekennzeichnet, die mikrobielle Gemeinschaften^1,15strukturieren. Die Fähigkeit von motilen Mikroorganismen, Verhalten (d.h. Chemotaxis) zu verwenden, erleichtert die Nahrungsaufnahme innerhalb dieser heterogenen Mikroumgebungen¹. Das Studium von Chemotaxis direkt in der Umwelt hat das Potenzial, wichti...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic glue	Evonik	1133	Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K725	Or different company
Adhesive tape	Scotch	3M 810	Scotch Magic tape
Autoclave	Systec	D-200	Or different company
Benchtop centrifuge	Fisher Scientific	75002451	Or different company
Bungee cord	Paracord Planet	667569184000	Or different company
Centrifuge tube - 2 mL	Sigma Aldrich	BR780546-500EA	Eppendorf tube
Conical centrifuge tube - 15 mL	Fisher Scientific	11507411	Falcon tube
Conical centrifuge tube - 50 mL	Fisher Scientific	10788561	Falcon tube
Deployment arm	Irwin	1964719	Or different company
Deployment enclosure plug	Fisher Scientific	21-236-4	See alternatives in manuscript
Disposable wipers	Kimtech - Fisher Scientific	06-666	Kimwipes
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Or different company
Green fluorescent dye	Sigma Aldrich	S9430	SYBR Green I - 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm	Merck	C3235	Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)	-	-	Contact corresponding authors
Laser cutter	Epilog Laser	Fusion pro 32	Or different company
Luria Bertani Broth	Sigma Aldrich	L3022	Or different company
Marine Broth 2216	VWR	90004-006	Difco
Nylon slotted flat head screws	McMaster-Carr	92929A243	M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	Or different company
Pipette tips - 1 mL	Fisher Scientific	21-236-2A	Or different company
Pipette tips - 20 µL	Fisher Scientific	21-236-4	Or different company
Pipette tips - 200 µL	Fisher Scientific	21-236-1	Or different company
Sea salt	Sigma Aldrich	S9883	For artificial seawater
Serological pipette - 50 mL	Sigma Aldrich	SIAL1490-100EA	Or different company
Syringe filter - 0.02 µm	Whatman	WHA68091002	Anatop filter
Syringe filter - 0.2 µm	Fisher Scientific	10695211	Or different company
Syringe needle 27G	Henke Sass Wolf	4710004020	0.4 × 12 mm
Syringes - 1 mL	Codau	329650	Insulin Luer U-100
Syringes - 10 mL	BD	303134	Or different company
Syringes - 50 mL	BD	15899152	Or different company
Tube rack - 15 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Tube rack - 50 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap	McMaster-Carr	8305A77	Or different company
Vacuum filter - 0.2 µm	Merck	SCGPS05RE	Steritop filter