噬菌体纤维化 斑马鱼胚 胎中伪多多多阿韦诺萨感染的噬菌体治疗应用

摘要

这里介绍的是伪 多多多酸菌感染和 噬菌体治疗应用囊性纤维化（CF）斑马鱼胚胎的协议。

摘要

抗微生物药物耐药性是诊断不确定性和抗菌药物过度处方的一个主要后果，是全世界日益公认的严重感染、并发症和死亡的原因，它在我们的社会和卫生系统上产生了巨大影响。特别是，免疫系统受损或预先存在的慢性疾病（如囊性纤维化 （CF））的患者经常接受抗生素治疗，以控制多药耐药分离物的出现和传播感染。因此，迫切需要解决替代疗法，以抵消细菌感染。使用细菌的天敌噬菌体可能是一种可能的解决方案。本文详述的规程描述了噬菌体疗法在CF斑马鱼胚胎中对伪多多尼亚亚亚罗吉诺萨感染的应用。斑马鱼胚胎感染了 P.aeruginosa， 以证明噬菌体疗法对 P.aeruginosa 感染是有效的，因为它减少了CF胚胎中的致命性、细菌负担和亲炎免疫反应。

引言

噬菌体疗法，利用细菌的天敌来对抗细菌感染，随着细菌对抗生素的耐药性变得广泛^而引起,人们^{重新的兴趣}。这种疗法在东欧使用了几十年，可被视为对治疗CF患者肺部感染的抗生素的补充疗法，以及一种可能的治疗方法，用于治疗目前使用的所有抗生素^22、33的细菌。抗生素治疗的优点是噬菌体在感染部位繁殖，而抗生素被代谢，从体内^{消除4，5。,5}事实上，不同实验室分离的毒性噬菌体鸡尾酒的产生已证明对治疗动物模型中的伪多莫纳斯亚鲁吉诺萨感染是有效的，就像^,昆虫和哺乳动物^{6、7、87一样}。⁶在随机临床试验9中，噬菌体疗法还证明能够减轻感染了P.aeruginosa和Escherichia大肠杆菌的烧伤伤口的细菌^负担。

斑马鱼（Danio rerio）最近已成为研究几种病原体感染的宝贵模型，包括P.aeruginosa10，11，^10,11分枝杆菌脓肿和布尔科达雷塞西亚12，13。^12,13通过微缩细菌直接进入胚胎血液循环^14，很容易建立一种系统感染，由斑马鱼先天免疫系统抵消，这是进化保存与嗜中性粒细胞和巨噬细胞生成类似人类对应。此外，在生命的第一个月，斑马鱼胚胎缺乏适应性免疫反应，是研究先天免疫的理想模型，是人类肺部感染^{的关键防御机制}。斑马鱼最近成为一个强大的基因模型系统，以更好地了解CF发病，并开发新的药理治疗10，16，17。^10,16,17在斑马鱼中用形态注射产生的cftr击倒的CFR斑马鱼模型呈现抑制性呼吸突发反应和减少嗜中性粒细胞迁移^10，而cftr击倒导致内部器官位置受损和破坏外分泌胰腺，一种反映^{人类疾病16，17,}的^表型。最感兴趣的是发现，在cftr-功能丧失胚胎中，P.aeruginosa细菌负担明显高于感染后8小时对等对子，这与小鼠和人类支气管上皮细胞^2、18,18的结果平行。

在这项工作中，我们证明噬菌体疗法 对斑马鱼胚胎中的P.aeruginosa 感染是有效的。

研究方案

来自AB菌株（欧洲斑马鱼资源中心EZRC）的成年斑马鱼（Danio rerio）根据国际（欧盟指令2010/63/EU）和国家指南（意大利2014年3月4^th日法令，第26号法令）维护，保护用于科学目的的动物。标准条件设置在鱼设施与14小时光/10小时暗循环和水箱水温在28°C。

1. 准备解决方案和工具

1. 为生长斑马鱼胚胎的 E3 胚胎介质准备 50 倍的库存溶液和 1 倍的工作解决方案（ 参见表 1）。
2. 制作色素沉着阻断溶液，在受精后24小时（24马力）阻断胚胎色素沉着（见表1）。
3. 准备25x库存和1x工作三烷麻醉溶液，如表 1所述。
   注:为避免溶液反复冻结和解冻，可能损坏库存溶液，请制作2 mL的25x三辛等分，并将其储存在-20°C。
4. 在100毫升的蒸馏H2_O中溶解1克阿加罗斯，在微瓦瓶或瓶子中，为胚胎微注射做好准备。微波1-3分钟，直到红糖完全溶解。
5. 将斑马鱼微注射模具（ 参见材料表）倒置在培养皿（90 mm x 15 mm）中，通过浇注宽度约为 10 mm 的液体 agarose 凝胶覆盖整个表面。
6. 凝固后，拆下模具。用1x E3胚胎培养片填充培养皿。这可以在4°C储存约一个星期。使用前，请更换含有三金的新鲜 E3 介质。
   注:较旧的霉菌可能会产生真菌或细菌污染。
7. 使用火抛光的 10 厘米硅酸盐毛细管来准备用于微注射的针头，并通过拧紧手柄将其固定到微管拉拔器上。设置具有以下设置的拉拔器:热 500、速度 100、时间 150、拉拔 150。

2.P. aeruginosa （PAO1） 内分

1. 接种1个GPM+P.aeruginosa菌株^{PAO1 19}在5 mL的LB汤（见表1），并在37°C下在37°C下随着震动（200 rpm）生长过夜。⁺
2. 将上述隔夜培养稀释至 OD₆₀₀ ± 0.1 在 10 mL 的 LB 汤中，并在 37 °C 下在 37 °C 下在振动（200 rpm）时增长到 OD₆₀₀ ± 0.5。
3. 在 16，100 x g 的 4 °C 下将培养物的 2 mL 离心 2 mL， 并在 1 mL 的生理溶液中将细胞颗粒重新暂停至 OD₆₀₀ = 1，相当于约 1 x 10⁹ cfu/mL（见 表 1）。
4. 在生理溶液中将细胞悬浮液稀释至约5 x^{10 7}cfu/mL，并储存在4°C。

3. 噬菌未成年人库存准备

1. 在5 mL的LB汤中接种1个 P.aeruginosa 菌株PAO1，并在37°C下孵育过夜，震动。将隔夜培养稀释至 OD₆₀₀ ± 0.01，在 500 mL 的 LB 汤中，在 37 °C 下生长，摇动至 OD₆₀₀ = 0.05，相当于约 2.5 x 10⁷ cfu/mL。
2. 在 P.aeruginosa的稀释培养，添加约1.25×10⁷ 噬菌体，以获得10-3的多重^感染（M.O.I.）。在37°C下孵育，摇动，直到OD₆₀₀ 下降到约0.1-0.3（约3至5小时，取决于使用的噬菌体）。
   注:为这个感染PAO1菌株的实验选择了四个噬菌体:两个波多维里达、GenBank加入编号vB_PaeP_PYO2、MF490236和vB_PaeP_DEV、MF490238和两个米奥维里达、vB_PaeM_E215、MF490241和vB_PaeM_E217，MF490240。分别对每个噬菌未成年人执行以下步骤。
3. 在37°C下用1mg/mL的DNase和RNase孵育30分钟。 在 4°C 下以 5，000 x g 离心 30 分钟，并小心地回收上一代 （SN）。使用直径为 0.8 μm 的滤波器过滤 SN。
4. 在 SN 上，添加 58 g/L 的 NaCl 和 105 克/升的 PEG6000。在RT20分钟搅拌时溶解，然后在4°C下过夜。 在 4 °C 下以 20，000 x g 离心 30 分钟，用于噬菌代沉淀。拆下 SN 并小心地将噬菌蛋白颗粒溶解在 15 mL 的 TN 缓冲液中（ 参见表 1）。
5. 使用 CsCl 密度梯度净化噬菌体，如下步骤所述。
   1. 在用于 SW41 转子的多聚体超离心管中，通过分层表 1 中描述的四个 CsCl 溶液的 2 mL 来准备 CsCl 步 长密度梯度。 在4个管中各加入3.5 mL的噬菌根悬浮液。
      注:CsCl 是有毒的，请采用适当的安全程序来处理并丢弃它。
   2. 将管子引入转子，确保管子平衡（两个朝管之间的重量差必须 ≤为 0.01g）。
   3. 在 4 °C 和 100，000 x g（SW41 转子为 25，000 rpm）下离心机 2 小时。离心后，慢慢取出管子，小心地固定在支撑上。使用带 19 G 针头的注射器，绘制通常位于 d=1.5 和 d=1.4 密度区域之间的白/蛋白光带。
   4. 将悬浮液从注射器转移到SW60转子的新多聚体管中，并使用d=1.4溶液精确平衡管。
   5. 在 4 °C 和 150，0000 x g（SW60 转子的 38，000 rpm）下将悬架离心至少 16 小时。 x g
   6. 收集上述可见带（参见步骤 3.3.3），并将它们转移到透析管与 6，000 Da 截止。Dialyze 获得的可见带 2 倍 20 分钟对 500 mL 的水和过夜对 500 mL 的 TN 缓冲液。使用 0.22 μm 孔隙过滤器过滤，并在 4 °C 下储存。

4. 噬菌未成年人鸡尾酒准备

1. 使四个噬菌体混合，感染PAO1菌株，以前分离和特征^8。在混合之前，通过斑块测定20估计每个噬菌体库存的^滴度。
2. 将噬菌体鸡尾酒与总滴度 5 × 10 pfu/mL 组装，在每个实验前将四个噬菌体制剂均在同一 pfu/mL 中均等混合，以确保准确的噬菌体滴度。⁸

5. 收集和制备斑马鱼胚胎，用于 cftr 变形体微注射

注: 收集1-2细胞胚胎从野生型斑马鱼为 cftr 变形金（cftr-MOs）微注射。

1. 在细菌微注射实验前两天，建立育种对和收集胚胎，如前^21所述。AB菌株的成年斑马鱼（Danio rerio）是从欧洲斑马鱼资源中心，EZRC购买的。
2. 后天，在受精后立即用塑料移液器或使用细网过滤器收集胚胎。将收集的胚胎放在含有E3胚胎培养的培养皿中，用塑料移液器小心地清除碎屑，以避免污染，以免损害胚胎发育。
3. 通过将无菌水中的两种形态酚丝溶液（1 mM）稀释至最终浓度为0.25 pmol/胚胎 ATG-MO = 0.25 pmol/胚胎拼接-MO，制备 5 μL 的形态醇注射溶液。要追踪胚胎注射，在形态注射溶液混合物中加入0.5微升的酚红色。
4. 使用 20 μL 微吹风机和精细的凝胶加载尖端，用约 5 μL 的 Morpholino 混合溶液加载微注射针。将针头固定到连接到支架的微操纵器上，并放在立体显微镜下。
   注:由于微注射器泵的压力会推动溶液，因此不需要溶液到达针头的尖端。
5. 用细的无菌钳子切割针头，切掉针头尖。使用显微镜眼中的刻度杆测量落的直径。或者，在千分尺滑轨上创建一滴矿物油，通过将溶液注入油滴以评估液滴大小来设置微注射量。使用直径为 156 μm 的滴注入 2 nL 的体积。
6. 通过将补偿压力调整到 15 hPa，将注射时间调整到 0.5 s，将注射压力调整为 300 至 600 hPa，根据使用的针头获得正确的注射量，来设置微注射器。
7. 用塑料移液器将胚胎从步骤 5.2 排列到位于 96 mm 直径 Petri 盘中的玻璃杯上。
   注:太多的E3介质会阻止微注射针正确渗透到胚胎的胆小子中。
8. 穿透胆小子，然后用针将蛋黄注射到胚胎中，如前^22所述。
9. 将注射的胚胎放入带E3培养基的培养皿中，并在28°C时放入孵化器中，让胚胎发育至后天。

6. 斑马鱼胚胎与细菌和噬菌体鸡尾酒的微注射

注意:要进行全身感染，胚胎必须血液循环，通常在26马力后开始。

1. 26 hpf后（对于斑马鱼发育阶段，参考Kimmel^21），通过溶解E3介质中的蛋白酶粉，以2mg/mL的浓度，用前鼻液解出胚胎。轻轻移液胚胎以打破胚胎。丢弃前鼻/E3介质，用新鲜的E3冲洗盘子几次，以去除所有蛋白酶。
2. 在注射前约5分钟，在含有三氨酸的E3介质中麻醉斑马鱼胚胎。
3. 将麻醉胚胎放入步骤 1 中准备的轨道。使用精细的凝胶加载尖端将胚胎线在横向位置。
4. 如第 5 部分所述，用大约 5 μL 的 P. aeruginosa 制剂加载微注射针。
5. 将针头插入 Cuvier 管道的起点，开始在蛋黄囊上传播。注入1-3 nL的体积，确保体积直接在管道内膨胀并进入循环。
6. 大约每注射50个胚胎后，将一滴细菌注射到1.5 mL离心管中，并含有100μL的无菌PBS，以检查注射量是否保持不变。将 LB agar 上的 inoculum（ 见表 1）在 37°C 下过夜，以评估 CFU。
7. 将微植入的胚胎移植到两个干净的培养皿中，用新鲜的E3培养剂+PTU，在28°C下孵育。
8. 在两个选定的时间点:细菌注射后30分钟或3小时，从培养箱中取出一个带细菌注射胚胎的培养皿，并像6.3所述的培养皿中将它们对齐，用于噬菌体鸡尾酒注射。
9. 用大约 5 μL 的噬菌未成年人鸡尾酒（在步骤 4 中制备）加载微注射针，并用精细的凝胶加载尖端固定到微注射器上（参见步骤 5）。
10. 将噬菌体鸡尾酒注射到以前注射细菌的胚胎的Cuvier的导管中。
11. 将微植入的胚胎移植到两个干净的培养皿中，用新鲜的E3培养剂+PTU，在28°C下孵育。

7. 评估注射PAO1和噬菌体的胚胎的细菌负担

1. 在8 hpi，移液器15麻醉胚胎从培养皿到1.5 mL离心管。
2. 在PBS（PBSTritonX）中用300μL的1%Triton X-100代替麻醉液，通过无菌27-G针通过胰岛素注射器将胚胎传递至少15倍，使胚胎均质化。
3. 通过将稀释的同质质的100μL转移到900μL的无菌PBS中，准备无菌PBS中同质酸盐的连续稀释。
4. 为了选择天然抗安培PAO1菌株，在LB agar上加入100μL的稀释板（100μg/mL），并在37°C过夜孵育。
5. 后天，计算菌落数量，乘以稀释因子确定CFU的总数，并除以同质胚胎数，以获得CFU/感染胚胎的平均数量。

8. 评估注射PAO1和噬菌体胚胎的致死性

1. 要评估PAO1感染的致命性，在立体显微镜下对注射的胚胎进行评分为20 hpi，并计算死亡胚胎（白色/不透明）。
2. 计算半最大值致命浓度 50 （LD50） 剂量 PAO1，确定 50% 的注射胚胎在 20 hpf 处死亡。

9. GFP+ PAO1感染的立体显微镜延^时成像的 胚胎准备

1. 在 100 mL 的 E3 溶液中溶解 1.5% 的低熔融阿加罗斯，为活胚成像制备模具。
2. 加入1%的三辛 （见表1）麻醉胚胎。
3. 在4 hpi 转移一个胚胎与塑料移液器在玻璃底部盘，并添加温暖的低熔点阿加罗斯溶液。
4. 将玻璃底盘放在立体显微镜下，用尖端将胚胎定位在所需方向。使用塑料移液器小心地在胚胎上添加一滴糖。
5. 让气糖冷却5-10分钟，轻轻填充含有麻醉液的E3玻璃底盘，以保持胚胎湿润。
6. 将带胚胎的玻璃底盘放在荧光立体显微镜下，并配以荧光过滤器（通道 488 nm），用于 GFP⁺ 细菌。在 9、14 和 18 hpi 下以相同参数进一步采集之前，请勿取出 Petri 盘。

10. 亲炎细胞因子的表达分析

1. 在20马力麻醉胚胎与三核酸1x溶液，并把它们从培养皿转移到1.5 mL离心管。
2. 在烟罩下去除麻醉液，代之以200μL的盐酸钠试剂。
3. 首先通过200μL移液器重复移液胚胎，然后用无菌27G针头的胰岛素注射器至少15倍，使胚胎均质化。
4. 根据制造商的说明，使用市售的盐酸钠试剂从同质化斑马鱼胚胎中提取总RNA。
5. 按照制造商的说明，用 2 μL 的 1U/μL 的 1U/μL（无 RNase I）处理每个RNA样品的1μg。
6. 根据制造商的说明，使用1μg的DNase I处理RNA进行逆转录反应（RT），使用市售试剂盒（Table of Materials见材料表），总体积为20μL。
7. 使用 1.5 μL 的 1:6 RT 反应稀释，在包含 1x SYBR 绿色主混合的 10 μL 总体积中执行 RT qPCR 反应。出于规范化目的，使用用于家养基因 rpl8 和亲炎症细胞因子的底 剂，使用 TNF-α和 IL-1+ 的底剂（参见 表 2）。qPCR协议是:周期1步骤1:95°C，2分钟，重复一次;周期2:步骤1 95°C，10 s，步骤2 55°C，30 s，重复40倍;周期 3:步骤 1 72 °C，15 分钟

结果

此处显示的结果和数字是指通过注射cftr 形态异形体生成的 CF 胚胎，如前面^{10 和}步骤 5 所述。为了验证CF表型，考虑了心脏、肝脏和胰腺等内脏器官的受损位置，如前面描述^的17（图1）。在WT胚胎的情况下，也取得了类似的结果，正如我们在上一份出版物^{19中报道的。}

感染PAO1的CF胚胎的噬菌体?...

讨论

在这份手稿中，我们描述了在斑马鱼胚胎中实施 P.aeruginosa（PAO1） 感染的协议，以及如何使用以前被确定为能够感染PAO1的噬菌体鸡尾酒来应用噬菌体疗法来解决它。使用噬菌体作为抗生素治疗的替代品，自去年年底以来，人们越来越关注。这主要是由于耐多药（MDR）细菌感染的传播，这对公共卫生构成严重问题。当然，这项工作的范围仅限于将噬菌病疗法应用到动物模型，而不是人类。然...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	BD	214010
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
CsCl	Sigma-Aldrich	289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich	886-86-2	common name tricaine
Femtojet Micromanipulator	Eppendorf	5247
Fleming/brown P-97	Sutter Instrument Company	P-97
LE-Agarose	Sigma-Aldrich	11685660001
Low Melting Agarose	Sigma-Aldrich	CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Methyl Blue	Sigma-Aldrich	28983-56-4
Microinjection needles	Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98%	Aldrich-P7629	103-85-5
Oligo Morpholino	Gene Tools		designed by the researcher
PEG6000	Calbiochem	528877
Phenol Red Solution	Sigma-Aldrich	CAS 143-74-B
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Pronase	Sigma-Aldrich	9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	S9888
Stereomicroscope	Leica	S9I
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tryptone	Oxoid	LP0042B
Yeast extract	Oxoid	LP0021B
Z-MOLDS Microinjection	Word Precision Instruments