Microburbujas magnéticas, acústicas y ópticas de triple respuesta para la hipertermia magnética y la terapia combinada de cáncer potototérmico

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la fabricación de microburbujas con capa de nanopartículas (NSM) de óxido de hierro a través del autoensamblaje, sinergizando la capacidad de respuesta magnética, acústica y óptica en una plataforma nanoterapéutica para la hipertermia magnética y la terapia de combinación fototérmica contra el cáncer.

Resumen

La administración precisa de agentes anticancerígenos que apuntan a la administración dirigida y penetrada profundamente, así como a una liberación controlada en el sitio del tumor ha sido cuestionada. Aquí, fabricamos microburbujas con carcasa de nanopartículas de óxido de hierro (NSM) a través del autoensamblaje, sinergizando la capacidad de respuesta magnética, acústica y óptica en una plataforma nanoterapéutica. Las nanopartículas de óxido de hierro sirven como agentes magnéticos y fototérmicos. Una vez inyectados por vía intravenosa, los NSM pueden ser guiados magnéticamente al sitio del tumor. El ultrasonido desencadena la liberación de nanopartículas de óxido de hierro, facilitando la penetración de nanopartículas profundamente en el tumor debido al efecto de cavitación de las microburbujas. A partir de entonces, la hipertermia magnética y la terapia fototérmica se pueden realizar en el tumor para la terapia combinada del cáncer, una solución para la resistencia al cáncer debido a la heterogeneidad del tumor. En este protocolo se realizó la síntesis y caracterización de los NSM incluyendo propiedades estructurales, químicas, magnéticas y acústicas. Además, la eficacia anticancerígena mediante terapia térmica se investigó mediante cultivos celulares in vitro. La estrategia de administración propuesta y la terapia combinada son muy prometedoras en el tratamiento del cáncer para mejorar tanto la administración como la eficacia contra el cáncer.

Introducción

El cáncer es una de las enfermedades más mortales, causando millones de muertes cada año en todo el mundo y enormes pérdidas económicas¹. En las clínicas, las terapias convencionales contra el cáncer, como la resección quirúrgica, la radioterapia y la quimioterapia, aún no pueden proporcionar una eficacia terapéutica satisfactoria². Las limitaciones de estas terapias son los efectos secundarios tóxicos altos, la alta tasa de recurrencia y la alta tasa de metástasis³. Por ejemplo, la quimioterapia se sufre por la baja eficiencia de administración de quimio fármacos precisamente al sitio tumoral⁴. La incapacidad de los fármacos para penetrar profundamente en el tejido tumoral a través de las barreras biológicas, incluida la matriz extracelular y la alta presión del líquido intersticial tumoral, también es responsable de la baja eficacia terapéutica⁵. Además, la resistencia tumoral suele ocurrir en los pacientes que recibieron tratamiento mediante quimioterapia única⁶. Por lo tanto, las técnicas donde se produce la ablación térmica del tumor, como la terapia fototérmica (PTT) y la terapia de hipertermia magnética (MHT), han mostrado resultados prometedores para reducir la resistencia tumoral y han ido surgiendo en ensayos clínicos^7,8,9.

PTT desencadena la ablación térmica de las células cancerosas por la acción de agentes de conversión fototérmica bajo la irradiación de la energía del láser. La alta temperatura generada (por encima de 50 °C) induce necrosis celular completa¹⁰. Muy recientemente, se demostró que las nanopartículas de óxido de hierro (IONP) son un agente de conversión fototérmica que puede ser activado por la luz del infrarrojo cercano (NIR)¹¹.  A pesar del bajo coeficiente de absorción molar en la región del infrarrojo cercano, los IONP son candidatos para la terapia fototérmica a baja temperatura (43 °C), una terapia modificada para reducir el daño causado por la exposición al calor a los tejidos normales e iniciar la inmunidad antitumoral contra la metástasis tumoral¹². Una de las limitaciones de PTT es la baja profundidad de penetración del láser. Para los tumores profundamente asentados, el calentamiento inducido por el campo magnético alterno (AFM) de nanopartículas de óxido de hierro, también llamado hipertermia magnética, es una terapia alternativa para PTT^13,14. La principal ventaja de MHT es la alta penetración del campo magnético¹⁵. Sin embargo, la concentración relativamente alta requerida de IONPs sigue siendo una desventaja importante para su aplicación clínica. La eficiencia de entrega de nanomedicina (o nanopartículas) a tumores sólidos en animales ha sido del 1-10% debido a una serie de obstáculos que incluyen circulación, acumulación y penetración^16,17. Por lo tanto, una estrategia de administración de IONPs controlada y dirigida con la capacidad de lograr una alta penetración tisular es de gran interés en el tratamiento del cáncer.

La entrega de nanopartículas mediada por ultrasonido ha demostrado su capacidad para facilitar la penetración de nanopartículas profundas en el tejido tumoral, debido al fenómeno llamado cavitación de microburbujeos^18,19. En el presente estudio, fabricamos microburbujas con cáscara (NSM) de IONPs a través de autoensamblaje, sinergizando la capacidad de respuesta magnética, acústica y óptica en una plataforma nanoterapéutica. El NSM contiene un núcleo de aire y una capa de nanopartículas de óxido de hierro, con un diámetro de aproximadamente 5,4 μm. Los NSM pueden ser guiados magnéticamente al sitio del tumor. Luego, la liberación de IONPs se desencadena por ultrasonido, acompañada de cavitación de microburbujes y microstreaming. El impulso recibido de la microstreaming facilita la penetración de IONPs en el tejido tumoral. El PTT y el MHT se pueden lograr mediante irradiación láser NIR o aplicación de AFM, o con la combinación de ambos.

Protocolo

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por las directrices farmacéuticas de OG para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Los protocolos siguieron las directrices del Comité de Ética para animales de laboratorio de OG Pharmaceutical.

1. Síntesis de microburbujas con capa de nanopartículas (NSM)

1. Disperse nanopartículas magnéticas (Fe₃O_4,óxido de hierro) en agua desionizada para formar una solución de stock de 10 mg/ml.
2. Coloque el tubo que contiene la solución de IONPs en una máquina de limpieza ultrasónica durante 20 min. Obtenga una solución de IONPs uniformemente dispersa antes de su uso.
3. Añadir 150 μL de agua desionizada, 150 μL de dodecil sulfato de sodio (SDS) de 10 mM y 400 μL de una solución stock de IONPs del paso 1.1. en tubo centrífugo de 1,5 ml.
4. Fije el homogeneizador con un andamio en un baño de hielo.
5. Coloque el tubo de la mezcla en un baño de hielo y coloque la sonda homogeneizadora con precisión para sumergirla en la solución de mezcla.
6. Ajuste la velocidad del homogeneizador a 20.000 rpm y encienda el homogeneizador durante 3 minutos.
7. Apague el homogeneizador y retire el tubo del baño de hielo.
8. Coloque el tubo en el bastidor del tubo para una estabilización de 12 h a temperatura ambiente.
9. Adsorba los NSM resultantes a la pared del tubo mediante un imán y retire el sobrenadante. Luego reponga con 1 ml de agua fresca desionizada.
10. Repita el proceso de lavado tres veces y vuelva a suspender los NSM en 1 ml de agua destilada fresca.
11. Transfiera 10 μL de suspensión de NSM a un portaobjetos de vidrio limpio después de agitar ligeramente.
12. Use un microscopio de fluorescencia a un aumento de 20x para visualizar la morfología de los NSM. Asegúrese de tomar fotos en un área aleatoria.
13. Mida el diámetro de los NSM a partir de las fotos utilizando un software Nano Measurer 1.2 de acceso abierto. Cuente al menos 200 microburbujas.
    1. Haga clic en "Archivo" y "Abrir" para seleccionar el archivo de imagen que se procesará. Después de importar la imagen, presione la "regla". Dibuja una línea roja con la misma longitud que la regla.
    2. Luego presione "Configuración" | "Regla" e introduzca la longitud de la regla. Dibuja líneas de las mismas longitudes que los diámetros de las microburbujas individuales de la imagen. Complete todas las mediciones, luego haga clic en "Informe" | " Ver informe".

2. Respuesta acústica de los NSM

1. Diluya 200 μL de NSM con 800 μL de agua desionizada, luego transfiéralo a un tubo de centrífuga de 1,5 ml para formar una solución de stock.
2. Conecte el generador de funciones, el amplificador, la coincidencia de impedancia y el transductor enfocado casero. Coloque el transductor en el centro en la parte inferior del fregadero cuboide artificial y conecte el hidrófono con un osciloscopio para controlar la intensidad del ultrasonido de salida (Figura 1). Agregue agua desionizada en el fregadero para sumergir el transductor.
3. Ajuste el generador de funciones al modo de barrido, ajuste el rango de frecuencia de 10 kHz a 900 kHz y ajuste la amplitud a 20 Vpp (pico de voltaje). Ajuste la potencia del ultrasonido al 0,1% por el amplificador. La duración de cada ciclo es de 4 s con un intervalo de tiempo de 1 s.
4. Prepare muestras de solución de 1 ml de NSM en el tubo y fije el tubo con un andamio en la parte superior del transductor enfocado casero. Conecte el imán a la parte inferior del tubo y atraiga a los NSM.
5. Encienda la alimentación del generador de funciones y del amplificador. Apague el generador de funciones después de la aplicación de 5 ciclos (25 s) de ultrasonido. Retire el imán y recoja 1 ml de la solución que contiene los IONP liberados. Añadir 1 ml de agua desionizada al tubo de la centrífuga.
6. Repita el paso 2.5. hasta que los NSM en el tubo colapsen por completo.
7. Cuantificar todos los IONPs liberados por la espectrometría de emisión óptica de plasma acoplada inductivamente (ICP-OES) como se describió anteriormente¹³.

3. Respuesta óptica de los NSM

NOTA: En este trabajo, se utiliza un sistema láser que contiene una potencia láser de 808 nm y una cámara termográfica infrarroja previamente descrita por Xu et al.²⁰.

1. Preparación del sistema láser
   1. Encienda la fuente de alimentación del láser y deje que se caliente durante varios minutos. Fije un diodo láser de 808 nm acoplado a fibra en un soporte de retorta.
   2. Dirija el rayo láser a la etapa de muestra a través de una fibra óptica y concéntrese en la etapa de muestra para lograr un punto de luz de 6 mm (de diámetro) mediante una lente convexa.
   3. Mida la potencia de salida con un medidor de potencia láser y ajuste la potencia a 1 W/cm².
   4. Fije la cámara termográfica infrarroja en el trípode. Encienda la cámara y compruebe si funciona (por ejemplo, supervise la temperatura de la región de interés enfocada (ROI)). Apague la fuente de alimentación y la cámara termográfica infrarroja.
2. Medición fototérmica en solución acuosa
   1. Prepare la muestra de 1 ml a diferentes concentraciones de IONPs (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) en un tubo centrífugo de 1,5 ml.
   2. Coloque el tubo de interés en la región focalizada del rayo láser y registre la temperatura basal de la muestra.
   3. Encienda la potencia láser y la cámara termográfica infrarroja e irradie la muestra durante 10 minutos de forma continua. Al mismo tiempo, registre la temperatura en tiempo real.
   4. Apague la cámara de alimentación láser y la cámara termográfica infrarroja después de 10 minutos de irradiación. Espere a que la temperatura de la región vuelva a la línea de base.
   5. Repita 3.2.2 a 3.2.4 para la medición de otras muestras.
      NOTA: Utilice agua desionizada a 20 °C como control para la medición fototérmica.
3. Medición fototérmica en células cultivadas
   NOTA: Se seleccionaron células de cáncer de mama murino (4T1) como modelo para investigar el efecto de inhibición del tratamiento fototérmico.
   1. Alimente las células con roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) medio suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de penicilina. Establezca el ambiente de cultivo como 37 ° C y 5% de CO₂.
   2. Cultivar células 4T1 en matraces T25 y pasar las células en una proporción de 1:2 cuando se alcanza el 90% de confluencia.
      NOTA: La relación de subcultivo se puede ajustar de acuerdo con las condiciones celulares específicas en diferentes laboratorios.
   3. Retire y deseche el medio de cultivo. Enjuague la capa celular con 1 solución de PBS para eliminar el suero residual que contiene el inhibidor de tripsina.
   4. Añadir 2 ml de solución de tripsina-EDTA (0,25%) al matraz para el desprendimiento. Luego agregue 3 ml de medio 1640 y aspire las celdas mediante pipeteo suave.
   5. Recoger 5 ml de la suspensión celular y la centrífuga a 500 x g durante 3 min.
   6. Retire el sobrenadante y agregue 1 ml de medio fresco 1640 para formar una suspensión celular.
   7. Añadir 100 μL de la suspensión celular a una placa confocal que contenga 1 ml del medio de cultivo. Asegúrese de que la concentración de suspensión celular sea de 9 x^{10 5}/mL, y la concentración celular final en el plato confocal de cultivo celular sea de 8,1 x 10⁴/mL.
   8. Coloque el plato confocal de cultivo celular inoculado en una incubadora durante 24 h.
   9. Diluir diferentes concentraciones (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) de la muestra de IONPs para hacer 1 ml de solución con medio 1640 libre de suero.
   10. Aspire el medio de cultivo del plato confocal y agregue la solución de muestra preparada.
   11. Encienda la potencia del láser. Enfoque el rayo láser en el centro del plato y ajuste la potencia de salida a 1 W/cm². Encienda la cámara termográfica infrarroja, irradie las células en el plato confocal durante 10 minutos continuamente. Registre la temperatura en tiempo real para la región enfocada.
   12. Apague la cámara termográfica láser e infrarroja. Transfiera el plato irradiado a la incubadora durante otras 24 h.
   13. Retire y deseche el medio de cultivo, agregue 1 ml del medio de cultivo fresco en el plato confocal. Añadir 5 μL de solución de Calceína-AM (1 mg/ml) en el plato.
   14. Incubar el plato confocal a 37 °C y 5% CO₂ durante 15 min. Enjuague la capa celular con 1 solución de PBS dos veces.
   15. Observe y visualiza las células mediante un microscopio de fluorescencia confocal con una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 500-540 nm.
   16. Elija 5 áreas en las imágenes confocales al azar y cuente el número de células 4T1 vivas en cada área manualmente. Cuantificar la viabilidad de las células 4T1 comparando el número de células vivas en todos los grupos experimentales con el grupo control.
       NOTA: Utilice el medio 1640 sin suero a 20 °C como control para la medida fototérmica. Utilice la muestra sin irradiación láser como grupo de control de viabilidad celular.
4. Medición fototérmica in vivo
   1. Prepare 3 de ratones machos ICR de 8 semanas de edad con un peso medio de 25 ± 2 g.
   2. Añadir 2 g de gelatina en polvo a 20 ml de agua desionizada. Calentar la solución a 40 - 50 ° C, disolver el gel de gelatina por completo para formar una solución transparente y transparente.
   3. Añadir 100 mg de IONPs a la solución de 3.4.2.
   4. Calentar el gel a 40 – 50 °C, inyectar inmediatamente 500 μL de la solución de gelatina en la almohadilla mamaria derecha del ratón.
   5. Encienda la potencia del láser y enfoque el rayo láser en la región de interés (almohadilla mamaria derecha de los ratones). Ajuste la potencia de salida a 1 W/cm^2. Encienda la cámara termográfica infrarroja, irradie la región de interés durante 10 minutos de forma continua. Registre la temperatura de la región de interés en tiempo real.
   6. Apague la cámara termográfica láser e infrarroja.
   7. Sacrificar ratones por asfixia de CO₂ y dislocación de vértebras cervicales o cualquier método aprobado por el comité de investigación animal del Instituto.

4. Medición de hipertermia magnética

NOTA: Aquí, se utiliza un sistema de hipertermia magnética previamente descrito por Wu et al. ⁽²¹⁾.

1. Prepare un sistema de hipertermia magnética que incluya un generador de campo magnético alterno (AFM) y una cámara termográfica infrarroja.
   1. Encienda el enfriador durante 10 minutos y luego encienda la máquina de calefacción por radiofrecuencia moderada (es decir, el generador AFM).
   2. Establezca los parámetros de la máquina de la siguiente manera: frecuencia (f) = 415 kHz, intensidad del campo magnético = 1,8 kA / m.
2. Medición de hipertermia magnética en solución acuosa
   1. Preparar 1 ml de la muestra a diferentes concentraciones de IONPs (1,05 mg/ml, 1,35 mg/ml, 3,65 mg/ml, 5 mg/ml) en un tubo centrífugo de 1,5 ml.
   2. Coloque el tubo en el centro de una bobina de cobre de inducción magnética refrigerada por agua.
   3. Encienda el campo magnético alterno (AFM) y la cámara termográfica infrarroja. Inducir la muestra durante 10 min de forma continua y registrar la temperatura en tiempo real.
      NOTA: La cámara se encuentra en la parte superior de la muestra, proporcionando una vista transversal de la muestra.
   4. Apague el AFM y la cámara termográfica infrarroja. Espere a que la temperatura de la bobina de cobre vuelva a la línea de base durante 10 minutos.
      NOTA: Tenga cuidado con las altas temperaturas, evite el contacto directo con las manos y espere a que se enfríen antes de extraer las muestras.
   5. Repita 4.2.2 a 4.2.4 para la medición de las otras muestras.
   6. Apague la máquina de calentamiento por radiofrecuencia moderada (AFM) y el enfriador.
      NOTA: Utilice el agua desionizada a 20 °C como control para la medición de la hipertermia magnética.
3. Medición de hipertermia magnética in vivo
   1. Prepare 3 de ratones machos ICR de 8 semanas de edad con un peso medio de 25 ± 2 g.
   2. Preparar 20 ml de gel de gelatina al 10 % que contenga 5 mg/ml de solución de IONIZados.
   3. Calentar el gel de gelatina a 40 - 50 ° C, inyectar inmediatamente 500 μL de la solución de gelatina en la almohadilla mamaria derecha del animal.
      NOTA: Los experimentos de hipertermia inducida por magnetismo se llevaron a cabo con la máquina de calentamiento utilizando los mismos parámetros que la prueba in vitro.
   4. Encienda el campo magnético alterno (AFM) y la cámara termográfica infrarroja. Coloque la almohadilla mamaria derecha de los ratones en el centro de una bobina de cobre de inducción magnética enfriada por agua.
   5. Encienda la cámara termográfica infrarroja, imagine la región de interés (almohadilla mamaria derecha de los ratones) durante 10 minutos de forma continua y registre la temperatura de la región de interés en tiempo real.
   6. Apague el interruptor de encendido de la máquina y la cámara termográfica infrarroja después de 10 minutos de inducción. Espere a que la temperatura de la bobina de cobre vuelva a la línea de base durante 10 minutos.
   7. Repita 4.3.4 a 4.3.6 para la medición de otras muestras.
   8. Apague la máquina de calentamiento por radiofrecuencia moderada (AFM) y el enfriador.
      NOTA: Tenga cuidado con las altas temperaturas, evite el contacto directo con las manos y espere a que se enfríen antes de extraer las muestras.
   9. Sacrificar ratones por asfixia de CO₂ y dislocación de vértebras cervicales o cualquier método aprobado por el comité de investigación animal del Instituto.

Resultados

Las microburbujas con carcasa de nanopartículas (NSM) de triple respuesta utilizadas en este estudio se prepararon agitando la mezcla del surfactante y los IONP. Los IONP (50 nm) se autoensamblaron en la interfaz del núcleo líquido y gaseoso, para formar una carcasa magnética densamente empaquetada. La morfología de los NSM se muestra en la Figura. 1A. Los NSM resultantes presentaron una forma esférica y con un diámetro promedio de 5,41 ± 1,78 μm (Figura 1B). Los resultados indi...

Discusión

Aquí, presentamos un protocolo de fabricación de microburbujas con cáscara de nanopartículas de óxido de hierro (NSM) a través del autoensamblaje, sinergizando la capacidad de respuesta magnética, acústica y óptica en una plataforma nanoterapéutica. Los IONP se empaquetaron densamente alrededor del núcleo de aire para formar una cáscara magnética, que puede ser controlada por el campo magnético externo para la orientación. Una vez entregado, la liberación de IONPs se puede lograr mediante disparador de ul...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
808 nm laser power	Changchun New Industries Optoelectronics Tech	MDL-F-808-5W-18017023
Calcein-AM	Thermo Fisher SCIENTIFIC	C3099
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000-044
Fluorescence Microscope	Olympus	IX71
Function generator	Keysight	33500B series	20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability
Gelatin gel	Sigma	9000-70-8
Heating machine	Shuangping	SPG-06- II
Homemade focused transducer			Frequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8°
Homogenizer	SCILOGEX	D-160	8000-30000 rpm
Hydrophone	T&C	NH1000
ICR male mice	OG Pharmaceutical. Co. Ltd		8-week-old
Inductively coupled plasma optical emission spectrometry	PerkinElmer
Infrared thermal imaging camera.	FLIR	E50
Iron(II,III) oxide	Alfa Aesar	1317-61-9	50-100nm APS Powder
Laser power meter	Changchun New Industries Optoelectronics Tech
Oscilloscope	Keysight	DSOX3054T	Bandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels
RF Power Amplifier	T&C	AG1020	The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle.
Roswell Park Memorial Institute-1640	KeyGEN BioTECH	KGM31800
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	151-21-3