Aplicação de terapia phage para neutralizar pseudomonas aeruginosa infecção em embriões de zebrafish fibrose cística

Resumo

Apresentado aqui é um protocolo para a infecção por Pseudomonas aeruginosa e aplicação de terapia de phage em embriões de zebrafish fibrose cística (CF).

Resumo

A resistência antimicrobiana, uma das principais consequências da incerteza diagnóstica e da superprescrição antimicrobiana, é uma causa cada vez mais reconhecida de infecções graves, complicações e mortalidade em todo o mundo com um enorme impacto em nossa sociedade e no sistema de saúde. Em particular, pacientes com sistemas imunológicos comprometidos ou patologias pré-existentes e crônicas, como a fibrose cística (CF), são submetidos a tratamentos antibióticos frequentes para controlar as infecções com a aparência e difusão de isolados resistentes a multidroga. Portanto, é urgente abordar terapias alternativas para combater infecções bacterianas. O uso de bacteriófagos, os inimigos naturais das bactérias, pode ser uma solução possível. O protocolo detalhado neste trabalho descreve a aplicação da terapia de phage contra a infecção por Pseudomonas aeruginosa em embriões de zebrafish CF. Os embriões de zebrafish foram infectados com P. aeruginosa para demonstrar que a terapia phage é eficaz contra infecções por P. aeruginosa, pois reduz a letalidade, a carga bacteriana e a resposta imune pró-inflamatória em embriões CF.

Introdução

A terapia phage, o uso dos inimigos naturais das bactérias para combater infecções bacterianas, está ganhando interesse renovado à medida que a resistência bacteriana aos antibióticos se torna generalizada^1,,2. Esta terapia, utilizada há décadas na Europa Oriental, poderia ser considerada um tratamento complementar a antibióticos na cura de infecções pulmonares em pacientes com CF e uma possível alternativa terapêutica para pacientes infectados com bactérias resistentes a todos os antibióticos atualmente em uso^2,,3. As vantagens da terapia antibiótico são que os bacteriófagos se multiplicam no local da infecção, enquanto os antibióticos são metabolizados e eliminados do corpo^4,,5. De fato, a administração de coquetéis de phages virulentos isolados em diferentes laboratórios tem se mostrado eficaz no tratamento de infecções pseudomonas aeruginosa em modelos animais tão diferentes quanto insetos e mamíferos^6,,7,,8. A terapia de phage também mostrou-se capaz de reduzir a carga bacteriana em feridas de queimadura infectadas com P. aeruginosa e Escherichia coli em um ensaio clínico randomizado⁹.

O zebrafish (Danio rerio) emergiu recentemente como um modelo valioso para estudar infecções com vários patógenos, incluindo P. aeruginosa^10,11, Mycobacterium abscessus e Burkolderia cepacia^12,13. Ao microinjetar bactérias diretamente na circulação sanguínea do embrião¹⁴ é fácil estabelecer uma infecção sistêmica que é neutralizada pelo sistema imunológico inato de zebrafish, que é conservado evolutivo com neutrófilos e geração de macrófagos semelhante à contraparte humana. Além disso, durante o primeiro mês de vida, os embriões de zebrafish carecem da resposta imune adaptativa, tornando-os modelos ideais para estudar a imunidade inata, que é o mecanismo crítico de defesa em infecções pulmonares humanas¹⁵. O zebrafish surgiu recentemente como um poderoso sistema de modelo genético para entender melhor o início da CF e desenvolver novos tratamentos farmacológicos^10,,16,17. O modelo de zebrafish CF de cftr knock-down gerado com injeção de morfolino em zebrafish apresentou uma resposta de explosão respiratória amortecida e reduziu a migração de neutrófilo¹⁰, enquanto o nocaute do CFTR leva à posição do órgão interno prejudicada e à destruição do pâncreas exócrino, um fenótipo que espelha a doença humana^16,17. De maior interesse foi a constatação de que a carga bacteriana P. aeruginosa foi significativamente maior em embriões de perda de função cftrdo que em controles em 8 horas pós-infecção (hpi), o que paralelamente aos resultados obtidos com camundongos e células epiteliais brônquias humanas^2,,18.

Neste trabalho, demonstramos que a terapia de phage é eficaz contra infecções por P. aeruginosa em embriões de zebrafish.

Protocolo

Os zebrafish adultos (Danio rerio) da cepa AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) são mantidos de acordo com as diretrizes internacionais (Diretiva da UE 2010/63/UE) e nacionais (decreto italiano 4^de março de 2014, n. 26) sobre a proteção de animais usados para fins científicos. As condições padrão são definidas na instalação de peixes com um ciclo escuro de 14 horas/10 h e temperatura da água do tanque a 28° C.

1. Elaboração de soluções e ferramentas

1. Prepare uma solução de estoque de 50x e soluções de trabalho 1x para o meio de embrião E3 para embriões de zebrafish em crescimento (ver Tabela 1).
2. Faça solução de bloqueio de pigmentação, para bloquear a pigmentação do embrião a partir de 24 horas após a fertilização (24 hpf) (ver Tabela 1).
3. Prepare estoque de 25x e solução anestésica tricane de trabalho 1x, conforme descrito na Tabela 1.
   NOTA: Para evitar o congelamento e o descongelamento repetidos da solução que poderia danificar a solução de estoque, faça alíquotas de 2 mL de tricaine 25x e armazene-as a -20 °C.
4. Prepare as faixas para microinjeção de embriões dissolvendo 1 g de agarose em 100 mL de H₂O destilado em um frasco ou garrafa microwavable. Micro-ondas por 1-3 min até que a agarose esteja completamente dissolvida.
5. Posicione os moldes de microinjeção de zebrafish (ver Tabela de Materiais) virados de cabeça para baixo em uma placa de Petri (90 mm x 15 mm) e cubra toda a superfície derramando o gel líquido de agarose com uma largura de aproximadamente 10 mm.
6. Remova o molde assim que a agarose se solidificar. Encha a placa de Petri com 1x de meio de embrião E3. Isso pode ser armazenado a 4 °C por aproximadamente uma semana. Antes de usar, substitua pelo meio E3 fresco contendo Tricaine.
   NOTA: Moldes mais antigos podem desenvolver fungos ou contaminações bacterianas.
7. Use capilares de 10 cm polidos de fogo para preparar agulhas para microinjeção e fixá-las no puxador de micropipette apertando as alças. Ajuste o puxador com as seguintes configurações: calor 500, velocidade 100, tempo 150, puxe 150.

2. P. aeruginosa (PAO1) preparação inóculo

1. Inoculação 1 colônia de GFP⁺P. aeruginosa cepa PAO1¹⁹ em 5 mL de caldo LB (ver Tabela 1) e crescer durante a noite a 37 °C com agitação (200 rpm).
2. Diluir a cultura da noite para OD₆₀₀ = 0,1 em 10 mL de caldo LB e crescer para OD₆₀₀ = 0,5 a 37 °C com agitação (200 rpm).
3. Centrifugar 2 mL da cultura por 2 min a 4 °C a 16.100 x g e resuspengar a pelota celular para OD₆₀₀ = 1, equivalente a cerca de 1 x 10⁹ cfu/mL, em 1 mL da solução fisiológica (ver Tabela 1).
4. Diluir a suspensão celular para cerca de 5 x 10⁷cfu/mL em solução fisiológica e armazenar a 4 °C.

3. Preparação de estoque de phage

1. Inocular 1 colônia de P. aeruginosa cepa PAO1 em 5 mL de caldo LB e incubar durante a noite a 37 °C com agitação. Diluir a cultura da noite para_{OD 600} = 0,01 em 500 mL de caldo LB e crescer a 37 °C com agitação para OD₆₀₀ = 0,05, equivalente a cerca de 2,5 x 10⁷ cfu/mL.
2. À cultura diluída de P. aeruginosa,adicione cerca de 1,25 x 10⁷ phages, para obter a multiplicidade de infecção (M.O.I.) de 10^-3. Incubar a 37 °C com agitação até que o OD₆₀₀ caia para cerca de 0,1-0,3 (em cerca de 3 a 5 horas, dependendo do phage utilizado).
   NOTA: Foram selecionados quatro phages para este experimento que infectam a cepa PAO1: Dois Podoviridae, números de adesão do GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236 e vB_PaeP_DEV, MF490238, e dois Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 e vB_PaeM_E217, MF490240. Realize as etapas abaixo para cada phage individualmente.
3. Incubar o lysate com 1 mg/mL de DNase e RNase por 30 min a 37 °C. Centrifugar a 5.000 x g por 30 min a 4 °C e recuperar cuidadosamente o supernaspe (SN). Filtre o SN com um filtro com 0,8 μm de diâmetro de poros.
4. Ao SN, adicione 58 g/L de NaCl e 105 g/L de PEG6000. Dissolva-se com agitação em RT 20 min e, em seguida, mantê-lo durante a noite a 4 °C. Centrífuga a 20.000 x g por 30 min a 4 °C para precipitação de phage. Remova o SN e dissolva cuidadosamente a pelota de phage em 15 mL de tampão TN (ver Tabela 1).
5. Purifique os phages com gradiente de densidade CsCl, conforme descrito nas etapas abaixo.
   1. Em um tubo de ultracentrificação de poliallômero para rotor SW41, prepare um gradiente de densidade de passo CsCl estratificando 2 mL das quatro soluções CsCl descritas na Tabela 1.  Adicione 3,5 mL de suspensão de phage em cada um dos 4 tubos.
      NOTA: CsCl é tóxico, adotar procedimentos de segurança adequados para manuseá-lo e descartá-lo.
   2. Introduza os tubos no rotor e certifique-se de que os tubos estejam equilibrados (a diferença de peso entre os dois tubos voltados deve ser ≤ 0,01g).
   3. Centrifugar por 2h a 4 °C e 100 x g (25.000 rpm para rotor SW41). Após a centrifugação, remova lentamente os tubos e imobilize-os cuidadosamente em um suporte. Usando uma seringa com agulha de 19 G, elas desenhe a faixa branca/opalescente que está localizada geralmente entre a região de densidade d=1,5 e a d=1,4.
   4. Transfira as suspensões da seringa para novos tubos de polinômero para rotor SW60 e use a solução d=1.4 para equilibrar com precisão os tubos.
   5. Centrifugar a suspensão a 4 °C e 150.000 x g (38.000 rpm para o rotor SW60) por pelo menos 16 h.
   6. Colete a faixa visível como acima (ver passo 3.3.3) e transfira-as para tubos de diálise com 6.000 da cut-off. Dialise a faixa visível obtida 2x por 20 min contra 500 mL de água e durante a noite contra 500 mL de tampão TN. Filtrar com um filtro de poros de 0,22 μm e armazenar a 4 °C.

4. Preparação para coquetéis de phage

1. Faça uma mistura de quatro phages que infectam a cepa PAO1, anteriormente isolada e caracterizada⁸. Antes de misturar, estime o título de cada estoque de phage por ensaio de placa²⁰.
2. Monte o coquetel de phage, com um titer global de 5 × 10⁸ pfu/mL, misturando igualmente quatro preparações de phage no mesmo pfu/mL imediatamente antes de cada experimento, para garantir titulações phage precisas.

5. Coleta e preparação de embriões de zebrafish para microinjeção de morfolnos cftr

NOTA: Coletar 1-2 embriões de células de zebrafish tipo selvagem para microinjeção cftr morpholinos(cftr-MOs).

1. Dois dias antes do experimento de microinjeção bacteriana, configure pares de reprodução e colete embriões conforme descrito anteriormente²¹. Os zebrafish adultos (Danio rerio) da cepa AB foram comprados do European Zebrafish Resource Center, EZRC.
2. No dia seguinte, colete os embriões imediatamente após a fertilização com uma pipeta plástica ou usando um coador de malha fina. Coloque os embriões coletados em uma placa de Petri contendo meio embrião E3 e remova cuidadosamente os detritos com uma pipeta plástica para evitar contaminação que possa prejudicar o desenvolvimento do embrião.
3. Prepare 5 μL de solução de injeção de morfolino diluindo as duas soluções de estoque de morfolino (1 mM) em água estéril para uma concentração final de 0,25 pmol/embrião ATG-MO + 0,25 pmol/embrião-MO. Para rastrear a injeção de embrião, adicione 0,5 μL de fenol vermelho à mistura da solução de injeção de morfolino.
4. Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL da solução de mistura de morfelino usando uma micropipette de 20 μL com uma ponta de carregamento de gel fino. Fixar a agulha no micromanípulo conectado a um suporte e posicioná-la sob um estereótipo.
   NOTA: Não é necessário que a solução atinja a ponta da agulha, pois a pressão da bomba microinjetor irá empurrá-la.
5. Corte a ponta da agulha cortando a ponta da agulha com pinças finas e estéreis. Meça o diâmetro da gota usando uma barra de escala no ocular do microscópio. Alternativamente, crie uma gota de óleo mineral em um slide de micrômetro e ajuste o volume de microinjeção injetando a solução na gota de óleo para avaliar o tamanho da gotícula. Use uma gota com um diâmetro de 156 μm para injetar um volume de 2 nL.
6. Ajuste o microinjetor ajustando a pressão de compensação para 15 hPa, tempo de injeção para 0,5 s e pressão de injeção entre 300 e 600 hPa para obter o volume correto de injeção dependendo da agulha utilizada.
7. Com uma pipeta plástica organize os embriões da etapa 5.2 em um vidro posicionado em uma placa de Petri de 96 mm de diâmetro.
   NOTA: Muito meio E3 impedirá a penetração adequada da agulha de microinjeção na coro dos embriões.
8. Penetre o acorde e, em seguida, a gema com a agulha para injetar 2 nL no embrião como descrito anteriormente²².
9. Coloque embriões injetados em uma placa de Petri com meio E3 e coloque-os em uma incubadora a 28 °C para deixá-los se desenvolver até o dia seguinte.

6. Microinjeção de embriões de zebrafish com bactérias e coquetel de phage

NOTA: Para realizar uma infecção sistêmica, o embrião deve ter circulação sanguínea que geralmente começa após 26 hpf.

1. Após 26 hpf (para estágios de desenvolvimento de zebrafish, consulte Kimmel²¹) embriões descorrionatos com solução de pronase preparados pela dissolução do pó de pronase em meio E3 a uma concentração de 2 mg/mL. Pipeta suavemente os embriões para quebrar o acorde. Descarte o meio pronase/E3 e enxágue o prato várias vezes com E3 fresco para remover toda a pronase.
2. Anesthetize embriões de zebrafish em E3 médio contendo Tricaine aproximadamente 5 minutos antes das injeções.
3. Pipeta os embriões anestesiados na pista preparados na etapa 1. Use uma ponta de carregamento de gel fino para forrar os embriões na posição lateral.
4. Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL da preparação de P. aeruginosa conforme descrito na parte 5.
5. Insira a agulha dorsalmente ao ponto de partida do duto de Cuvier, onde ela começa a se espalhar sobre o saco de gema. Injete um volume de 1-3 nL e certifique-se de que o volume se expanda diretamente dentro do duto e entre na circulação.
6. Aproximadamente após cada 50 embriões injetados, injete uma gota da bactéria em um tubo de centrífuga de 1,5 mL com 100 μL de PBS estéril para verificar se o volume de injeção permanece o mesmo. Emplaque o inóculo no ágar LB (ver Tabela 1) a 37 °C durante a noite para avaliar a UFC.
7. Transfira os embriões microinjetados em duas placas de Petri limpas com e3 médio fresco + PTU e incuba-os a 28 °C.
8. Em dois pontos de tempo selecionados: 30 min ou 3 h após a injeção bacteriana, retire uma das placas de Petri com embriões injetados por bactérias da incubadora e alinhe-os na pista, conforme descrito em 6.3 para a injeção de coquetel phage.
9. Carregue uma agulha de microinjeção com aproximadamente 5 μL do coquetel de phage (preparado na etapa 4) com uma ponta de carregamento de gel fino e fixe-a no microinjetor (ver passo 5).
10. Injete o coquetel de phage no duto de Cuvier dos embriões previamente injetados com bactérias.
11. Transfira os embriões microinjetados em duas placas de Petri limpas com e3 médio fresco + PTU e incuba-os a 28 °C.

7. Avaliação da carga bacteriana de embriões injetados com PAO1 e phages

1. A 8 hpi, pipeta 15 embriões anestesiados da placa de Petri para um tubo de centrífugas de 1,5 mL.
2. Substitua a solução anestésica por 300 μL de 1% Triton X-100 em PBS (PBSTritonX) e homogeneize os embriões passando-os pelo menos 15x através de uma seringa de insulina com uma agulha estéril de 27 G.
3. Prepare diluições seriais de homogeneizadores em PBS estéreis transferindo 100 μL do homogenate diluído em 900 μL de PBS estéril.
4. Para selecionar para a cepa PAO1 naturalmente resistente, a placa 100 μL das diluições no ágar LB adicionada com ampicillina (100 μg/mL) e incubar a 37 °C durante a noite.
5. No dia seguinte, conte o número de colônias, multiplique pelo fator de diluição para determinar o número total de UFC, e divida pelo número de embriões homogeneizados para obter o número médio de UFC/embrião infectado.

8. Avaliação da letalidade dos embriões injetados com PAO1 e phages

1. Para avaliar a letalidade da infecção por PAO1, escore os embriões injetados em 20 hpi sob um estereótipo e conte para os embriões mortos (branco/não transparente).
2. Calcule a dose de concentração letal semi-máxima de 50 (LD50) de PAO1 que determina a morte de 50% dos embriões injetados a 20 hpf.

9. Preparação embrionária para imagens de lapso de tempo estereomicroscope da infecção por GFP⁺ PAO1

1. Prepare o molde para imagens de embriões vivos dissolvendo 1,5% de baixa agarose de fusão em 100 mL de solução E3.
2. Adicione 1% de Tricaine (ver Tabela 1) para anestesiar os embriões.
3. A 4 hpi transfira um embrião com uma pipeta de plástico em um prato de fundo de vidro e adicione a solução agarose de ponto de fusão baixa quente.
4. Posicione a placa de fundo de vidro sob um estereótipo e com uma ponta posicione o embrião na orientação desejada. Use uma pipeta de plástico para adicionar cuidadosamente uma gota de agarose no embrião.
5. Deixe a agarose esfriar por 5-10 min e encha delicadamente o prato de fundo de vidro com E3 contendo a solução anestésica para manter o embrião úmido.
6. Coloque a antena inferior de vidro com o embrião sob o estereóscópio fluorescente com um filtro fluorescente (canal 488 nm) para bactérias GFP^+. Não remova a placa de Petri até novas aquisições com os mesmos parâmetros de 9, 14 e 18 cv.

10. Análises de expressão de citocinas pró-inflamatórias

1. A 20 hpi anestesia os embriões com solução tricaine 1x e transfira-os da placa de Petri para um tubo de centrífugas de 1,5 mL.
2. Sob um capô de fumaça remova a solução anestéstica e substitua por 200 μL de reagente de cloridrato de guanidium.
3. Homogeneize os embriões ao pipetá-los repetidamente através de uma pipeta de 200 μL primeiro e, em seguida, pelo menos 15x com uma seringa de insulina com uma agulha estéril de 27 G.
4. Extrair RNA total de embriões homogeneizados de zebrafish usando um reagente de cloridrato de guanidium comercialmente disponível de acordo com as instruções do fabricante.
5. Trate 1 μg de cada amostra de RNA com 2 μL de 1U/μL de DNase I (sem RNase), seguindo as instruções do fabricante.
6. Use 1 μg de RNA tratado DNase I para reação de transcrição reversa (RT) usando kit comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais),em um volume total de 20 μL de acordo com as instruções do fabricante.
7. Execute a reação qPCR RT em um volume total de 10 μL contendo 1x SYBR Green mastermix usando 1,5 μL de uma diluição de 1:6 da reação RT. Para fins de normalização, use os primers para os genes de manutenção da casa rpl8 e para citocinas pró-inflamatórias, use primers para TNF-α e IL-1β (ver Tabela 2). o protocolo qPCR foi: ciclo 1 passo 1: 95 °C, 2 min, repetir uma vez; ciclo 2: passo 1 95 °C, 10 s, passo 2 55 °C, 30 s, repetir 40x; ciclo 3: passo 1 72 °C, 15 min.

Resultados

Os resultados e os números aqui apresentados são encaminhados aos embriões cf gerados através da injeção de morfoolinos cftr como descrito anteriormente¹⁰ e na etapa 5. Para validar o fenótipo cf, considerou-se a posição prejudicada de órgãos internos como coração, fígado e pâncreas, conforme descrito anteriormente¹⁷ (Figura 1). Resultados semelhantes foram obtidos no caso dos embriões WT, conforme relatado em nossa pub...

Discussão

Neste manuscrito, descrevemos o protocolo para realizar a infecção por P. aeruginosa (PAO1) em embriões de zebrafish e como aplicar a terapia de phage com um coquetel de phages previamente identificado como capaz de infectar PAO1 para resolvê-lo. O uso de bacteriófagos como alternativa aos tratamentos com antibióticos tem sido de crescente interesse desde os últimos anos. Isso se deve principalmente à difusão de infecções bacterianas multidrogas resistentes (MDR), que constituem um problema sério par...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	BD	214010
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
CsCl	Sigma-Aldrich	289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich	886-86-2	common name tricaine
Femtojet Micromanipulator	Eppendorf	5247
Fleming/brown P-97	Sutter Instrument Company	P-97
LE-Agarose	Sigma-Aldrich	11685660001
Low Melting Agarose	Sigma-Aldrich	CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Methyl Blue	Sigma-Aldrich	28983-56-4
Microinjection needles	Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98%	Aldrich-P7629	103-85-5
Oligo Morpholino	Gene Tools		designed by the researcher
PEG6000	Calbiochem	528877
Phenol Red Solution	Sigma-Aldrich	CAS 143-74-B
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Pronase	Sigma-Aldrich	9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	S9888
Stereomicroscope	Leica	S9I
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tryptone	Oxoid	LP0042B
Yeast extract	Oxoid	LP0021B
Z-MOLDS Microinjection	Word Precision Instruments