磁性、声学和光学三响应性微泡，用于磁性高温和波托托热组合癌症治疗

摘要

这里介绍了一个协议，通过自组装，协同磁性，声学和光学响应性在一个纳米治疗平台的磁性高温和光热组合癌症治疗制造氧化铁纳米粒子壳微泡（NSMs）。

摘要

抗癌剂的精确输送，旨在有针对性和深度渗透的分娩，以及在肿瘤部位的对照释放，已受到挑战。在这里，我们通过自组装、协同磁性、声学和光学响应性，在一个纳米治疗平台上制造氧化铁纳米粒子壳化微泡 （NSM）。氧化铁纳米粒子既可用作磁性剂，又可用作光热剂。静脉注射后，NSM可磁性引导至肿瘤位点。超声波触发氧化铁纳米粒子的释放，由于微泡的腔作用，促进纳米粒子深入肿瘤。此后，磁性高温和光热疗法可以在肿瘤上进行合并癌症治疗，这是治疗肿瘤异质性对癌症的抵抗力的一种解决方案。在本协议中，对NSM进行了合成和定性，包括结构、化学、磁性和声学特性。此外，还利用体外细胞培养物对热疗法的抗癌疗效进行了调查。拟议的分娩策略和联合治疗在癌症治疗方面有很大的希望，以提高分娩和抗癌的疗效。

引言

癌症是最致命的疾病之一，每年在全世界造成数百万人死亡和巨大的经济损失^。在诊所，传统的抗癌疗法，如手术切除，放疗和化疗仍然不能提供令人满意的治疗效果^2。这些疗法的局限性是高毒副作用，高复发率和高转移率^3。例如，化疗是遭受化疗药物的低交付效率正是肿瘤部位^4。药物无法深入肿瘤组织跨越生物屏障，包括细胞外基质和高肿瘤间质液压，也是导致疗效低^的原因。此外，肿瘤耐药性通常发生在接受单次化疗治疗的患者^中。因此，发生肿瘤热消融的技术，如光热疗法（PTT）和磁性高温治疗（MHT），已经显示出了降低肿瘤抵抗力的可喜结果，并已在临床试验^7，8，9中出现。

PTT通过光热转换剂在激光能量照射下的作用触发癌细胞的热消融。产生的高温（高于50°C）诱导完整的细胞坏死^10。最近，氧化铁纳米粒子（IONPs）被证明是一种光热转换剂，可以通过近红外（NIR）光¹¹激活。 尽管近红外区域的摩尔吸收系数较低，但IONP是低温（43°C）光热疗法的候选者，这是一种经过改良的疗法，旨在减少热暴露对正常组织造成的损害，并启动肿瘤转移的抗肿瘤免疫力^。PTT的局限性之一是激光的低穿透深度。对于深座肿瘤，交替磁场（AFM）诱导加热的氧化铁纳米粒子，也被称为磁性高温，是PTT^13，14的替代疗法。MHT的主要优点是磁场¹⁵的高渗透率。然而，需要相对较高的IONP浓度仍然是其临床应用的主要劣势。由于循环、积累和渗透等一系列障碍，纳米医学（或纳米粒子）对动物实体肿瘤的输送效率一直为^1-10%。因此，具有高组织渗透能力的受控和有针对性的IONP输送策略对癌症治疗非常感兴趣。

超声介质纳米粒子的输送已经显示出它的能力，以促进纳米粒子深入肿瘤组织，由于现象称为微泡腔^18，19。在本研究中，我们通过在一个纳米治疗平台中自组装、协同磁性、声学和光学响应性来制造离子体壳化微气泡（NSM）。NSM 包含空气核心和氧化铁纳米粒子壳，直径约为 5.4 μm。NSM 可以磁引导到肿瘤位点。然后，IONP 的释放由超声波触发，并伴有微泡空腔和微流。从微流获得的势头有助于离子体渗透到肿瘤组织中。PTT 和 MHT 可以通过 NIR 激光照射或 AFM 应用或两者的组合实现。

研究方案

所有动物实验都是按照OG药物指南批准的动物护理和实验室动物使用指南进行的。这些议定书遵循了OG制药公司实验室动物伦理委员会的准则。

1. 纳米粒子壳微泡 （NSM） 合成

1. 将磁性纳米粒子（Fe₃O_4，氧化铁）分散在电离水中，形成10毫克/mL的库存溶液。
2. 将含有离子溶液的管子放入超声波清洁机中 20 分钟。使用前获取均匀分散的 IONP 解决方案。
3. 添加 150 μL 的去离子水、150 μL 的 10 mM 钠硫酸钠 （SDS） 和 400 μL 的离子体库存溶液，从第 1.1 步开始。在 1.5 mL 离心机管中。
4. 在冰浴中用脚手架修复同质化器。
5. 将混合物的管子放在冰浴中，并将同质化器探针精确定位，以浸入混合物溶液中。
6. 将同质化器速度调整到 20，000 rpm，并打开同质化器 3 分钟。
7. 关闭同质化物，将管子从冰浴中取出。
8. 将管子放在管架上，在室温下稳定12小时。
9. 用磁铁将产生的 NSM 吸附到管壁上，并取出超高分子。然后补充1兆L的新鲜去离子水。
10. 重复洗涤过程三次，并在 1 mL 的新鲜蒸馏水中重新悬挂 NSM。
11. 轻微摇晃后，将 10 μL 的 NSM 悬架转移到干净的玻璃滑梯上。
12. 使用 20 倍放大倍率的荧光显微镜可视化 NSM 形态。确保在随机区域拍照。
13. 使用开放式纳米测量器 1.2 软件从照片中测量 NSM 的直径。至少计算200个微泡。
    1. 单击"文件"和"打开"以选择要处理的图像文件。图像导入后，按"尺子"。绘制一条与标尺长度相同的红线。
    2. 然后按"设置"|"统治者"，并进入统治者的长度。绘制与图像中单个微泡直径相同的长度的线条。完成所有测量，然后单击"报告"| 查看报告"。

2. NSM 的声学响应

1. 用 800 μL 去离子水稀释 200 μL 的 NSM，然后转移到 1.5 mL 离心机管中形成库存溶液。
2. 连接功能发生器、放大器、阻抗匹配和自制聚焦传感器。将传感器放在人工凹陷底部的中心，并将水听器与示波器连接起来，以监测输出超声波强度（图1）。将电离水加入水槽中，让传感器浸入水中。
3. 将功能发生器调整到扫描模式，调整频率范围从 10 kHz 到 900 kHz，并将振幅设置为 20 Vpp（电压峰值峰值）。通过放大器将超声波功率调整到 0.1%。每个周期的持续时间为 4s，时间间隔为 1s。
4. 在管子中准备 1 mL NSM 库存溶液样品，并在自制聚焦传感器顶部用脚手架固定管子。将磁铁连接到管子底部并吸引 NSM。
5. 打开功能发生器和放大器的电源。应用 5 个周期（25 s） 超声波后关闭功能发生器。取下磁铁并收集包含释放的 IONP 的溶液的 1 mL。在离心机管中加入 1 mL 的去离子水。
6. 重复步骤 2.5。直到管子里的 Nsm 完全崩溃
7. 通过电感耦合等离子光学发射光谱 （ICP-OES） 对所有已释放的 ION 进行量化，如前¹³所述。

3. NSM 的光学响应

注:在这项工作中，使用了一个激光系统，包含808纳米激光功率和红外热像仪之前描述的徐^等人。

1. 激光系统制备
   1. 打开激光的电源，让它加热几分钟。将光纤耦合 808 nm 激光二极管固定在反驳支架上。
   2. 通过光纤将激光束引导到样品阶段，并聚焦在样品阶段，通过凸透镜实现 6 mm 光点（直径）。
   3. 使用激光功率计测量功率输出，并将功率调整到 1 W/cm^2。
   4. 修复三脚架上的红外热像仪。打开相机并检查是否工作（例如，监控重点感兴趣的区域 （ROI） 温度）。关闭电源和红外热像仪。
2. 在溶液中进行光热测量
   1. 在 1.5 mL 离心机管中，以不同的 IONP 浓度（1.05 毫克/毫升、1.35 毫克/mL、3.65 毫克/兆升、5 毫克/兆升）准备 1 mL 样品。
   2. 将感兴趣的管子放在激光束的聚焦区域，并记录样品的基线温度。
   3. 打开激光电源和红外热像仪，连续照射样品 10 分钟。同时，实时记录温度。
   4. 经过 10 分钟的辐照后，关闭激光电源和红外热像仪。等待区域温度返回基线。
   5. 重复 3.2.2 到 3.2.4 用于测量其他样品。
      注:在 20 °C 下使用电离水作为光热测量的控制。
3. 培养细胞中的光热测量
   注:Murine乳腺癌细胞（4T1）被选为研究光热治疗的抑制作用的模型。
   1. 用罗斯韦尔公园纪念研究所-1640（RPMI-1640）中等补充10%的胎儿牛血清（FBS）和1%青霉素喂养细胞。将栽培环境设置为 37 °C 和 5% CO_2。
   2. 在T25烧瓶中培养4T1细胞，当达到90%的汇合时，以1:2的比例通过细胞。
      注:亚栽培比例可根据不同实验室的特定细胞条件进行调整。
   3. 删除并丢弃培养介质。用1x PBS溶液冲洗细胞层，去除含有试丁酶抑制剂的残留血清。
   4. 在烧瓶中加入 2 mL 的 Trypsin-EDTA 溶液 （0.25%），用于分离。然后加入3 mL的1640中等和吸气细胞轻轻地管道。
   5. 以 500 x g 收集 5 mL 的电池悬架和离心机，3 分钟。
   6. 取出超高纳坦，加入1 mL的新鲜1640介质，形成细胞悬浮。
   7. 将 100 μL 的电池悬架添加到包含 1 mL 培养介质的共聚焦盘中。确保细胞悬浮浓度为 9 x 10^5/mL，细胞培养共焦盘中的最终细胞浓度为 8.1 x 10^4/mL。
   8. 将接种的细胞培养共聚焦盘放入孵化器中24小时。
   9. 稀释不同浓度（1.05 毫克/mL，1.35 毫克/mL，3.65 毫克/mL，5 毫克/mL）的离子体样品，使 1 mL 溶液与无血清 1640 介质。
   10. 从焦盘中吸气培养介质，并添加准备好的样品溶液。
   11. 打开激光电源。将激光束聚焦在盘的中心，并将输出功率调整到 1 W/cm^2。打开红外热像仪，连续照射焦盘中的细胞 10 分钟。实时记录重点区域的温度。
   12. 关闭激光和红外热像仪。将辐照盘转移到孵化器再持续 24 小时。
   13. 去除并丢弃培养介质，在共焦盘中加入 1 mL 的新鲜培养介质。在菜中加入 5 μL 的钙素-AM 溶液 （1 毫克/兆升）。
   14. 在 37 °C 和 5% CO₂ 下孵育焦盘 15 分钟。用 1x PBS 溶液冲洗细胞层两次。
   15. 通过共聚焦荧光显微镜观察和成像细胞，激发波长为488纳米，发射波长为500-540纳米。
   16. 随机选择共聚焦图像中的 5 个区域，手动计算每个区域的活 4T1 细胞数量。通过比较所有实验组的活细胞数量与对照组，量化 4T1 细胞的生存能力。
       注意:在 20 °C 下使用无血清 1640 介质作为光热测量的控制。使用无激光照射的样品作为细胞生存控制组。
4. 体内光热测量
   1. 准备3只8周大的ICR雄性小鼠，平均体重为25±2克。
   2. 在 20 mL 的去离子水中加入 2 克明胶粉末。将溶液加热到 40 - 50 °C，完全溶解明胶凝胶，形成透明清晰的溶液。
   3. 从 3.4.2 中向解决方案添加 100 毫克离子。
   4. 将凝胶加热到 40 ~ 50 °C，立即将 500 μL 的明胶溶液注入鼠标的右胸垫。
   5. 打开激光电源，将激光束聚焦在兴趣区（小鼠的右胸垫）。将输出功率调整到 1 W/cm^2。 打开红外热像仪，连续照射兴趣区 10 分钟。实时记录感兴趣的区域的温度。
   6. 关闭激光和红外热像仪。
   7. 通过_CO2 窒息和颈椎脱位或经研究所动物研究委员会批准的任何方法对小鼠实施安乐死。

4. 磁性体温过高测量

注:这里利用了吴等人以前描述的磁性高温系统^（21）。

1. 准备磁性高温系统包括交替磁场 （AFM） 发生器和红外热成像摄像机。
   1. 打开冷水机组 10 分钟，然后在中等射频加热机上（即 AFM 发电机）上供电。
   2. 将机器的参数设置为:频率 （f） = 415 kHz，磁场强度 = 1.8 kA/m。
2. 在溶液中的磁性体温过高测量
   1. 在 1.5 mL 离心机管中，以不同的离子浓度（1.05 毫克/mL、1.35 毫克/mL、3.65 毫克/mL、5 毫克/兆升）准备 1 mL 的样品。
   2. 将管子放在水冷磁感应铜线圈的中心。
   3. 打开交替磁场 （AFM） 和红外热像仪。连续诱导样品10分钟，实时记录温度。
      注:摄像机位于样品顶部，提供样品的横截面视图。
   4. 关闭自动对焦和红外热像仪。等待铜线圈的温度回到基线 10 分钟。
      注意:注意高温，避免直接接触手部，等待冷却后再取出样品。
   5. 重复 4.2.2 到 4.2.4 用于测量其他样品。
   6. 关闭中等射频加热机 （AFM） 和冷水机组。
      注:在 20 °C 下使用去离子化水作为磁性体温过高测量的控制。
3. 体内磁性体温过高测量
   1. 准备3只8周大的ICR雄性小鼠，平均体重为25±2克。
   2. 准备 20 mL 的 10% 明胶凝胶，其中含有 5 毫克/mL IONP 溶液。
   3. 将明胶凝胶加热到 40 - 50 °C，立即将 500 μL 的明胶溶液注入动物的右胸垫。
      注:磁诱导体温过高实验使用与体外测试相同的参数在加热机上进行。
   4. 打开交替磁场 （AFM） 和红外热像仪。将小鼠的右胸垫放在水冷磁感应铜线圈的中心。
   5. 打开红外热像仪，连续拍摄 10 分钟的兴趣区域（小鼠的右乳房垫），实时记录兴趣区域的温度。
   6. 感应 10 分钟后关闭机器的电源开关和红外热像仪。等待铜线圈的温度返回基线 10 分钟。
   7. 重复 4.3.4 到 4.3.6 用于测量其他样品。
   8. 关闭中等射频加热机 （AFM） 和冷水机组。
      注意:注意高温，避免直接接触手部，等待冷却后再取出样品。
   9. 通过_CO2 窒息和颈椎脱位或经研究所动物研究委员会批准的任何方法对小鼠实施安乐死。

结果

本研究中使用的三响应纳米粒子壳微泡 （NSM） 是通过搅拌表面活性剂和离子体的混合物而制备的。IONP （50 nm） 在液体和气体核心的接口上自行组装，形成密集的磁壳。NSM 的形态显示在 图 1A 中。结果NSM呈现球形，平均直径为5.41±1.78μm（图1B）。结果表明，NSM的准备工作是成功的。当储存在水中时，微泡保持完好无损超过1年，并在缓冲器和细胞培养介质中稳定至少10天

讨论

在这里，我们提出了一个协议，通过自组装，协同磁性，声学和光学响应性在一个纳米治疗平台制造氧化铁纳米粒子壳微泡（NSM）。IONP 被密集地包装在空气核心周围，形成磁壳，磁壳可以由外部磁场控制以进行瞄准。一旦交付，通过超声波触发器可以实现离子点的释放。释放的 IONP 可以通过 PTT 和 MHT 的 NIR 光和 AFM 激活，也可以同时激活两者的组合。

在整个协议中，NSM的合?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
808 nm laser power	Changchun New Industries Optoelectronics Tech	MDL-F-808-5W-18017023
Calcein-AM	Thermo Fisher SCIENTIFIC	C3099
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000-044
Fluorescence Microscope	Olympus	IX71
Function generator	Keysight	33500B series	20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability
Gelatin gel	Sigma	9000-70-8
Heating machine	Shuangping	SPG-06- II
Homemade focused transducer			Frequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8°
Homogenizer	SCILOGEX	D-160	8000-30000 rpm
Hydrophone	T&C	NH1000
ICR male mice	OG Pharmaceutical. Co. Ltd		8-week-old
Inductively coupled plasma optical emission spectrometry	PerkinElmer
Infrared thermal imaging camera.	FLIR	E50
Iron(II,III) oxide	Alfa Aesar	1317-61-9	50-100nm APS Powder
Laser power meter	Changchun New Industries Optoelectronics Tech
Oscilloscope	Keysight	DSOX3054T	Bandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels
RF Power Amplifier	T&C	AG1020	The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle.
Roswell Park Memorial Institute-1640	KeyGEN BioTECH	KGM31800
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	151-21-3