Microbolhas magnéticas, acústicas e óptica-tripla-responsivas para hipertermia magnética e terapia de câncer de combinação pothototérmica

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para a fabricação de microbolhas com nanopartículas de óxido de ferro (NSMs) através de auto-montagem, sinergizando a capacidade de resposta magnética, acústica e óptica em uma plataforma nanoterapêutica para hipertermia magnética e terapia de câncer de combinação fototérmica.

Resumo

A entrega de precisão de agentes anticâncológicos que visam o parto direcionado e penetrado profundamente, bem como uma liberação controlada no local do tumor foi desafiada. Aqui, fabricamos microbolhas com casca de óxido de ferro (NSMs) através de auto-montagem, sinergizando a capacidade de resposta magnética, acústica e óptica em uma plataforma nanoterapêutica. As nanopartículas de óxido de ferro servem como agentes magnéticos e fototérmicos. Uma vez injetados por via intravenosa, os NSMs podem ser guiados magneticamente até o local do tumor. O ultrassom desencadeia a liberação de nanopartículas de óxido de ferro, facilitando a penetração de nanopartículas profundas no tumor devido ao efeito de cavitação de microbolhas. A partir daí, hipertermia magnética e terapia fototérmica podem ser realizadas no tumor para terapia de câncer combinada, uma solução para a resistência ao câncer devido à heterogeneidade tumoral. Neste protocolo, foi realizada a síntese e caracterização de NSMs incluindo propriedades estruturais, químicas, magnéticas e acústicas. Além disso, a eficácia anticâncer por terapia térmica foi investigada usando culturas in vitro celulares. A estratégia de parto proposta e a terapia de combinação mantém grande promessa no tratamento do câncer para melhorar tanto a entrega quanto as eficácias anticancerígenas.

Introdução

O câncer é uma das doenças mais mortais, causando milhões de mortes a cada ano em todo o mundo e enormes perdas econômicas¹. Nas clínicas, as terapias anticancerígenas convencionais, como ressecção cirúrgica, radioterapia e quimioterapia, ainda não podem proporcionar uma eficácia terapêutica satisfatória². As limitações dessas terapias são altos efeitos colaterais tóxicos, alta taxa de recidiva e alta taxa de metástase³. Por exemplo, a quimioterapia sofre da baixa eficiência de entrega de quimioterapia precisamente para o local do tumor⁴. A incapacidade de as drogas penetrarem profundamente no tecido tumoral através das barreiras biológicas, incluindo matriz extracelular e alta pressão de fluido intersticial tumoral, também é responsável pela baixa eficácia terapêutica⁵. Além disso, a resistência ao tumor geralmente acontece nos pacientes que receberam tratamento por quimioterapia única⁶. Portanto, técnicas onde ocorre a ablação térmica do tumor, como a terapia fototermal (TEPT) e a terapia de hipertermia magnética (MHT), têm mostrado resultados promissores para reduzir a resistência ao tumor e vêm surgindo em ensaios clínicos^7,8,9.

PtT desencadeia ablação térmica de células cancerosas pela ação de agentes de conversão fototérmica sob a irradiação da energia laser. A alta temperatura gerada (acima de 50 °C) induz necrose celular completa¹⁰. Muito recentemente, as nanopartículas de óxido de ferro (IONPs) foram demonstradas como um agente de conversão fototérmica que pode ser ativado pela luz infravermelha próxima (NIR)¹¹.  Apesar do baixo coeficiente de absorção molar na região infravermelha próxima, os IONPs são candidatos à terapia fototermal de baixa temperatura (43 °C), uma terapia modificada para reduzir os danos causados pela exposição ao calor a tecidos normais e iniciar imunidade antitumoral contra metástase tumoral¹². Uma das limitações do PTT é a baixa profundidade de penetração do laser. Para tumores profundos, o aquecimento induzido pelo campo magnético alternado (AFM) das nanopartículas de óxido de ferro, também chamada de hipertermia magnética, é uma terapia alternativa para PTT^13,14. A principal vantagem do MHT é a alta penetração do campo magnético¹⁵. No entanto, a concentração relativamente alta de IONPs é uma grande desvantagem para sua aplicação clínica. A eficiência de entrega da nanomedicina (ou nanopartículas) em tumores sólidos em animais tem sido de 1 a 10% devido a uma série de obstáculos, incluindo circulação, acúmulo e penetração^16,17. Portanto, uma estratégia de entrega controlada e direcionada de IONPs com a capacidade de alcançar alta penetração tecidual é de grande interesse no tratamento do câncer.

O parto mediado de ultrassom de nanopartículas mostrou sua capacidade de facilitar a penetração de nanopartículas profundas no tecido tumoral, devido ao fenômeno chamado cavitação de microbolhas^18,19. No presente estudo, fabricamos microbolhas (NSMs) com auto-montagem, sinergizando a capacidade de resposta magnética, acústica e óptica em uma plataforma nanoterapêutica. O NSM contém um núcleo de ar e uma concha de nanopartículas de óxido de ferro, com um diâmetro de aproximadamente 5,4 μm. Os NSMs podem ser guiados magneticamente até o local do tumor. Em seguida, a liberação de IONPs é desencadeada por ultrassom, acompanhada de cavitação de microbolhas e microstreaming. O impulso recebido a partir da microstreaming facilita a penetração de IONPs no tecido tumoral. O PTT e o MHT podem ser alcançados por irradiação a laser NIR ou aplicação AFM, ou com a combinação de ambos.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados de acordo com os protocolos aprovados pelas diretrizes farmacêuticas da OG para Cuidados com Animais e Uso de Animais de Laboratório. Os protocolos seguiram as diretrizes do Comitê de Ética para animais de laboratório da OG Pharmaceutical.

1. Síntese de microbolhas com casca de nanopartícula (NSMs)

1. Dispersar nanopartículas magnéticas (Fe₃O 4 ,_óxidode ferro) em água deionizada para formar uma solução de estoque de 10 mg/mL.
2. Coloque o tubo contendo a solução IONPs em uma máquina de limpeza ultrassônica por 20 minutos. Obtenha uma solução IONPs uniformemente dispersa antes de usar.
3. Adicione 150 μL de água deionizada, 150 μL de sulfato de dodecilo de sódio de 10 mM (SDS) e 400 μL de uma solução de estoque de IONPs a partir da etapa 1.1. em tubo de centrífuga de 1,5 mL.
4. Fixar o homogeneizador com um andaime em um banho de gelo.
5. Coloque o tubo da mistura em um banho de gelo e posicione a sonda homogeneizadora precisamente para ser imersa na solução da mistura.
6. Ajuste a velocidade do homogeneizador para 20.000 rpm e ligue o homogeneizador por 3 min.
7. Desligue o homogeneizador e remova o tubo do banho de gelo.
8. Coloque o tubo no rack do tubo para estabilização de 12 h à temperatura ambiente.
9. Adsorb os NSMs resultantes para a parede do tubo por um ímã e remover o supernatante. Em seguida, reabasteca com 1 mL de água desionizada fresca.
10. Repita o processo de lavagem por três vezes e suspenda de 1 mL de água fresca destilada.
11. Transfira 10 μL de suspensão de NSMs para um deslizamento de vidro limpo após tremer ligeiramente.
12. Use um microscópio de fluorescência em ampliação de 20x para visualizar a morfologia NSMs. Certifique-se de tirar fotos em área aleatória.
13. Meça o diâmetro dos NSMs das fotos usando um software Nano Measurer 1.2 de acesso aberto. Conte pelo menos 200 microbolhas.
    1. Clique em "Arquivo" e "Abrir" para selecionar o arquivo de imagem a ser processado. Depois que a imagem for importada, pressione o "governante". Desenhe uma linha vermelha com o mesmo comprimento que a régua.
    2. Em seguida, pressione "Configurações" | "Régua" e entre no comprimento da régua. Desenhe linhas dos mesmos comprimentos que os diâmetros dos microcompletos individuais na imagem. Complete todas as medidas e clique em "Relatório" | " Ver relatório".

2. Resposta acústica dos NSMs

1. Diluir 200 μL de NSMs com 800 μL de água deionizada e, em seguida, transfira para um tubo de centrífugo de 1,5 mL para formar uma solução de estoque.
2. Conecte o gerador de função, amplificador, correspondência de impedância e transdutor focado em caseiro. Coloque o transdutor no centro na parte inferior da pia cuboide artificial e conecte o hidrofone com um osciloscópio para monitorar a intensidade do ultrassom de saída(Figura 1). Adicione água deionizada na pia para imergir o transdutor.
3. Ajuste o gerador de função para o modo de varredura, ajuste a faixa de frequência de 10 kHz a 900 kHz e ajuste a amplitude para 20 Vpp (pico de tensão). Ajuste a potência do ultrassom para 0,1% pelo amplificador. A duração de cada ciclo é de 4 s com um intervalo de tempo de 1 s.
4. Prepare amostras de solução de estoque de 1 mL NSMs no tubo e fixe o tubo com um andaime na parte superior do transdutor focado em caseiro. Conecte o ímã à parte inferior do tubo e atraia os NSMs.
5. Ligue a potência do gerador de funções e do amplificador. Desligue o gerador de função após a aplicação de 5 ciclos (25 s) de ultrassom. Remova o ímã e colete 1 mL da solução contendo os IONPs liberados. Adicione 1 mL de água deionizada ao tubo de centrífuga.
6. Repita o passo 2.5. até que os NSMs no tubo desmoronem completamente.
7. Quantifique todos os IONPs liberados pela espectrometria de emissão óptica plasmática indutivamente acoplado (ICP-OES), conforme descrito anteriormente¹³.

3. Resposta óptica de NSMs

NOTA: Neste trabalho, um sistema laser contendo 808 nm de potência laser e uma câmera de imagem térmica infravermelha descrita anteriormente por Xu et al. é utilizado²⁰.

1. Preparação do sistema laser
   1. Ligue a fonte de alimentação do laser e deixe aquecer por vários minutos. Fixar um diodo laser de 808 nm acoplado em um suporte de réplica.
   2. Direcione o raio laser para o estágio da amostra através de uma fibra óptica e foque no estágio da amostra para alcançar uma mancha de luz de 6 mm (em diâmetro) por uma lente convexa.
   3. Meça a saída de energia com um medidor de alimentação laser e ajuste a potência para 1 W/cm².
   4. Conserte a câmera de imagem térmica infravermelha no tripé. Ligue a câmera e verifique se está funcionando (por exemplo, monitore a temperatura da região de interesse (ROI) focal. Desligue a fonte de alimentação e a câmera de imagem térmica infravermelha.
2. Medição fototérmica em solução aquosa
   1. Prepare a amostra de 1 mL em diferentes IONPs (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) em um tubo de centrífuga de 1,5 mL.
   2. Coloque o tubo de interesse na região focal do raio laser e regissumente a temperatura da linha de base da amostra.
   3. Ligue a potência do laser e a câmera de imagem térmica infravermelha e irradie a amostra por 10 minutos continuamente. Ao mesmo tempo, registo a temperatura em tempo real.
   4. Desligue a potência do laser e a câmera de imagem térmica infravermelha após 10 minutos de irradiação. Aguarde a temperatura da região voltar para a linha de base.
   5. Repita 3.2.2 a 3.2.4 para a medição de outras amostras.
      NOTA: Use água deionizada a 20 °C como controle para a medição fototérmica.
3. Medição fototérmica em células cultivadas
   NOTA: As células cancerígenas de mama murinas (4T1) foram selecionadas como modelo para investigar o efeito de inibição por meio do tratamento fototérmico.
   1. Alimente as células com o Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) médio suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% penicilina. Coloque o ambiente de cultivo como 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Cultura 4T1 células em frascos T25 e passagem as células em uma razão de 1:2 quando 90% de confluência é atingida.
      NOTA: A razão da subcultura pode ser ajustada de acordo com as condições específicas das células em diferentes laboratórios.
   3. Remova e descarte o meio de cultura. Enxágüe a camada celular com solução pbs 1x para remover o soro residual contendo inibidor de trippsina.
   4. Adicione 2 mL de solução Trypsin-EDTA (0,25%) ao frasco para desprendimento. Em seguida, adicione 3 mL de 1640 células médias e aspiradas por pipetação suave.
   5. Colete 5 mL da suspensão celular e centrífuga a 500 x g por 3 min.
   6. Remova o supernasce e adicione 1 mL de meio fresco de 1640 para formar uma suspensão celular.
   7. Adicione 100 μL da suspensão celular a um prato confocal contendo 1 mL do meio de cultura. Certifique-se de que a concentração de suspensão celular é de 9 x 10⁵/mL, e a concentração celular final no prato confocal da cultura celular é de 8,1 x 10⁴/mL.
   8. Coloque o prato confocíte da cultura celular inoculada em uma incubadora por 24 h.
   9. Diluir diferente concentração (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) da amostra de IONPs para fazer solução de 1 mL com meio 1640 sem soro.
   10. Aspire o meio de cultura a partir do prato confocal e adicione a solução de amostra preparada.
   11. Ligue a potência do laser. Concentre o raio laser no centro da antena e ajuste a potência de saída para 1 W/cm². Ligue a câmera de imagem térmica infravermelha, irradie as células na antena confocal por 10 minutos continuamente. Regisso da temperatura em tempo real para a região focada.
   12. Desligue a câmera de imagem térmica a laser e infravermelha. Transfira o prato irradiado para a incubadora por mais 24 horas.
   13. Retire e descarte o meio de cultura, adicione 1 mL do meio de cultura fresca no prato confocal. Adicione 5 μL de solução Calcein-AM (1 mg/mL) no prato.
   14. Incubar o prato confocal a 37 °C e 5% de CO₂ por 15 min. Enxágüe a camada celular com solução PBS 1x duas vezes.
   15. Observe e exploda as células por um microscópio de fluorescência confocal com um comprimento de onda de excitação de 488 nm e um comprimento de onda de emissão de 500-540 nm.
   16. Escolha 5 áreas nas imagens confocal aleatoriamente e conte o número de células 4T1 vivas em cada área manualmente. Quantifique a viabilidade das células 4T1 comparando o número de células vivas em todos os grupos experimentais com o grupo controle.
       NOTA: Use o meio 1640 sem soro a 20 °C como controle para a medida fototérmica. Use a amostra sem irradiação a laser como grupo de controle de viabilidade celular.
4. Medição fototérmica in vivo
   1. Prepare 3 de camundongos machos ICR de 8 semanas de idade com um peso médio de 25 ± 2 g.
   2. Adicione 2 g de gelatina em pó a 20 mL de água deionizada. Aqueça a solução a 40 - 50 °C, dissolva completamente o gel de gelatina para formar uma solução transparente e clara.
   3. Adicione 100 mg IONPs à solução a partir de 3.4.2.
   4. Aqueça o gel a 40 – 50 °C, injete imediatamente 500 μL da solução de gelatina na almofada de peito direita do mouse.
   5. Ligue a potência do laser e concentre o raio laser na região de interesse (almofada de peito direita dos ratos). Ajuste a potência de saída para 1 W/cm^2. Ligue a câmera de imagem térmica infravermelha, irradie a região de interesse por 10 minutos continuamente. Registo da temperatura da região de interesse em tempo real.
   6. Desligue a câmera de imagem térmica a laser e infravermelha.
   7. Eutanize os camundongos por asfixia de CO₂ e luxação de vértebras cervicais ou qualquer método aprovado pelo comitê de pesquisa animal do Instituto.

4. Medição da hipertermia magnética

NOTA: Aqui, um sistema de hipertermia magnética descrito anteriormente por Wu et al. é utilizado ⁽²¹⁾.

1. Prepare um sistema de hipertermia magnética, incluindo um gerador de campo magnético alternado (AFM) e uma câmera de imagem térmica infravermelha.
   1. Ligue o refrigerador por 10 minutos e, em seguida, ligue a máquina de aquecimento de radiofrequência moderada (ou seja, gerador AFM).
   2. Defina os parâmetros da máquina da seguinte forma: frequência (f) = 415 kHz, intensidade do campo magnético = 1,8 kA/m.
2. Medição de hipertermia magnética em solução aquosa
   1. Prepare 1 mL da amostra em diferentes IONPs (1,05 mg/mL, 1,35 mg/mL, 3,65 mg/mL, 5 mg/mL) em um tubo centrífuga de 1,5 mL.
   2. Coloque o tubo no centro de uma bobina de cobre de indução magnética resfriada com água.
   3. Ligue o campo magnético alternado (AFM) e a câmera de imagem térmica infravermelha. Induza a amostra por 10 minutos continuamente e regissou a temperatura em tempo real.
      NOTA: A câmera está localizada na parte superior da amostra, fornecendo uma visão transversal da amostra.
   4. Desligue o AFM e a câmera de imagem térmica infravermelha. Aguarde a temperatura da bobina de cobre para voltar à linha de base por 10 minutos.
      NOTA: Tenha cuidado com a alta temperatura, evite contato direto com as mãos e espere pelo resfriamento antes de remover amostras.
   5. Repita 4.2.2 a 4.2.4 para a medição das outras amostras.
   6. Desligo a máquina de aquecimento moderada de radiofrequência (AFM) e o refrigerador.
      NOTA: Utilize a água deionizada a 20 °C como controle para medição de hipertermia magnética.
3. Medição de hipertermia magnética in vivo
   1. Prepare 3 de camundongos machos ICR de 8 semanas de idade com um peso médio de 25 ± 2 g.
   2. Prepare 20 mL de gel de gelatina de 10 % contendo solução de 5 mg/mL IONPs.
   3. Aqueça o gel de gelatina a 40 - 50 °C, injete imediatamente 500 μL da solução de gelatina na almofada de peito direita do animal.
      NOTA: Foram realizados experimentos de hipertermia induzidos por magnéticos com a máquina de aquecimento usando os mesmos parâmetros do teste in vitro.
   4. Ligue o campo magnético alternado (AFM) e a câmera de imagem térmica infravermelha. Coloque a almofada de peito direita dos ratos no centro de uma bobina de cobre de indução magnética resfriada com água.
   5. Ligue a câmera de imagem térmica infravermelha, imagem a região de interesse (almofada de peito direita dos ratos) por 10 minutos continuamente e registo a temperatura da região de interesse em tempo real.
   6. Desligue o interruptor de alimentação da máquina e a câmera de imagem térmica infravermelha após 10 minutos de indução. Aguarde a temperatura da bobina de cobre para retornar à linha de base por 10 minutos.
   7. Repita 4.3.4 a 4.3.6 para a medição de outras amostras.
   8. Desligo a máquina de aquecimento moderada de radiofrequência (AFM) e o refrigerador.
      NOTA: Tenha cuidado com a alta temperatura, evite contato direto com as mãos e espere pelo resfriamento antes de remover amostras.
   9. Eutanize os camundongos por asfixia de CO₂ e luxação de vértebras cervicais ou qualquer método aprovado pelo comitê de pesquisa animal do Instituto.

Resultados

Os microbolhas com casca de nanopartículas triplas (NSMs) utilizados neste estudo foram preparados agitando a mistura do surfactante e dos IONPs. Os IONPs (50 nm) auto-montados na interface do núcleo líquido e gás, para formar uma concha magnética densamente embalada. A morfologia dos NSMs é mostrada na Figura 1A. Os NSMs resultantes apresentaram forma esférica e com diâmetro médio de 5,41 ± 1,78 μm(Figura 1B). Os resultados indicaram que os NSMs foram preparados com sucesso. ...

Discussão

Aqui, apresentamos um protocolo de fabricação de microbolhas com casca de óxido de ferro (NSMs) através de auto-montagem, sinergizando a capacidade de resposta magnética, acústica e óptica em uma plataforma nanoterapêutica. Os IONPs foram densamente embalados ao redor do núcleo de ar para formar uma concha magnética, que pode ser controlada pelo campo magnético externo para mira. Uma vez entregue, a liberação de IONPs pode ser alcançada pelo gatilho de ultrassom. Os IONPs liberados podem ser ativados tanto ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
808 nm laser power	Changchun New Industries Optoelectronics Tech	MDL-F-808-5W-18017023
Calcein-AM	Thermo Fisher SCIENTIFIC	C3099
Fetal bovine serum	Invitrogen	16000-044
Fluorescence Microscope	Olympus	IX71
Function generator	Keysight	33500B series	20 MHz, 2 channels with arbitrary waveform generation capability
Gelatin gel	Sigma	9000-70-8
Heating machine	Shuangping	SPG-06- II
Homemade focused transducer			Frequency=855, R-X=36.2W+5.8W, |Z|-θ=37W+8°
Homogenizer	SCILOGEX	D-160	8000-30000 rpm
Hydrophone	T&C	NH1000
ICR male mice	OG Pharmaceutical. Co. Ltd		8-week-old
Inductively coupled plasma optical emission spectrometry	PerkinElmer
Infrared thermal imaging camera.	FLIR	E50
Iron(II,III) oxide	Alfa Aesar	1317-61-9	50-100nm APS Powder
Laser power meter	Changchun New Industries Optoelectronics Tech
Oscilloscope	Keysight	DSOX3054T	Bandwidth 500 MHz, Sampling Rate 5 GS/S, 4 channels
RF Power Amplifier	T&C	AG1020	The signal source can also be connected to an external signal source. The gain can be adjusted from 0 to 100%. It has multiple functions such as frequency sweep, pulse, and triangle.
Roswell Park Memorial Institute-1640	KeyGEN BioTECH	KGM31800
Sodium dodecyl sulfate	Sigma	151-21-3