Ensayo de Chemotaxis Situ para Examinar el Comportamiento Microbiano en Ecosistemas Acuáticos

Resumen

Aquí se presenta el protocolo para un ensayo de quimiotaxis in situ, un dispositivo microfluídico desarrollado recientemente que permite estudios de comportamiento microbiano directamente en el medio ambiente.

Resumen

Los comportamientos microbianos, como la motilidad y la quimiotaxis (la capacidad de una célula para alterar su movimiento en respuesta a un gradiente químico), están muy extendidos en los dominios bacteriano y arqueal. La quimiotaxis puede dar lugar a ventajas sustanciales de adquisición de recursos en entornos heterogéneos. También desempeña un papel crucial en las interacciones simbióticas, enfermedades, y procesos globales, como el ciclo biogeoquímico. Sin embargo, las técnicas actuales restringen la investigación de quimiotaxis al laboratorio y no son fácilmente aplicables en el campo. Aquí se presenta un protocolo paso a paso para el despliegue del ensayo de quimiotaxis in situ (ISCA), un dispositivo que permite un interrogatorio robusto de quimiotaxis microbiana directamente en el entorno natural. El ISCA es un dispositivo microfluídico que consiste en una matriz de 20 pozos, en la que se pueden cargar productos químicos de interés. Una vez desplegados en ambientes acuosos, los productos químicos se difunden fuera de los pozos, creando gradientes de concentración que los microbios detectan y responden nadando en los pozos a través de la quimiotaxis. El contenido del pozo se puede muestrear y utilizar para (1) cuantificar la fuerza de las respuestas quimiotácticas a compuestos específicos a través de la citometría de flujo, (2) aislar y cultivar microorganismos sensibles, y (3) caracterizar la identidad y el potencial genómico de las poblaciones que responden a través de técnicas moleculares. La ISCA es una plataforma flexible que se puede implementar en cualquier sistema con una fase acuosa, incluyendo ambientes marinos, de agua dulce y de suelo.

Introducción

Diversos microorganismos utilizan motilidad y quimiotaxis para explotar ambientes de nutrientes irregulares, encontrar huéspedes, o evitar condiciones perjudiciales^1,2,3. Estos comportamientos microbianos pueden a su vez influir en las tasas de transformación química⁴ y promover asociaciones simbióticas en los ecosistemas terrestres, de agua dulce y marinos^2,,5.

La quimiotaxis ha sido ampliamente estudiada en condiciones de laboratorio durante los últimos 60 años^6. El primer método cuantitativo para estudiar la quimiotaxis, el ensayo capilar, consiste en un tubo capilar lleno de un quimioatractante putativo sumergido en una suspensión de bacterias^6. La difusión del producto químico fuera del tubo crea un gradiente químico, y las bacterias quimiotácticas responden a este gradiente migrando al tubo⁷. Desde el desarrollo del ensayo capilar, todavía ampliamente utilizado hoy en día, se han desarrollado muchas otras técnicas para estudiar la quimiotaxis en condiciones físicas/químicas cada vez más controladas, con la más reciente implicación del uso de microfluidos^8,,9,,10.

Los microfluídicos, junto con la microscopía de vídeo de alta velocidad, permiten rastrear el comportamiento de las células individuales en respuesta a gradientes cuidadosamente controlados. Aunque estas técnicas han mejorado enormemente nuestra comprensión de la quimiotaxis, se han limitado al uso en laboratorio y no se traducen fácilmente en el despliegue de campo en los sistemas ambientales. Como consecuencia, no se ha examinado la capacidad de las comunidades naturales de bacterias para utilizar quimiotaxis dentro de los ecosistemas naturales; por lo tanto, la comprensión actual de la importancia ecológica potencial de la quimiotaxis está sesgada hacia condiciones de laboratorio artificiales y un número limitado de aislados bacterianos cultivados en laboratorio. El ISCA recientemente desarrollado supera estas limitaciones¹¹.

La ISCA se basa en el principio general del ensayo capilar; sin embargo, hace uso de técnicas modernas de microfabricación para entregar una plataforma experimental altamente replicada y fácilmente desplegable para la cuantificación de la quimiotaxis hacia compuestos de interés en el medio natural. También permite la identificación y caracterización de microorganismos quimiotácticos mediante aislamiento directo o técnicas moleculares. Mientras que el primer dispositivo de trabajo fue autofabricado y construido de vidrio y PDMS¹¹, la última versión moldeada por inyección se compone de policarbonato, utilizando un procedimiento de fabricación altamente estandarizado (para el interés en la última versión del dispositivo, se puede contactar con los autores correspondientes).

El ISCA es del tamaño de una tarjeta de crédito y consta de 20 pozos distribuidos en una matriz de 5 x 4 pozos, cada uno vinculado al medio acuático externo por un pequeño puerto (800 m de diámetro; Figura 1). Los quimioatractantes putativos cargados en los pozos se difunden en el medio ambiente a través del puerto, y los microbios quimiotácticos responden nadando a través del puerto en el pozo. Como muchos factores pueden influir en el resultado de un experimento ISCA en el entorno natural, este protocolo paso a paso ayudará a los nuevos usuarios a superar posibles obstáculos y facilitar implementaciones eficaces.

Protocolo

Se recomienda ejecutar la sección 1 antes de los experimentos de campo para optimizar los resultados.

1. Optimización de laboratorio

NOTA: Los volúmenes descritos en el procedimiento de optimización son suficientes para un único ISCA (compuesto por 20 pozos).

1. Preparación del producto químico de interés
   NOTA: La concentración óptima para cada quimioatractant a menudo debe determinarse en condiciones de laboratorio antes de los despliegues sobre el terreno. El campo de concentración química disminuirá en magnitud con la distancia de la fuente (pozo ISCA), lo que significa que la concentración experimentada por los microorganismos en el medio ambiente será menor que la presente dentro del dispositivo. La concentración óptima a utilizar en el pozo ISCA depende de la tasa de difusión del quimioatractant. Si la concentración en el pozo es demasiado baja (cerca del límite de detección de los microbios), no se observará quimiotaxis positiva. Por el contrario, si la concentración en el pozo es demasiado alta, la concentración también será alta en el ambiente inmediato y la acumulación microbiana se producirá por encima de los pozos ISCA en lugar de dentro. Por lo tanto, las series de dilución deben llevarse a cabo en condiciones de laboratorio para cada compuesto con el fin de determinar la concentración óptima para los despliegues en campo. Idealmente, también se debe probar un rango de concentración sobre el terreno para confirmar los resultados de laboratorio.
   1. Preparar 2,5 L de un medio adecuado que contenga la concentración de sal adecuada (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato [PBS] o agua de mar artificial). Filtrar el medio con un filtro de 0,2 m utilizando una bomba peristáltica o de vacío y autoclave.
   2. Preparar una solución de 10 mM de quimioatractant en 1 ml del medio estéril. Filtrar la solución quimioatractant con un filtro de jeringa de 0,2 m para eliminar partículas y contaminantes potenciales.
      NOTA: Idealmente, no hay compuestos orgánicos que no sean el quimioatractant debe estar presente en la solución final.
2. Rango de concentración por serie de dilución
   1. Diluir la solución filtrada de quimioatractantes en serie, que van (por ejemplo) de 10 mM a 100 m.
      NOTA: Se necesita al menos un volumen final de 0,7 ml por concentración probada.
3. Carga de la ISCA
   1. Llene una jeringa de 1 ml con el quimioatractant filtrado y conéctelo a una jeringa de 27 G. Sosteniendo el ISCA con el puerto mirando hacia arriba, inyecte lentamente la sustancia hasta que aparezca una pequeña gota en la parte superior del puerto.
      NOTA: 1) Cada dilución o sustancia debe inyectarse con una jeringa y una aguja separadas para evitar la contaminación cruzada. 2) Esta pequeña gota es importante porque asegura que ninguna burbuja de aire está atrapada dentro del puerto, lo que podría afectar la capacidad de los microbios para migrar a través del puerto. 3) Se recomienda llenar una fila entera por sustancia o concentración (cinco pozos) para proporcionar un volumen mínimo adecuado para análisis posteriores. 4) Una fila por ISCA debe actuar como control negativo y debe llenarse con el medio filtrado en el que se suspenderán los microbios. Este tratamiento explica el efecto de la motilidad aleatoria por microbios en los pozos ISCA y debe utilizarse para normalizar los tratamientos que contienen un quimioatractant.
4. Despliegue en el laboratorio
   1. Durante la noche, incubar un cultivo de 5 ml enriquecido con 1% de caldo marino (para bacterias marinas) o 1% caldo de lysogeny (LB, para bacterias de agua dulce).
      NOTA: Los aislados bacterianos móviles o las comunidades bacterianas naturales se pueden utilizar para despliegues de laboratorio.
   2. Incubar el cultivo durante 12 h a temperatura ambiente (RT) y 180 rpm. Después de 12 h, asegúrese de que las comunidades microbianas son móviles por observación directa bajo un microscopio.
   3. Girar hacia abajo el cultivo a 1.500 x g durante 10 minutos y resuspend 1/100 en 150 ml de medio adecuado (por ejemplo, agua de mar filtrada, agua dulce filtrada).
   4. Coloque dos pequeños trozos de cinta adhesiva de doble cara en la superficie plana de una bandeja de capacidad de 200 ml (las tapas de las cajas de punta de 1 ml tienen las dimensiones ideales para este propósito y se pueden autoclavarse fácilmente). Coloque una ISCA en la parte superior, asegurándose de que se conecta de forma segura a la cinta. Llene lentamente la bandeja de despliegue con la solución bacteriana utilizando una pipeta serológica de 50 ml.
      NOTA: Llene la bandeja hasta que la ISCA esté sumergida por menos de 1-2 cm de líquido. Si utiliza varias bandejas, utilice el mismo volumen en todos.
   5. Deje que la ISCA se incuba durante 1 h para permitir la quimiotaxis bacteriana. Después de 1 h, retire el medio muy suavemente con una pipeta serológica de 50 ml para minimizar el flujo turbulento.
   6. Recupere el ISCA de la bandeja de despliegue sin tocar la superficie superior. Utilice una pipeta y limpiaparabrisas desechables para eliminar el líquido restante en la superficie de ISCA.
      NOTA: Es importante evitar tocar los puertos durante este proceso, ya que los cambios resultantes en la presión pueden eliminar o añadir bacterias del ambiente exterior al pozo y así sesgar la densidad bacteriana y la composición dentro del pozo.
5. Recuperación de las muestras
   1. Sosteniendo el ISCA con el puerto orientado hacia abajo, recupere el volumen de los pozos utilizando una aguja estéril de jeringa de 27 G unida a una jeringa de 1 ml.
      NOTA: Cada fila (si contiene la misma sustancia) se puede agrupar para proporcionar una muestra de trabajo de aproximadamente 550 l. Esta muestra puede ser posteriormente alícuota en diferentes tubos dependiendo de las aplicaciones posteriores requeridas.
   2. Determinar el número de bacterias atraídas a cada concentración de quimioatractantes mediante el análisis de las muestras con citometría de flujo¹². Elija la concentración de quimioatractant que maximiza la quimiotaxis para implementaciones de campo posteriores.

2. Preparación para el despliegue sobre el terreno

NOTA: La preparación del material y la construcción de la carcasa de amortiguación de flujo (sección 2) deben llevarse a cabo antes del despliegue.

1. Preparación de materiales
   1. Prepare todos los materiales enumerados en la Tabla 1.
      NOTA: Se proporcionan cantidades de material para un ISCA.
2. Construcción y preparación del cerramiento de amortiguación de flujo
   NOTA: La carcasa de amortiguación de flujo minimiza las turbulencias no deseadas que de otro modo impiden el establecimiento de gradientes químicos que emanan de la ISCA.
   1. Corte las piezas para el gabinete de despliegue con un cortador láser de una lámina de acrílico de 3 mm.
      NOTA: El archivo de las piezas se puede encontrar utilizando el siguiente enlace: .
   2. Montar las piezas cortadas por láser como se muestra en la Figura 2 utilizando pegamento acrílico.
      NOTA: Montar las piezas con cuidado. Los agujeros o la desalineación pueden crear fugas en la implementación, lo que afecta directamente a la calidad de los datos.
   3. Deje que el recinto montado se seque durante la noche.
   4. Lave el recinto con agua desionizada.
   5. Identifique posibles fugas vertiendo agua desionizada en el recinto. Corrija las posibles articulaciones con fugas añadiendo más pegamento acrílico y, a continuación, repita los pasos 2.2.3–2.2.5.
   6. Corte las roscas de tornillo en la pieza de acrílico que se utilizará para fijar el ISCA. Esto se puede lograr usando un grifo con un diámetro y paso que coincida con los tornillos de montaje.
      1. En primer lugar, coloque el grifo en una llave de grifo y, a continuación, fije la pieza de acrílico que se va a roscar en un vicio de sobremesa. Para obtener los mejores resultados, asegúrese de que la pieza de acrílico esté lo más nivelada posible. Asegúrese de que el grifo es perpendicular a la pieza acrílica y comience a girar la llave del grifo (en el sentido de las agujas del reloj), aplicando presión ligera al grifo.
      2. Después de varias revoluciones completas en la pieza de acrílico, invierta la rotación del grifo (en sentido contrario a las agujas del reloj) durante un cuarto de rotación para eliminar el acrílico del grifo. Repita el proceso hasta que se toque toda la profundidad de la pieza acrílica.
      3. Por último, retire el grifo (girando en sentido contrario a las agujas del reloj) y pruebe las roscas con un tornillo.

3. Procedimiento sobre el terreno

1. Filtración de agua
   1. Recoja el agua del sitio de campo cuando esté listo para iniciar el experimento. Filtrar 5 ml de agua por ISCA a través de un filtro de jeringa de 0,2 m (con una jeringa de 50 ml) en un tubo de centrífuga cónica de 50 ml.
      NOTA: Se requieren aproximadamente 3 ml de agua filtrada para llenar todos los pozos de un ISCA; sin embargo, se recomienda filtrar 1) 5 ml por dispositivo para tener en cuenta las pérdidas durante el proceso de filtración cuádruple, y 2) conservar las alícuotas de los filtrados como controles negativos tanto para la citometría de flujo como para los procedimientos moleculares.
   2. Filtrar el filtrado dos veces a través de un cartucho de filtro GP hidrófilo de 0,2 m (utilizando el mismo, ambas veces) con una nueva jeringa de 50 ml en un nuevo tubo de centrífuga cónica de 50 ml. Filtrar el filtrado a través de un filtro de jeringa de 0,02 m (con una nueva jeringa de 50 ml) en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
      NOTA: Esta filtración cuádruple debe eliminar casi todos los microorganismos y partículas del agua. Mantenga el filtrado final lejos de cualquier fuente de calor hasta su uso. Esta agua se utilizará para resuspender todos los productos químicos utilizados en la ISCA, y debe mantenerse a la misma temperatura que el agua en el sitio de despliegue. De lo contrario, pueden producirse flujos convectivos desencadenados por diferencias de temperatura entre los pozos ISCA y el entorno exterior.
   3. Utilice alícuotas del filtrado para resuspender todos los quimioatractantes de interés (normalmente secos) a las concentraciones deseadas en tubos de centrífuga cónica de 15 ml.
   4. Filtrar los quimioatractantes resuspendidos a través de un filtro de jeringa de 0,2 m con una jeringa de 10 ml en tubos estériles de centrífuga cónica de 15 ml para eliminar partículas no deseadas o compuestos insolubles en agua (si se utilizan extractos).
      NOTA: Filtre suavemente para evitar que las partículas pasen a través del filtro. Es importante resuspender los quimioatractantes en el agua ultrafiltrada del sitio de campo y no solubilizarlos en otras soluciones. El uso de agua del sitio de campo es necesario (1) obtener la misma concentración de sal dentro de los pozos que en el agua ambiental a granel para evitar el flujo impulsado por la densidad, y (2) garantizar que los niveles de nutrientes de fondo son iguales dentro y fuera del pozo.
2. Relleno ISCA
   1. Realice la sección 1.3 para llenar el ISCA.
      NOTA: Se recomienda llenar una fila (cinco pozos) por sustancia (es decir, tres sustancias diferentes por ISCA y un control de agua de mar ultrafiltrado).
3. Despliegue sobre el terreno
   1. Atornille el ISCA (Figura 3A) a la pieza 9 de la carcasa(Figura 2K y Figura 3B).
      NOTA: La carcasa de amortiguación de flujo delineada anteriormente puede contener dos ISCA uno al lado del otro o un ISCA colocado en su centro.
   2. Cierre la carcasa (Figura 3C) y selle con cinta adhesiva (Figura 3D).
      NOTA: Las arrugas deben evitarse para garantizar un sellado perfecto. Selle todos los lados primero, luego (en un segundo paso) selle los orificios laterales, que se utilizarán para drenar el agua de la carcasa al final del muestreo. No selle los orificios superior e inferior. No coloque el ISCA boca abajo, ya que el flujo impulsado por la densidad puede ocurrir en pozos que contienen quimioatractantes, lo que sesgará el número de células en los pozos.
   3. Debido a que el gabinete debe permanecer estable durante el despliegue, se recomienda fijarlo a las estructuras artificiales (por ejemplo, pontón, escalera) utilizando cordones de bungee.
      NOTA: La carcasa se puede conectar a un brazo de despliegue (aquí, una abrazadera modificada con una plataforma perpendicular) utilizando cables de bungee antes de la inmersión en el agua. Alternativamente, el gabinete se puede llenar y asegurar con un pequeño peso en sustratos poco profundos. Si los despliegues están previstos en el océano pelágico, el recinto se puede conectar a una red con una boya en un lado y el peso de buceo en el otro.
   4. Sumerja completamente la carcasa para empezar a llenar. Durante el llenado, sostenga la carcasa firmemente para evitar el movimiento excesivo del agua en el interior. Una vez que el nivel del agua llegue a la parte superior de la carcasa, asegúrese de que no haya aire atrapado en el interior.
      NOTA: En caso de que algunas burbujas de aire queden atrapadas, incline la carcasa suavemente con el orificio de ventilación hacia arriba, lo que permitirá que las burbujas escapen.
   5. Una vez completamente llenos, sellar los orificios inferior y superior con dos tapones, que pueden estar hechos de silicio o caucho o sellando las extremidades de las puntas de pipeta de 20 l (Figura 4).
      NOTA: Este paso impide el flujo dentro de la carcasa durante el muestreo.
   6. Deje el ISCA en su lugar para el muestreo durante 1–3 h.
      NOTA: El tiempo de despliegue ideal está dictado principalmente por la temperatura del agua y el tiempo de duplicación de la comunidad bacteriana. Cuando la temperatura del agua está por encima de 20 oC, no se recomienda desplegar el ISCA durante más de 1 h, ya que la división celular puede ocurrir en los pozos que contienen quimioatractantes después de 1.5–2.0 h. Sin embargo, el tiempo óptimo de despliegue se puede probar antes del experimento ISCA modificando las comunidades naturales con los productos químicos cargados y cuantificando el número de células a través del tiempo.
   7. Retire el cerramiento del agua. Colóquelo sobre un recipiente que permita drenar el agua del recinto.
   8. Retire la parte superior de la cinta adhesiva de los orificios delanteros con mucha succión.
      NOTA: El flujo del agua que sale de la carcasa debe estar a una velocidad de goteo. Proceda un agujero a la vez, desde la parte superior de la carcasa hasta la parte inferior. Debe tomar aproximadamente 10–15 minutos para drenar el gabinete por completo.
   9. Una vez que la línea de flotación pase por debajo de la parte superior de la ISCA, retire el tapón inferior y drene el resto del agua.
   10. Mientras que los ISCA todavía están conectados a la carcasa, retire cuidadosamente el agua atrapada en la parte superior de la ISCA con una pipeta de 1 ml.
   11. Retire el ISCA sin tocar la superficie superior y utilice una toallita desechable para eliminar el líquido restante en la superficie.
       NOTA: Es importante no tocar los puertos durante este proceso, ya que los cambios resultantes en la presión pueden eliminar o agregar bacterias a granel en el pozo y sesgo de los recuentos bacterianos.
   12. Recupere las muestras del ISCA repitiendo el paso 1.5.1.

4. Aplicaciones de nivel inferior

NOTA: Los volúmenes se dan sobre la base de una muestra de 550 l (una fila de un ISCA).

1. Fijar 100 l de contenido de pozo con glutaraldehído (2% concentración final) para la citometría de flujo para cuantificar la quimiotaxis a cada atractor.
   NOTA: Almacenar en hielo (o a 4 oC) y analizar las muestras el mismo día. Alternativamente, las muestras pueden ser congeladas en nitrógeno líquido después de la fijación si el análisis no es factible en el mismo día. La citometría de flujo es el método recomendado para cuantificar el número de células en los pozos ISCA, ya que es sencillo, rápido y preciso¹².
2. Congelación a presión 300 l de contenido de pozo en nitrógeno líquido para la posterior extracción y análisis de ADN¹¹.
   NOTA: Almacene las muestras a -80 oC hasta el análisis.
3. Añadir 90 l de contenido de pozo a 10 ml de tampón de TE-glicerol y congelar las muestras para la genómica de una sola célula¹³.
4. Extienda de 10 a 20 ml en placas de agar que contengan el medio deseado para el aislamiento bacteriano.

Resultados

Esta sección presenta los resultados de laboratorio utilizando el ISCA para probar la respuesta quimiotáctica de los microbios marinos a un rango de concentración de glutamina, un aminoácido conocido por atraer bacterias del suelo¹⁴. La concentración de glutamina que provocó la respuesta quimiotáctica más fuerte en las pruebas de laboratorio se utilizó para realizar un ensayo de quimiotaxis en el medio marino.

Para realizar las pruebas de laboratorio, las comun...

Discusión

A escala de microorganismos acuáticos, el medio ambiente está lejos de ser homogéneo y a menudo se caracteriza por gradientes físicos/químicos que estructuran las comunidades microbianas^1,,15. La capacidad de los microorganismos móviles para utilizar el comportamiento (es decir, quimiotaxis) facilita la bifurcación dentro de estos microambientes heterogéneos¹. Estudiar la quimiotaxis directamente en el medio ambiente tiene el poten...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic glue	Evonik	1133	Acrifix 1S 0116
Acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K725	Or different company
Adhesive tape	Scotch	3M 810	Scotch Magic tape
Autoclave	Systec	D-200	Or different company
Benchtop centrifuge	Fisher Scientific	75002451	Or different company
Bungee cord	Paracord Planet	667569184000	Or different company
Centrifuge tube - 2 mL	Sigma Aldrich	BR780546-500EA	Eppendorf tube
Conical centrifuge tube - 15 mL	Fisher Scientific	11507411	Falcon tube
Conical centrifuge tube - 50 mL	Fisher Scientific	10788561	Falcon tube
Deployment arm	Irwin	1964719	Or different company
Deployment enclosure plug	Fisher Scientific	21-236-4	See alternatives in manuscript
Disposable wipers	Kimtech - Fisher Scientific	06-666	Kimwipes
Flow cytometer	Beckman	C09756	CYTOFlex
Glutaraldehyde 25%	Sigma Aldrich	G5882	Or different company
Green fluorescent dye	Sigma Aldrich	S9430	SYBR Green I - 1:10,000 final dilution
Hydrophilic GP filter cartridge - 0.2 µm	Merck	C3235	Sterivex filter
In Situ Chemotaxis Assay (ISCA)	-	-	Contact corresponding authors
Laser cutter	Epilog Laser	Fusion pro 32	Or different company
Luria Bertani Broth	Sigma Aldrich	L3022	Or different company
Marine Broth 2216	VWR	90004-006	Difco
Nylon slotted flat head screws	McMaster-Carr	92929A243	M 2 × 4 × 8 mm
Pipette set	Fisher Scientific	05-403-151	Or different company
Pipette tips - 1 mL	Fisher Scientific	21-236-2A	Or different company
Pipette tips - 20 µL	Fisher Scientific	21-236-4	Or different company
Pipette tips - 200 µL	Fisher Scientific	21-236-1	Or different company
Sea salt	Sigma Aldrich	S9883	For artificial seawater
Serological pipette - 50 mL	Sigma Aldrich	SIAL1490-100EA	Or different company
Syringe filter - 0.02 µm	Whatman	WHA68091002	Anatop filter
Syringe filter - 0.2 µm	Fisher Scientific	10695211	Or different company
Syringe needle 27G	Henke Sass Wolf	4710004020	0.4 × 12 mm
Syringes - 1 mL	Codau	329650	Insulin Luer U-100
Syringes - 10 mL	BD	303134	Or different company
Syringes - 50 mL	BD	15899152	Or different company
Tube rack - 15 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Tube rack - 50 mL	Thomas Scientific	1159V80	Or different company
Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap	McMaster-Carr	8305A77	Or different company
Vacuum filter - 0.2 µm	Merck	SCGPS05RE	Steritop filter