Магнитные, акустические и оптические тройные микропузырьки для магнитной гипертермии и пототермической комбинированной терапии рака

Резюме

Здесь представлен протокол для изготовления микропузырьков с наночастицами оксида железа (NSM) путем самосборки, синергизирующей магнитной, акустической и оптической реакции в одной нанотерапевтической платформе для магнитной гипертермии и фототермической комбинированной терапии рака.

Аннотация

Точность доставки противораковых агентов, которые нацелены на целенаправленную и глубоко проникающих доставок, а также контролируемое высвобождение в месте опухоли, была поставлена под сомнение. Здесь мы изготавливаем микропузырьки с наночастицами оксида железа (NSM) путем самосборки, синергизирующей магнитной, акустической и оптической реакции на одной нанотерапевтической платформе. Наночастицы оксида железа служат как магнитными, так и фототермическими агентами. После внутривенной инъекции NSM можно магнитно направлять к месту опухоли. Ультразвук запускает высвобождение наночастиц оксида железа, облегчая проникновение наночастиц вглубь опухоли из-за кавитационного эффекта микропузырьков. После этого магнитная гипертермия и фототермическая терапия могут быть выполнены на опухоли для комбинированной терапии рака, решения для резистентности рака из-за гетерогенности опухоли. В этом протоколе был выполнен синтез и характеристика NSM, включая структурные, химические, магнитные и акустические свойства. Кроме того, противораковой эффективность при тепловой терапии исследовали с использованием культур клеток in vitro. Предлагаемая стратегия доставки и комбинированная терапия имеют большие перспективы в лечении рака для улучшения как доставки, так и противоопухолевой эффективности.

Введение

Рак является одним из самых смертоносных заболеваний, вызывая миллионы смертей каждый год во всем мире и огромные экономические потери¹. В клиниках обычные противоопухолевые методы лечения, такие как хирургическая резекция, лучевая терапия и химиотерапия, все еще не могут обеспечить^{удовлетворительную терапевтическую эффективность2.} Ограничениями этих методов лечения являются высокие токсические побочные эффекты, высокая частота рецидивов и высокая частота метастазирования^3. Например, химиотерапия страдает от низкой эффективности доставки химиопрепаратов именно к месту опухоли^4. Неспособность лекарств проникать глубоко в опухолевую ткань через биологические барьеры, включая внеклеточный матрикс и высокое давление опухолевой интерстициальной жидкости, также отвечает за низкую терапевтическую эффективность^5. Кроме того, резистентность опухоли обычно бывает у пациентов, получавших лечение однократной химиотерапией^6. Таким образом, методы, при которых происходит термическая абляция опухоли, такие как фототермическая терапия (PTT) и терапия магнитной гипертермии (MHT), показали многообещающие результаты для снижения резистентности опухоли и появились в клинических испытаниях^7,8,9.

PTT запускает термическую абляцию раковых клеток действием фототермических конверсионных агентов при облучении лазерной энергией. Генерируемая высокая температура (выше 50 °C) вызывает полный некроз клеток^10. Совсем недавно было продемонстрировано, что наночастицы оксида железа (ИОНП) можно считать фототермическим конверсионным агентом, который может быть активирован ближним инфракрасным (NIR) светом^11.  Несмотря на низкий коэффициент молярной абсорбции в ближней инфракрасной области, ИОНП являются кандидатами на низкотемпературную (43 °C) фототермическую терапию, модифицированную терапию для уменьшения повреждений, вызванных тепловым воздействием на нормальные ткани, и для инициирования противоопухоляного иммунитета против метастазирования опухоли^12. Одним из ограничений PTT является низкая глубина проникновения лазера. Для глубоко расположенных опухолей переменным магнитным полем (AFM), индуцированный нагрев наночастиц оксида железа, также называемый магнитной гипертермией, является альтернативной терапией для PTT^13,14. Основным преимуществом МГТ является высокое проникновение магнитного поля^15. Однако требуемая относительно высокая концентрация ИОНП остается основным недостатком для его клинического применения. Эффективность доставки наномедицины (или наночастиц) к солидным опухолям у животных была 1-10% из-за ряда препятствий, включая кровообращение, накопление и проникновение^16,17. Поэтому контролируемая и целенаправленная стратегия доставки ИОНП с возможностью достижения высокого проникновения в ткани представляет большой интерес в лечении рака.

Ультразвуковая опосредоваемая доставка наночастиц показала свою способность облегчать проникновение наночастиц вглубь опухолевой ткани, благодаря явлению, называемому микросубблированной кавитацией^18,19. В настоящем исследовании мы изготавливаем микропузырьки с оболочкой IONP (NSM) путем самосборки, синергизирующей магнитной, акустической и оптической реакции на одной нанотерапевтической платформе. NSM содержит воздушное ядро и оболочку из наночастиц оксида железа диаметром около 5,4 мкм. NSM могут быть магнитно направлены к месту опухоли. Затем высвобождение ИОНП запускается ультразвуком, сопровождающимся кавитацией микробубблинга и микропотоком. Импульс, полученный от микропотока, облегчает проникновение ИОНП в опухолевую ткань. PTT и MHT могут быть достигнуты путем лазерного облучения NIR или применения AFM, или с комбинацией обоих.

протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными фармацевтическими руководящими принципами OG по уходу за животными и использованию лабораторных животных. Протоколы соответствовали руководящим принципам Комитета по этике для лабораторных животных OG Pharmaceutical.

1. Синтез микропузырьков с наночастицами (NSM)

1. Диспергировать магнитные наночастицы (Fe₃O_4,оксид железа) в деионизированной воде с образованием стокового раствора 10 мг/мл.
2. Поместите трубку, содержащую раствор ИОНП, в ультразвуковую очистительный аппарат на 20 мин. Получают равномерно диспергированный раствор ИОНП перед использованием.
3. Добавьте 150 мкл деионизированной воды, 150 мкл 10 мМ додецилсульфата натрия (SDS) и 400 мкл запасного раствора ИОНП со этапа 1.1. в центрифужной трубке 1,5 мл.
4. Закрепите гомогенизатор каркасом в ледяной ванне.
5. Поместите трубку смеси в ледяную ванну и поместите зонд гомогенизатора точно для погружения в раствор смеси.
6. Отрегулируйте скорость гомогенизатора до 20 000 об/мин и включите гомогенизатор на 3 мин.
7. Выключите гомогенизатор и извлеките трубку из ледяной ванны.
8. Поместите трубку в стойку для труб на 12-ч стабилизацию при комнатной температуре.
9. Адсорбировать полученную NSM к стенке трубки магнитом и удалить супернатант. Затем пополняют 1 мл свежей деионизированной воды.
10. Повторите процесс промывки три раза и повторно суспендировать NSM в 1 мл пресной дистиллированной воды.
11. Переложите 10 мкл суспензии NSM на чистый стеклянный слайд после легкого встряхивания.
12. Используйте флуоресцентный микроскоп с 20-кратным увеличением для визуализации морфологии NSM. Убедитесь, что фотографии в случайной области.
13. Измерьте диаметр NSM по фотографиям с помощью программного обеспечения Nano Measurer 1.2 открытого доступа. Насчитайте не менее 200 микропузырьков.
    1. Нажмите«Файл»и«Открыть»,чтобы выбрать файл изображения для обработки. После импорта изображения нажмите кнопку"линейка". Нарисуйте красную линию той же длины, что и линейка.
    2. Затем нажмите "Настройки" | «Линейка»и введите длину линейки. Рисуйте линии той же длины, что и диаметры отдельных микропузырьков на изображении. Завершите все измерения, затем нажмите«Отчет» |» Посмотреть отчет».

2. Акустическая реакция НССМ

1. Разбавить 200 мкл NSM деионизированной водой 800 мкл, затем переложить в центрифужную трубку 1,5 мл с образованием запасного раствора.
2. Подключите генератор функций, усилитель, согласование импеданса и самодельный фокусированный преобразователь. Поместите преобразователь в центр в нижней части искусственной кубовидной раковины и подключите гидрофон с осциллографом для контроля выходной интенсивности ультразвука(рисунок 1). Добавьте деионизированную воду в раковину, чтобы погрузить датчик.
3. Отрегулируйте генератор функций в режим развертки, настройте диапазон частот от 10 кГц до 900 кГц и установите амплитуду на 20 Вpp (напряжение пик-пик). Отрегулируйте мощность ультразвука до 0,1% усилителем. Продолжительность каждого цикла составляет 4 с интервалом времени 1 с.
4. Подготовьте 1 мл образцов раствора NSM в трубке и закрепите трубку каркасом на верхней части самодельного сфокусированного преобразователя. Прикрепите магнит к нижней части трубки и притяните NSM.
5. Включите питание генератора функций и усилителя. Выключите функцию генератора после применения 5 циклов (25 с) ультразвука. Извлеките магнит и соберите 1 мл раствора, содержащего высвобленные ИОНЫ. Добавьте 1 мл деионизированной воды в трубку центрифуги.
6. Повторите шаг 2.5. до тех пор, пока НМЭ в трубке не разрушатся полностью.
7. Количественно оценить все высвобождаемые ИОНП с помощью спектрометрии оптической эмиссии с индуктивно связанной плазмой (ICP-OES), как описано^{ранее 13.}

3. Оптический отклик нмагности

ПРИМЕЧАНИЕ: В этой работе используется лазерная система, содержащая лазерную мощность 808 нм и инфракрасную тепловизионную камеру, ранее описанную Xu et al.²⁰.

1. Подготовка лазерной системы
   1. Включите блок питания лазера и дайте ему нагреться в течение нескольких минут. Закрепите 808-нм лазерный диод с волоконной связью на ретортной подставке.
   2. Направьте лазерный луч на стадию образца через оптическое волокно и сосредоточьтесь на стадии образца, чтобы достичь светового пятна (в диаметре) 6 мм с помощью выпуклой линзы.
   3. Измерьте выходную мощность с помощью лазерного измерителямощности и отрегулируйте мощность до 1 Вт/см2.
   4. Закрепите инфракрасную тепловизионную камеру на штативе. Включите камеру и проверьте, работает ли она (например, следите за температурой интересуемой области фокусировки (ROI). Выключите блок питания и инфракрасную тепловизионную камеру.
2. Фототермическое измерение в водном растворе
   1. Подготовьте образец 1 мл при различной концентрации ИОНС (1,05 мг/мл, 1,35 мг/мл, 3,65 мг/мл, 5 мг/мл) в центрифужной пробирке 1,5 мл.
   2. Поместите интересующей трубки в сфокусированную область лазерного луча и запишите базовую температуру образца.
   3. Включите лазерную и инфракрасную тепловизионную камеру и непрерывно облучите образец в течение 10 минут. При этом записывайте температуру в режиме реального времени.
   4. Выключите лазерную и инфракрасную тепловизионную камеру после 10 минут облучения. Дождитесь возвращения температуры региона к исходному уровню.
   5. Повторите 3.2.2-3.2.4 для измерения других образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте деионизированную воду при 20 °C в качестве контроля для фототермического измерения.
3. Фототермическое измерение в культивированных клетках
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышиные клетки рака молочной железы (4T1) были выбраны в качестве модели для исследования эффекта ингибирования при фототермическом лечении.
   1. Кормите клетки средой Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640), дополненной 10% фетальной бычий сывороткой (FBS) и 1% пенициллином. Установите среду культивирования как 37 ° C и 5% CO₂.
   2. Культивируем клетки 4T1 в колбах T25 и пропускаем клетки в соотношении 1:2 при достижении 90% слияния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение субкультур может быть скорректировано в соответствии с конкретными условиями клеток в разных лабораториях.
   3. Удалите и выбросьте культурную среду. Промыть клеточный слой 1x раствором PBS для удаления остаточной сыворотки, содержащей ингибитор трипсина.
   4. Добавьте 2 мл раствора Трипсина-ЭДТА (0,25%) в колбу для отслоения. Затем добавляют 3 мл 1640 средних и аспирируют клетки путем осторожного пипетирования.
   5. Собрать 5 мл клеточной суспензии и центрифуги при 500 х г в течение 3 мин.
   6. Удалите надводное вещество и добавьте 1 мл свежей среды 1640 с образованием клеточной суспензии.
   7. Добавьте 100 мкл клеточной суспензии в конфокальную чашку, содержащую 1 мл питательной среды. Убедитесь, что концентрация клеточной суспензии составляет 9^{х 10 5}/мл, а конечная концентрация клеток в конфокальной чашке клеточной культуры составляет 8,1 х 10⁴/мл.
   8. Поместите инокулированную клеточную культуру конфокальной чашки в инкубатор на 24 ч.
   9. Разбавить различную концентрацию (1,05 мг/мл, 1,35 мг/мл, 3,65 мг/мл, 5 мг/мл) образца ИОНС, чтобы получить 1 мл раствора с безсыворочной средой 1640.
   10. Аспирировать культуральную среду из конфокальной посуды и добавить приготовленный образец раствора.
   11. Включите питание лазера. Сфокусируйте лазерный луч в центре тарелки иотрегулируйте выходную мощность до 1 Вт/см2. Включите инфракрасную тепловизионную камеру, облучите клетки в конфокальной чашке в течение 10 минут непрерывно. Запишите температуру в режиме реального времени для сфокусированной области.
   12. Выключите лазерную и инфракрасную тепловизионную камеру. Переложите облученное блюдо в инкубатор еще на 24 ч.
   13. Выньте и выбросьте культуральную среду, добавьте в конфокальную посуду 1 мл свежей питательной среды. Добавьте в блюдо 5 мкл раствора Кальцеин-АМ (1 мг/мл).
   14. Инкубировать конфокальную посуду при 37 °C и 5% CO₂ в течение 15 мин. Дважды промойте слой ячеек 1x раствором PBS.
   15. Наблюдайте и изображайте клетки с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа с длиной волны возбуждения 488 нм и длиной волны излучения 500-540 нм.
   16. Выберите 5 областей на конфокальных изображениях случайным образом и подсчитайте количество живых ячеек 4T1 в каждой области вручную. Количественно оценить жизнеспособность клеток 4T1 путем сравнения количества живых клеток во всех экспериментальных группах с контрольной группой.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте безымятинную среду 1640 при 20 °C в качестве контроля для фототермической меры. Используйте образец без лазерного облучения в качестве контрольной группы жизнеспособности клеток.
4. Фототермическое измерение in vivo
   1. Приготовьте 3 из 8-недельных самцов мышей ICR со средним весом 25 ± 2 г.
   2. Добавьте 2 г желатинового порошка в 20 мл деионизированной воды. Нагреть раствор до 40 - 50 °C, полностью растворить желатиновый гель до образования прозрачного и прозрачного раствора.
   3. Добавляют 100 мг ИОНП в раствор из 3,4,2.
   4. Нагреть гель до 40 – 50 °C, немедленно ввести 500 мкл раствора желатина в правую нагрудную подушку мыши.
   5. Включите мощность лазера и сфокусировать лазерный луч на интересующей области (правая нагрудная подушка мышей). Отрегулируйте выходную мощность до 1 Вт/см2. Включите инфракрасную тепловизионную камеру, облучите интересуемую область в течение 10 минут непрерывно. Запишите температуру интересуемого региона в режиме реального времени.
   6. Выключите лазерную и инфракрасную тепловизионную камеру.
   7. Усыпление мышей путем удушья_CO2 и вывиха шейного позвонка или любого метода, одобренного комитетом по исследованиям животных Института.

4. Измерение магнитной гипертермии

ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь используется система магнитной гипертермии, ранее описанная Wu et al. ^(21).

1. Подготовьте магнитную гипертермию, включающую генератор переменного магнитного поля (AFM) и инфракрасную тепловизионную камеру.
   1. Включите чиллер на 10 минут, а затем включите аппарат умеренного радиочастотного нагрева (т. Е. Генератор AFM).
   2. Задайте параметры машины следующим образом: частота (f) = 415 кГц, напряженность магнитного поля = 1,8 кА/м.
2. Измерение магнитной гипертермии в водном растворе
   1. Подготовьте 1 мл образца при различной концентрации ИОНП (1,05 мг/мл, 1,35 мг/мл, 3,65 мг/мл, 5 мг/мл) в центрифужной пробирке 1,5 мл.
   2. Поместите трубку в центр магнитной индукционной медной катушки с водяным охлаждением.
   3. Включите переменное магнитное поле (AFM) и инфракрасную тепловизионную камеру. Индуцировать образец в течение 10 мин непрерывно и записывать температуру в режиме реального времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Камера расположена в верхней части образца, что обеспечивают поперечное сечение образца.
   4. Выключите AFM и инфракрасную тепловизионную камеру. Подождите, пока температура медной катушки вернется к исходному уровню в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с высокой температурой, избегайте прямого контакта с руками и дождитесь охлаждения, прежде чем удалять образцы.
   5. Повторите 4.2.2-4.2.4 для измерения других образцов.
   6. Выключите аппарат умеренного радиочастотного нагрева (AFM) и чиллер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте деионизированную воду при 20 °C в качестве контроля для измерения магнитной гипертермии.
3. Измерение магнитной гипертермии in vivo
   1. Приготовьте 3 из 8-недельных самцов мышей ICR со средним весом 25 ± 2 г.
   2. Приготовьте 20 мл 10 % желатинового геля, содержащего 5 мг/мл раствора ИОНП.
   3. Нагреть желатиновый гель до 40 - 50 °C, немедленно ввести 500 мкл желатинового раствора в правую подушечку груди животного.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты с магнитно-индуцированной гипертермией проводились с нагревательной машиной с использованием тех же параметров, что и тест in vitro.
   4. Включите переменное магнитное поле (AFM) и инфракрасную тепловизионную камеру. Поместите правую нагрудную подушку мышей в центр охлаждаемой водой магнитной индукционной медной катушки.
   5. Включите инфракрасную тепловизионную камеру, визуалите область интереса (правую грудную подушечку мышей) в течение 10 минут непрерывно и записывайте температуру интересуемой области в режиме реального времени.
   6. Выключите выключатель питания машины и инфракрасной тепловизионной камеры через 10 минут индукции. Дождитесь возвращения температуры медной катушки к исходному уровню в течение 10 минут.
   7. Повторите 4.3.4-4.3.6 для измерения других образцов.
   8. Выключите аппарат умеренного радиочастотного нагрева (AFM) и чиллер.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с высокой температурой, избегайте прямого контакта с руками и дождитесь охлаждения, прежде чем удалять образцы.
   9. Усыпление мышей путем удушья_CO2 и вывиха шейного позвонка или любого метода, одобренного комитетом по исследованиям животных Института.

Результаты

Микропузырьки с тройной реакцией с наночастицей (NSM), используемые в этом исследовании, были получены путем перемешивания смеси поверхностно-активного вещества и ИОНП. ИОНП (50 нм) самособираются на границе раздела жидкого и газового сердечника, образуя плотно упакованную магнитную обо?...

Обсуждение

Здесь мы представили протокол изготовления микропузырьков с наночастицами оксида железа (NSM) путем самосборки, синергизирующей магнитной, акустической и оптической реакции на одной нанотерапевтической платформе. ИОНП были плотно упакованы вокруг воздушного ядра, образуя магнитную о?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
808 nm laser power	Changchun New Industries Optoelectronics Tech	MDL-F-808-5W-18017023
Calcein-AM	Thermo Fisher SCIENTIFIC	C3099
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000-044
Fluorescence Microscope	Olympus	IX71
Function generator	Keysight	33500B series	20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability
Gelatin gel	Sigma	9000-70-8
Heating machine	Shuangping	SPG-06- II
Homemade focused transducer			Frequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8°
Homogenizer	SCILOGEX	D-160	8000-30000 rpm
Hydrophone	T&C	NH1000
ICR male mice	OG Pharmaceutical. Co. Ltd		8-week-old
Inductively coupled plasma optical emission spectrometry	PerkinElmer
Infrared thermal imaging camera.	FLIR	E50
Iron(II,III) oxide	Alfa Aesar	1317-61-9	50-100nm APS Powder
Laser power meter	Changchun New Industries Optoelectronics Tech
Oscilloscope	Keysight	DSOX3054T	Bandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels
RF Power Amplifier	T&C	AG1020	The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle.
Roswell Park Memorial Institute-1640	KeyGEN BioTECH	KGM31800
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	151-21-3