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  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Présenté ici est un protocole pour la fabrication de microbulles à coquille de nanoparticules d’oxyde de fer (NSM) par auto-assemblage, synergie magnétique, acoustique et réactivité optique dans une plate-forme nanothérapeutique pour l’hyperthermie magnétique et la thérapie du cancer combinée photothermique.

Résumé

L’administration précise d’agents anticancéreux qui visent un accouchement ciblé et pénétré en profondeur ainsi qu’une libération contrôlée sur le site tumoral a été remise en question. Ici, nous fabriquons des microbulles à enveloppe de nanoparticules d’oxyde de fer (NSM) grâce à l’auto-assemblage, à la synergie magnétique, acoustique et réactive optique dans une plate-forme nanothérapeutique. Les nanoparticules d’oxyde de fer servent à la fois d’agents magnétiques et photothermiques. Une fois injectés par voie intraveineuse, les NSM peuvent être guidés magnétiquement vers le site tumoral. Les ultrasons déclenchent la libération de nanoparticules d’oxyde de fer, facilitant la pénétration des nanoparticules profondément dans la tumeur en raison de l’effet de cavitation des microbulles. Par la suite, l’hyperthermie magnétique et la thérapie photothermique peuvent être effectuées sur la tumeur pour le traitement combiné du cancer, une solution pour la résistance au cancer en raison de l’hétérogénéité tumorale. Dans ce protocole, la synthèse et la caractérisation des NSM, y compris les propriétés structurelles, chimiques, magnétiques et acoustiques, ont été effectuées. En outre, l’efficacité anticancéreuse par thérapie thermique a été étudiée à l’aide de cultures cellulaires in vitro. La stratégie d’administration proposée et la thérapie combinée sont très prometteuses dans le traitement du cancer pour améliorer l’efficacité de l’administration et de l’anticancéreux.

Introduction

Le cancer est l’une des maladies les plus mortelles, causant des millions de décès chaque année dans le monde et d’énormes pertes économiques1. Dans les cliniques, les thérapies anticancéreuses conventionnelles, telles que la résection chirurgicale, la radiothérapie et la chimiothérapie, ne peuvent toujours pas fournir une efficacité thérapeutique satisfaisante2. Les limites de ces thérapies sont des effets secondaires toxiques élevés, un taux de récidive élevé et un taux de métastases élevé3. Par exemple, la chimiothérapie est subie de la faible efficacité d’administration des médicaments de chimiothérapie précisément au sitetumoral 4. L’incapacité des médicaments à pénétrer profondément dans le tissu tumoral à travers les barrières biologiques, y compris la matrice extracellulaire et la pression élevée du liquide interstitiel tumoral, est également responsable de la faible efficacité thérapeutique5. En outre, la résistance tumorale se produit généralement chez les patients qui ont reçu un traitement par chimiothérapie unique6. Par conséquent, les techniques où l’ablation thermique de la tumeur se produit, telles que la thérapie photothermique (PTT) et la thérapie d’hyperthermie magnétique (MHT), ont montré des résultats prometteurs pour réduire la résistance tumorale et ont émergé dans les essais cliniques7,8,9.

Les PTT déclenchent l’ablation thermique des cellules cancéreuses par l’action d’agents de conversion photothermiques sous l’irradiation de l’énergie laser. La température élevée générée (supérieure à 50 °C) induit une nécrose cellulaire complète10. Très récemment, il a été démontré que les nanoparticules d’oxyde de fer (IRP) sont un agent de conversion photothermique pouvant être activé par la lumière proche infrarouge (NIR)11.  Malgré le faible coefficient d’absorption molaire dans la région proche infrarouge, les IONP sont candidats à la thérapie photothermique à basse température (43 °C), une thérapie modifiée pour réduire les dommages causés par l’exposition à la chaleur des tissus normaux et pour initier une immunité antitumorale contre les métastases tumorales12. L’une des limites du PTT est la faible profondeur de pénétration du laser. Pour les tumeurs profondes, le chauffage induit par le champ magnétique alternatif (AFM) des nanoparticules d’oxyde de fer, également appelé hyperthermie magnétique, est une thérapie alternative pour PTT13,14. Le principal avantage de MHT est la forte pénétration du champ magnétique15. Cependant, la concentration relativement élevée requise d’IRP reste un inconvénient majeur pour son application clinique. L’efficacité de la nanomédecine (ou nanoparticules) aux tumeurs solides chez les animaux a été de 1 à 10% en raison d’une série d’obstacles, notamment la circulation, l’accumulation et la pénétration16,17. Par conséquent, une stratégie d’administration contrôlée et ciblée des ITP avec la capacité d’atteindre une pénétration tissulaire élevée est d’un grand intérêt dans le traitement du cancer.

L’administration de nanoparticules médiées par ultrasons a montré sa capacité à faciliter la pénétration des nanoparticules profondément dans le tissu tumoral, en raison du phénomène appelé cavitation des microbulles18,19. Dans la présente étude, nous fabriquons des microbulles à coque d’IOP (NSM) grâce à l’auto-assemblage, à la synergie de la réactivité magnétique, acoustique et optique dans une plate-forme nanothérapeutique. Le NSM contient un noyau d’air et une coquille de nanoparticules d’oxyde de fer, d’un diamètre d’environ 5,4 μm. Les NSM peuvent être guidés magnétiquement vers le site de la tumeur. Ensuite, la libération d’IONPs est déclenchée par ultrasons, accompagnée d’une cavitation de microbulles et d’un microstreaming. L’élan reçu du microstreaming facilite la pénétration des ITP dans le tissu tumoral. Le PTT et le MHT peuvent être obtenus par irradiation laser NIR ou application AFM, ou avec la combinaison des deux.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par les lignes directrices d’OG Pharmaceutical pour les soins aux animaux et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les protocoles suivaient les directives du comité d’éthique pour les animaux de laboratoire d’OG Pharmaceutical.

1. Synthèse de microbulles à coque de nanoparticules (NSM)

  1. Disperser des nanoparticules magnétiques (Fe3O4,oxyde de fer) dans de l’eau désionisée pour former une solution type de 10 mg/mL.
  2. Placez le tube contenant la solution d’IONPs dans une machine de nettoyage à ultrasons pendant 20 min. Obtenir une solution d’ITP uniformément dispersée avant utilisation.
  3. Ajouter 150 μL d’eau désionisée, 150 μL de dodécylsulfate de sodium (FDS) de 10 mM et 400 μL d’une solution mère d’IONP de l’étape 1.1. dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
  4. Fixez l’homogénéisateur avec un échafaudage dans un bain de glace.
  5. Placez le tube du mélange dans un bain de glace et positionnez la sonde d’homogénéisateur précisément pour être immergée dans la solution du mélange.
  6. Réglez la vitesse de l’homogénéisateur à 20 000 tr/min et allumez l’homogénéisateur pendant 3 minutes.
  7. Éteignez l’homogénéisateur et retirez le tube du bain de glace.
  8. Placez le tube sur le rack à tubes pour une stabilisation de 12 h à température ambiante.
  9. Adsorbez les NSM résultants sur la paroi du tube par un aimant et retirez le surnageant. Ensuite, reconstituez-vous avec 1 mL d’eau fraîche désionisée.
  10. Répétez le processus de lavage trois fois et re-suspendez les NSM dans 1 mL d’eau distillée fraîche.
  11. Transférer 10 μL de suspension de NSM sur une lame de verre propre après avoir légèrement secoué.
  12. Utilisez un microscope à fluorescence à un grossissement de 20x pour visualiser la morphologie des NSM. Assurez-vous de prendre des photos au hasard.
  13. Mesurez le diamètre des NSM à partir des photos à l’aide d’un logiciel Nano Measurer 1.2 en libre accès. Comptez au moins 200 microbulles.
    1. Cliquez sur "Fichier" et "Ouvrir" pour sélectionner le fichier image à traiter. Une fois l’image importée, appuyez surlarègle " . Tracez une ligne rouge de la même longueur que la règle.
    2. Appuyez ensuite sur "Paramètres" | «Règle" et entrez la longueur de la règle. Tracez des lignes de la même longueur que les diamètres des microbulles individuelles de l’image. Complétez toutes les mesures, puis cliquez sur "Rapport" | » Voir le rapport« .

2. Réponse acoustique des NSM

  1. Diluer 200 μL de NSM avec 800 μL d’eau désionisée, puis transférer dans un tube centrifuge de 1,5 mL pour former une solution mère.
  2. Connectez le générateur de fonctions, l’amplificateur, la correspondance d’impédance et le transducteur focalé fait maison. Placez le transducteur au centre au fond de l’évier cuboïde artificiel et connectez l’hydrophone à un oscilloscope pour surveiller l’intensité des ultrasons de sortie (Figure 1). Ajouter de l’eau désionisée dans l’évier pour immerger le transducteur.
  3. Réglez le générateur de fonctions sur le mode balayage, réglez la plage de fréquences de 10 kHz à 900 kHz et réglez l’amplitude sur 20 Vpp (crête de tension). Ajustez la puissance des ultrasons à 0,1% par l’amplificateur. La durée de chaque cycle est de 4 s avec un intervalle de temps de 1 s.
  4. Préparez des échantillons de solution mère de 1 mL NSM dans le tube et fixez le tube avec un échafaudage sur le dessus du transducteur focalé fait maison. Fixez l’aimant au fond du tube et attirez les NSM.
  5. Allumez la puissance du générateur de fonctions et de l’amplificateur. Éteignez le générateur de fonction après l’application de 5 cycles (25 s) d’ultrasons. Retirez l’aimant et collectez 1 mL de la solution contenant les IONP libérés. Ajouter 1 mL d’eau désionisée dans le tube de centrifugeuse.
  6. Répétez l’étape 2.5. jusqu’à ce que les NSM dans le tube s’effondrent complètement.
  7. Quantifier tous les IOP libérés par spectrométrie d’émission optique à plasma à couplage inductif (ICP-OES) comme décrit précédemment13.

3. Réponse optique des NSM

REMARQUE: Dans ce travail, un système laser contenant une puissance laser de 808 nm et une caméra thermique infrarouge précédemment décrite par Xu et al. est utilisé20.

  1. Préparation du système laser
    1. Allumez l’alimentation du laser et laissez-le se réchauffer pendant plusieurs minutes. Fixez une diode laser 808 nm couplée à une fibre sur un support d’atteau.
    2. Dirigez le faisceau laser vers l’étage d’échantillonnage à travers une fibre optique et concentrez-vous sur l’étage d’échantillonnage pour obtenir une tache lumineuse de 6 mm (en diamètre) par une lentille convexe.
    3. Mesurez la puissance de sortie avec un capteur de puissance laser et ajustez la puissance à 1 W/cm2.
    4. Fixez la caméra thermique infrarouge sur le trépied. Allumez l’appareil photo et vérifiez si elle fonctionne (par exemple, surveillez la température de la région d’intérêt focalisation (ROI)). Éteignez l’alimentation et la caméra thermique infrarouge.
  2. Mesure photothermique en solution aqueuse
    1. Préparer l’échantillon de 1 mL à différentes concentrations d’IONP (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) dans un tube centrifuge de 1,5 mL.
    2. Placez le tube d’intérêt dans la région focalise du faisceau laser et enregistrez la température de base de l’échantillon.
    3. Allumez l’alimentation laser et la caméra thermique infrarouge et irradiez l’échantillon pendant 10 minutes en continu. Dans le même temps, enregistrez la température en temps réel.
    4. Éteignez l’alimentation laser et la caméra thermique infrarouge après 10 minutes d’irradiation. Attendez que la température de la région revienne à la ligne de base.
    5. Répétez les 3.2.2 à 3.2.4 pour la mesure d’autres échantillons.
      REMARQUE: Utilisez de l’eau désionisée à 20 ° C comme contrôle pour la mesure photothermique.
  3. Mesure photothermique dans des cellules cultivées
    REMARQUE: Les cellules cancéreuses du sein murin (4T1) ont été sélectionnées comme modèle pour étudier l’effet d’inhibition par traitement photothermique.
    1. Nourrissez les cellules avec le milieu Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS) et 1% de pénicilline. Réglez l’environnement de culture à 37 °C et 5 % de CO2.
    2. Culture de cellules 4T1 dans des flacons de T25 et passage des cellules dans un rapport de 1:2 lorsque la confluence de 90% est atteinte.
      REMARQUE: Le ratio de sous-culture peut être ajusté en fonction des conditions cellulaires spécifiques dans différents laboratoires.
    3. Retirez et jetez le milieu de culture. Rincez la couche cellulaire avec 1x solution de PBS pour éliminer le sérum résiduel contenant un inhibiteur de la trypsine.
    4. Ajouter 2 mL de solution de trypsine-EDTA (0,25 %) à la fiole pour le détachement. Ajoutez ensuite 3 mL de milieu 1640 et aspirez les cellules en pipetant doucement.
    5. Prélever 5 mL de la suspension cellulaire et centrifuger à 500 x g pendant 3 min.
    6. Retirez le surnageant et ajoutez 1 mL de milieu frais 1640 pour former une suspension cellulaire.
    7. Ajouter 100 μL de la suspension cellulaire dans une boîte confocale contenant 1 mL du milieu de culture. Assurez-vous que la concentration de la suspension cellulaire est de 9 x10 5/mL et que la concentration cellulaire finale dans la boîte confocale de culture cellulaire est de 8,1 x 104/mL.
    8. Placez la boîte confocale de culture cellulaire inoculée dans un incubateur pendant 24 h.
    9. Diluer différentes concentrations (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) de l’échantillon d’ITP pour en faire une solution de 1 mL avec un milieu 1640 sans sérum.
    10. Aspirer le milieu de culture du plat confocal et ajouter la solution d’échantillon préparée.
    11. Allumez l’alimentation laser. Focalisation du faisceau laser au centre de la parabole et réglage de la puissance de sortie à 1 W/cm2. Allumez la caméra thermique infrarouge, irradiez les cellules de la parabole confocale pendant 10 minutes en continu. Enregistrez la température en temps réel pour la région ciblée.
    12. Éteignez le laser et la caméra thermique infrarouge. Transférer le plat irradié dans l’incubateur pendant encore 24 heures.
    13. Retirer et jeter le milieu de culture, ajouter 1 mL du milieu de culture frais dans le plat confocal. Ajouter 5 μL de solution de calcéine-AM (1 mg/mL) dans le plat.
    14. Incuber le plat confocal à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 15 min. Rincez la couche cellulaire avec 1x solution pbS deux fois.
    15. Observez et imagez les cellules à l’aune d’un microscope à fluorescence confocale avec une longueur d’onde d’excitation de 488 nm et une longueur d’onde d’émission de 500-540 nm.
    16. Choisissez 5 zones dans les images confocales au hasard et comptez manuellement le nombre de cellules 4T1 vivantes dans chaque zone. Quantifier la viabilité des cellules 4T1 en comparant le nombre de cellules vivantes dans tous les groupes expérimentaux avec le groupe témoin.
      REMARQUE: Utilisez le milieu 1640 sans sérum à 20 ° C comme contrôle pour la mesure photothermique. Utilisez l’échantillon sans irradiation laser comme groupe témoin de la viabilité cellulaire.
  4. Mesure photothermique in vivo
    1. Préparez 3 des souris mâles ICR âgées de 8 semaines d’un poids moyen de 25 ± 2 g.
    2. Ajouter 2 g de poudre de gélatine à 20 mL d’eau désionisée. Chauffer la solution à 40 - 50 °C, dissoudre complètement le gel de gélatine pour former une solution transparente et limpides.
    3. Ajouter 100 mg d’IONP à la solution à partir du 3.4.2.
    4. Chauffer le gel à 40 – 50 °C, injecter immédiatement 500 μL de la solution de gélatine dans le coussinet mammaire droit de la souris.
    5. Allumez la puissance laser et concentrez le faisceau laser sur la région d’intérêt (coussinet mammaire droit des souris). Réglez la puissance de sortie à 1 W/cm2. Allumez la caméra thermique infrarouge, irradiez la région d’intérêt pendant 10 minutes en continu. Enregistrez la température de la région d’intérêt en temps réel.
    6. Éteignez le laser et la caméra thermique infrarouge.
    7. Euthanasier des souris par asphyxie au CO2 et luxation des vertèbres cervicales ou toute autre méthode approuvée par le comité de recherche animale de l’Institut.

4. Mesure de l’hyperthermie magnétique

REMARQUE: Ici, un système d’hyperthermie magnétique précédemment décrit par Wu et al. est utilisé (21).

  1. Préparez un système d’hyperthermie magnétique avec un générateur de champ magnétique alternatif (AFM) et une caméra thermique infrarouge.
    1. Allumez le refroidisseur pendant 10 minutes, puis mettez sous tension la machine de chauffage par radiofréquence modérée (c.-à-d. générateur AFM).
    2. Réglez les paramètres de la machine comme suit : fréquence (f) = 415 kHz, intensité du champ magnétique = 1,8 kA/m.
  2. Mesure de l’hyperthermie magnétique en solution aqueuse
    1. Préparer 1 mL de l’échantillon à différentes concentrations d’IONPs (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
    2. Placez le tube au centre d’une bobine de cuivre à induction magnétique refroidie à l’eau.
    3. Allumez le champ magnétique alternatif (AFM) et la caméra thermique infrarouge. Induisez l’échantillon pendant 10 min en continu et enregistrez la température en temps réel.
      REMARQUE: La caméra est située en haut de l’échantillon, fournissant une vue en coupe transversale de l’échantillon.
    4. Éteignez l’AFM et la caméra thermique infrarouge. Attendez que la température de la bobine de cuivre revienne à la ligne de base pendant 10 min.
      REMARQUE: Faites attention aux températures élevées, évitez le contact direct avec les mains et attendez le refroidissement avant de prélever les échantillons.
    5. Répéter les 4.2.2 à 4.2.4 pour la mesure des autres échantillons.
    6. Éteignez la machine de chauffage par radiofréquence modérée (AFM) et le refroidisseur.
      REMARQUE: Utilisez l’eau désionisée à 20 ° C comme contrôle pour la mesure de l’hyperthermie magnétique.
  3. Mesure de l’hyperthermie magnétique in vivo
    1. Préparez 3 des souris mâles ICR âgées de 8 semaines d’un poids moyen de 25 ± 2 g.
    2. Préparer 20 mL de gel de gélatine à 10 % contenant 5 mg/mL de solution d’IONPs.
    3. Chauffer le gel de gélatine à 40 - 50 °C, injecter immédiatement 500 μL de la solution de gélatine dans le coussinet mammaire droit de l’animal.
      REMARQUE: Des expériences d’hyperthermie induite magnétique ont été menées avec la machine de chauffage en utilisant les mêmes paramètres que le test in vitro.
    4. Allumez le champ magnétique alternatif (AFM) et la caméra thermique infrarouge. Placez le coussinet mammaire droit des souris au centre d’une bobine de cuivre à induction magnétique refroidie à l’eau.
    5. Allumez la caméra thermique infrarouge, imagez la région d’intérêt (coussinet mammaire droit des souris) pendant 10 minutes en continu et enregistrez la température de la région d’intérêt en temps réel.
    6. Éteignez l’interrupteur d’alimentation de la machine et de la caméra thermique infrarouge après 10 minutes d’induction. Attendez que la température de la bobine de cuivre revienne à la ligne de base pendant 10 min.
    7. Répétez les 4.3.4 à 4.3.6 pour la mesure d’autres échantillons.
    8. Éteignez la machine de chauffage par radiofréquence modérée (AFM) et le refroidisseur.
      REMARQUE: Faites attention aux températures élevées, évitez le contact direct avec les mains et attendez le refroidissement avant de prélever les échantillons.
    9. Euthanasier des souris par asphyxie au CO2 et luxation des vertèbres cervicales ou toute autre méthode approuvée par le comité de recherche animale de l’Institut.

Résultats

Les microbulles à coque de nanoparticules (NSM) à triple réactivité utilisées dans cette étude ont été préparées en agitant le mélange du tensioactif et des INP. Les IONPs (50 nm) se sont auto-assemblés à l’interface du noyau liquide et gazeux, pour former une coque magnétique densément emballée. La morphologie des NSM est illustrée à la figure 1A. Les NSM résultants présentaient une forme sphérique et un diamètre moyen de 5,41 ± 1,78 μm(figure 1B). Les résulta...

Discussion

Ici, nous avons présenté un protocole de fabrication de microbulles à enveloppe de nanoparticules d’oxyde de fer (NSM) par auto-assemblage, synergie magnétique, acoustique et réactivité optique dans une plate-forme nanothérapeutique. Les IAP étaient densément emballés autour du noyau d’air pour former une coquille magnétique, qui peut être contrôlée par le champ magnétique externe pour le ciblage. Une fois délivrés, la libération d’IONP peut être obtenue par déclenchement par ultrasons. Les ITP ...

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (81601608) et NUPTSF (NY216024).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
808 nm laser powerChangchun New Industries Optoelectronics TechMDL-F-808-5W-18017023
Calcein-AMThermo Fisher SCIENTIFICC3099
Fetal bovine serumInvitrogen16000-044
Fluorescence MicroscopeOlympusIX71
Function generatorKeysight33500B series20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability
Gelatin gelSigma9000-70-8
Heating machineShuangpingSPG-06- II
Homemade focused transducerFrequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8°
HomogenizerSCILOGEXD-1608000-30000 rpm
HydrophoneT&CNH1000
ICR male miceOG Pharmaceutical. Co. Ltd8-week-old
Inductively coupled plasma optical emission spectrometryPerkinElmer
Infrared thermal imaging camera.FLIRE50
Iron(II,III) oxideAlfa Aesar1317-61-950-100nm APS Powder
Laser power meterChangchun New Industries Optoelectronics Tech
OscilloscopeKeysightDSOX3054TBandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels
RF Power AmplifierT&CAG1020The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle.
Roswell Park Memorial Institute-1640KeyGEN BioTECHKGM31800
Sodium dodecyl sulfateSigma151-21-3

Références

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  22. Alzaraa, A., et al. Targeted microbubbles in the experimental and clinical setting. American Journal of Surgery. 204 (3), 355-366 (2012).

Réimpressions et Autorisations

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