JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Представлено здесь протокол для Pseudomonas aeruginosa инфекции и фаг терапии применения в муковисцидоз (CF) эмбрионов зебры.

Аннотация

Устойчивость к противомикробным препаратам, которое является одним из основных следствий диагностической неопределенности и чрезмерной предписания противомикробных препаратов, является все более признанной причиной тяжелых инфекций, осложнений и смертности во всем мире, что оказывает огромное воздействие на наше общество и систему здравоохранения. В частности, пациенты с ослабленной иммунной системой или уже существующими и хроническими патологиями, такими как муковисцидоз (CF), подвергаются частым антибиотикам для борьбы с инфекциями с появлением и распространением мультирезистентных изолятов. Поэтому существует настоятельная необходимость в решении альтернативных методов лечения для противодействия бактериальным инфекциям. Использование бактериофагов, естественных врагов бактерий, может быть возможным решением. Протокол, подробно описанный в этой работе, описывает применение фаговой терапии против инфекции Pseudomonas aeruginosa в эмбрионах зебры. Эмбрионы зебры были инфицированы P. aeruginosa, чтобы продемонстрировать, что фаг-терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa, поскольку она снижает летальность, бактериальное бремя и провоспалительный иммунный ответ в эмбрионах CF.

Введение

Фаге терапии, использование естественных врагов бактерий для борьбы с бактериальными инфекциями, набирает новый интерес, как бактериальная устойчивость к антибиотикамстановится широко распространенным 1,2. Эта терапия, используемая в течение десятилетий в Восточной Европе, можно считать дополнительным лечением антибиотиков в лечении легочных инфекций у пациентов с CF и возможной терапевтической альтернативой для пациентов, инфицированных бактериями, которые устойчивы ко всем используемым в настоящее времяантибиотикам 2,3. Преимущества антибиотикотерапии в том, что бактериофагы размножаются на месте инфекции, в то время как антибиотики метаболизируются ивыбывают из организма 4,,5. Действительно, администрирование коктейлей вирулентных фагов, изолированных в различных лабораториях, оказалось эффективным в лечении инфекций Pseudomonas aeruginosa в животных моделях, таких как насекомыеи млекопитающие 6,7,8. Фаге терапии было также показано, чтобы быть в состоянии уменьшить бактериальную нагрузку в ожоговых ран, инфицированных P. aeruginosa и Escherichia coli в рандомизированных клиническихиспытаний 9.

Зебрафиш(Danio rerio) недавно стала ценной моделью для изучения инфекций с несколькими патогенами, в том числе P. aeruginosa10,11, Mycobacterium abscessus и Burkolderia cepacia12,13. Путем микроинъекций бактерий сразу вциркуляцию крови зародыша 14 легко установить системную инфекцию которая противодействована зебрафиш врожденной иммунной системой, которая эволюционирована сохранена с нейтрофилами и поколением макрофагов подобно к людским двойнику. Кроме того, в течение первого месяца жизни эмбрионы зебры не имеют адаптивного иммунного ответа, что делает их идеальными моделями для изучения врожденного иммунитета, который является критическим защитным механизмом в легочныхинфекциях человека 15. Зебрафиш недавно появилась как мощная генетическая модель системы, чтобы лучше понять начало CF и разработать новыефармакологические методы лечения 10,,16,17. CF зебрафиш модель cftr нокдаун генерируется с морфолино инъекции в зебрафиш представил смоченной реакции респираторного всплеска и снижениемиграции нейтрофилов 10, в то время как cftr нокаут приводит к нарушению внутреннего положения органа и разрушение экзокринной поджелудочной железы, фенотип, которыйотражает болезни человека 16,17. Наибольший интерес представляет вывод о том, что бактериальная нагрузка P. aeruginosa была значительно выше в cftr-потеря-функции эмбрионов, чем в контроле на 8 часов после заражения (hpi), который параллели результаты, полученные с мышами и человека бронхиальных эпителиальныхклеток 2,18. cftr

В этой работе мы демонстрируем, что фаг-терапия эффективна против инфекций P. aeruginosa у эмбрионов зебры.

протокол

Взрослые зебры(Danio rerio) из штамма AB (Европейский ресурсный центр Зебрафиш E'RC) поддерживаются в соответствии с международными (Директива ЕС 2010/63/EU) и национальными руководящими принципами(итальянский указ от 4 марта 2014 года, n. 26) о защите животных, используемых в научных целях. Стандартные условия устанавливаются на рыбном объекте с 14 ч темного цикла света/10 ч и температурой воды в резервуаре при температуре 28 градусов по Цельсию.

1. Подготовка решений и инструментов

  1. Подготовье 50-х стокового раствора и 1x рабочих решений для среды эмбриона E3 для выращивания эмбрионов зебры (см. таблицу 1).
  2. Сделать пигментации блокирующий раствор, чтобы блокировать пигментацию эмбриона от 24 часов после оплодотворения (24 л.с.) (см. таблицу 1).
  3. Подготовка 25x акции и 1x рабочий трикан обезболивающее решение, как описано в таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать повторного замораживания и оттаивания раствора, который может повредить фондовый раствор, сделать aliquots 2 мл 25x tricaine и хранить их при -20 градусов по Цельсию.
  4. Подготовка треков для микроинъекции эмбриона путем растворения 1 г агарозы в 100 мл дистиллированной H2O в микроволновой колбе или бутылке. Микроволновая печь в течение 1-3 мин, пока агароза полностью не растворит.
  5. Позиция зебры микроинъекции формы (см. Таблица материалов) перевернулся в чашке Петри (90 мм х 15 мм) и покрыть всю поверхность, наливая жидкий гель агарозы с шириной около 10 мм.
  6. Удалите плесень после того, как агароза затвердевла. Заполните чашку Петри 1x E3 среды эмбриона. Это может храниться при 4 градусов по Цельсию в течение примерно одной недели. Перед использованием замените свежей средой E3, содержащей Tricaine.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старые формы могут развиваться грибки или бактериальных загрязнений.
  7. Используйте огонь полированной 10 см борозиликат капилляры для подготовки иглы для микроинъекции и закрепить их в micropipette шкив, затягивая ручки. Установите шкив со следующими настройками: тепло 500, скорость 100, время 150, тянуть 150.

2. P. aeruginosa (PAO1) инокулум препарат

  1. Привить 1 колониюGFPиP. aeruginosa штамм PAO119 в 5 мл бульона LB (см. таблицу 1) и расти на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской (200 об/мин).
  2. Разбавить выше ночной культуры до OD600 и 0,1 в 10 мл бульона LB и расти до OD600 и 0,5 при 37 градусов по Цельсию со тряской (200 об / мин).
  3. Центрифуга 2 мл культуры в течение 2 мин при 4 градусов по Цельсию при 16100 х г и повторное разрешение клеточной гранулы на OD600 и 1, что эквивалентно примерно 1 х 109 cfu/mL, в 1 мл физиологического раствора (см. таблицу 1).
  4. Разбавить клеточной суспензией примерно до 5 х10 7кфу/мл в физиологическом растворе и хранить при 4 градусах Цельсия.

3. Подготовка запасов фаге

  1. Прививка 1 колонии P. aeruginosa штамм PAO1 в 5 мл бульона LB и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию со тряской. Разбавить ночную культуру доOD 600 и 0,01 в 500 мл бульона LB и расти при 37 градусов по Цельсию со встряхивания до OD600 и 0,05, что эквивалентно около 2,5 х 107 cfu/mL.
  2. К разбавленной культуре P. aeruginosa,добавить около 1,25 х10 7 фагов, чтобы получить множественность инфекции (M.O.I.) от 10-3. Инкубировать при 37 градусов по Цельсию с встряхивания до OD600 падает примерно до 0,1-0,3 (примерно в 3 до 5 ч, в зависимости от используемого фагома).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Четыре фага были отобраны для этого эксперимента, которые заражают штамм PAO1: Два Podoviridae, GenBank присоединения номера vB_PaeP_PYO2, MF490236, и vB_PaeP_DEV, MF490238, и два Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241, и vB_PaeM_E217, MF490240. Выполните следующие шаги для каждого фагов по отдельности.
  3. Инкубировать лизат с 1 мг/мл DNase и RNase в течение 30 мин при 37 градусов по Цельсию. Центрифуга при 5000 х г в течение 30 мин при 4 градусов по Цельсию и тщательно восстановить супернатант (SN). Фильтр SN с фильтром, имеющих диаметр поры 0,8 мкм.
  4. В SN добавьте 58 г/л NaCl и 105 г/л PEG6000. Растворите с перемешиванием на RT 20 мин, а затем держать его на ночь при 4 градусов по Цельсию. Центрифуга при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 градусах цельсия для выпадения фагов. Удалите SN и тщательно растворите фаговую гранулу в 15 мл буфера TN (см. таблицу 1).
  5. Очистить фагов градиентом плотности CsCl, как описано в шагах ниже.
    1. В полиалломерных ультрацентрифугных трубках для ротора SW41 подготовьтесь градиент плотности шага CsCl, расслоив 2 мл из четырех решений CsCl, описанных в таблице 1.  Добавьте 3,5 мл фаговой подвески в каждую из 4 трубок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: CsCl является токсичным, принять надлежащие процедуры безопасности для обработки и отказаться от него.
    2. Ввести трубки в ротор и убедитесь, что трубы сбалансированы (разница в весе между двумя облицовочных трубок должна быть ≤ 0,01 г).
    3. Центрифуга для 2 ч при 4 кк и 100 000 х г (25 000 об/мин для ротора SW41). После центрифугации медленно снимите трубки и тщательно обездвижйте их на опоре. Используя шприц с иглой 19 G, нарисуйте белую/опалесцентную полосу, которая обычно находится между областью плотности d'1.5 и d'1.4.
    4. Перенесите подвески из шприца в новые полиалломеры для ротора SW60 и используйте раствор d'1.4, чтобы точно сбалансировать трубки.
    5. Центрифуга подвески при 4 градусах Цельсия и 150 0000 х г (38 000 об/мин для ротора SW60) не менее 16 ч.
    6. Соберите видимую полосу, как указано выше (см. шаг 3.3.3) и перенесите их в диализные трубки с 6000 Da cut-off. Dialyze получил видимый диапазон 2x в течение 20 минут против 500 мл воды и на ночь против 500 мл буфера TN. Фильтр с фильтром поры 0,22 мкм и хранить при 4 градусов по Цельсию.

4. Приготовление коктейлей Фаге

  1. Сделать смесь из четырех фагов, которые заражают штамм PAO1, ранее изолированных и характеризуется8. Перед смешиванием, оценить titer каждого фагового запаса по налету анализ20.
  2. Соберите фаг коктейль, с общим титр 5 × 108 pfu/mL, в равной степени смешивания четырех фагов препаратов в том же pfu/mL непосредственно перед каждым экспериментом, чтобы обеспечить точный фаг титры.

5. Сбор и подготовка эмбрионов зебры для микроинъекции cftr morpholinos

ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите 1-2 клеточных эмбрионов из диких зебры типа для микроинъекции cftr morpholinos(cftr-MOs).

  1. За два дня до бактериального эксперимента микроинъекции, создать размножения пар и собирать эмбрионы, как описаноранее 21. Взрослые зебры(Danio rerio)штамма AB были приобретены у Европейского ресурсного центра Зебрафиш, E'RC.
  2. На следующий день после этого, собирать эмбрионы сразу после оплодотворения с пластиковой пипеткой или с помощью тонкой сетки ситечко. Поместите собранные эмбрионы в чашку Петри, содержащую E3 эмбриона среды и тщательно удалить мусор с пластиковой пипетки, чтобы избежать загрязнения, которые могут повредить развитию эмбриона.
  3. Приготовьте 5 мкл раствора для инъекций морфолино, разбавляя два раствора морфолино (1 мМ) в стерильной воде до конечной концентрации 0,25 пмоль/эмбрион ATG-MO - 0,25 пмоль/зародыш-МО. Чтобы проследить инъекцию эмбриона, добавьте 0,5 МКЛ фенола красного цвета в смесь раствора для инъекций морфолино.
  4. Загрузите микроинъекцию иглы с приблизительно 5 йл раствора смеси морфолино с помощью микропипетта 20 йл с тонкой наконечником загрузки геля. Закрепите иглу к микроманипулятору, подключенному к стенду, и располите ее под стереомикроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно, что раствор достигает кончика иглы, как давление микроинъектор насос будет толкать его.
  5. Отрежь кончик иглы, разрезав кончик иглы мелким стерильным пинцетом. Измерьте диаметр капли с помощью планки шкалы в глазу микроскопа. Кроме того, создать каплю минерального масла на микрометровый слайд и установить объем микроинъекции путем введения раствора в масляной капли для оценки размера капли. Используйте каплю диаметром 156 мкм, чтобы ввести объем 2 нл.
  6. Установите микроинъектор, регулируя давление компенсации до 15 hPa, время впрыска до 0,5 с, и давление впрыска между 300 и 600 hPa, чтобы получить правильный объем впрыска в зависимости от используемой иглы.
  7. С помощью пластиковой пипетки расположить эмбрионы от шага 5,2 на стекло, расположенное в 96 мм диаметром Петри блюдо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком много E3 среды предотвратит надлежащее проникновение микроинъекции иглы в хорион эмбрионов.
  8. Проникнуть в хорион, а затем желток с иглой, чтобы ввести 2 nL в эмбрион, как описаноранее 22.
  9. Поместите вводимые эмбрионы в чашку Петри со средой E3 и поместите их в инкубатор при 28 градусов по Цельсию, чтобы они развивались до следующий день.

6. Микроинъекция эмбрионов зебры с бактериями и фагом коктейля

ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения системной инфекции, эмбрион должен иметь кровообращение, которое обычно начинается после 26 л.с.

  1. После 26 л.с. (для стадий развития зебры относятся к Kimmel21) дехорионат эмбрионов с проназовым раствором, приготовленным путем растворения проназового порошка в среде E3 при концентрации 2 мг/мл. Аккуратно пипетки эмбрионов, чтобы сломать хорион. Откажитесь от проназе/E3 среды и промыть блюдо несколько раз со свежим E3, чтобы удалить все проназе.
  2. Анестезировать эмбрионы зебры в E3 среде, содержащей Tricaine примерно за 5 минут до инъекций.
  3. Пипетты обасыть эмбрионы в трек подготовлен в шаге 1. Используйте тонкий гель загрузки отзыв линии эмбрионов в боковом положении.
  4. Загрузите микроинъекцию иглы примерно с 5 йл препарата P. aeruginosa, как описано в части 5.
  5. Вставьте иглу dorsally к отправной точке протока Кювье, где он начинает распространяться по желтковому мешку. Ввимит объем 1-3 нл и убедитесь, что объем расширяется непосредственно внутри протока и попадает в циркуляцию.
  6. Приблизительно после каждых 50 инъекций эмбриона, введать каплю бактерий в 1,5 мл центрифуги трубки с 100 йл стерильных PBS, чтобы проверить, если объем инъекции остается прежним. Плита инокулум на LB агар (см. таблицу 1) при 37 градусов по Цельсию ночь для оценки CFU.
  7. Перенесите микроинъектированные эмбрионы в две чистые чашки Петри со свежимИ E3 средними и инкубировать их при 28 градусов по Цельсию.
  8. В двух выбранных точках времени: 30 мин или 3 ч после бактериальной инъекции, вынюхить одну из чашек Петри с бактериальными инъекционными эмбрионами из инкубатора и выровнять их в треке, как описано в 6.3 для инъекции фагового коктейля.
  9. Загрузите микроинъекцию иглы примерно с 5 мкл фагового коктейля (подготовленного в шаге 4) с тонкой наконечником загрузки геля и закрепите его на микроинжектор (см. шаг 5).
  10. Ввимить фаг-коктейль в проток Кювье эмбрионов, ранее введенных с бактериями.
  11. Перенесите микроинъектированные эмбрионы в две чистые чашки Петри со свежимИ E3 средними и инкубировать их при 28 градусов по Цельсию.

7. Оценка бактериального бремени эмбрионов, вводимых с помощью ПАО1 и фагов

  1. На 8 л.с., пипетка 15 анестезировал эмбрионов от чашки Петри до 1,5 мл центрифуги трубки.
  2. Замените обезболивающее решение на 300 МЛ 1% Triton X-100 в PBS (PBSTritonX) и гомогенизируйте эмбрионы, передав их по крайней мере 15x через инсулиновый шприц со стерильной иглой 27-G.
  3. Подготовка серийных разбавлений гомогенатов в стерильных PBS путем передачи 100 йл разбавленного гомогената в 900 МЛ стерильных PBS.
  4. Чтобы выбрать для естественно ампер-резистентного штамма PAO1, пластина 100 МКЛ разбавления на Агаре LB добавляется с ампициллином (100 мкг/мл), и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение ночи.
  5. На следующий день, подсчитайте количество колоний, умножить на фактор разбавления, чтобы определить общее число CFU, и разделить на количество эмбрионов гомогенизированных для получения среднего числа CFU / инфицированных эмбрионов.

8. Оценка летальности эмбрионов, вводимых с помощью ПАО1 и фагов

  1. Чтобы оценить летальность инфекции PAO1, оценка инъекционных эмбрионов на 20 л.с. под стереомикроскопом и рассчитывать на мертвых эмбрионов (белый / не прозрачный).
  2. Рассчитайте половину максимальной смертельной концентрации 50 (LD50) дозы PAO1, которая определяет смерть 50% инъекционных эмбрионов при 20 л.с.

9. Подготовка эмбрионов к стереомикроскопу замедленной визуализацииинфекции GFP и PAO1

  1. Препарировать форму для живого эмбриона изображения путем растворения 1,5% низкой плавления агарозы в 100 мл раствора E3.
  2. Добавьте 1% Tricaine (см. таблицу 1) для обезболивать эмбрионы.
  3. При 4 л.с. перенесите один эмбрион с пластиковой пипеткой в стеклянную нижнюю тарелку и добавьте теплый низкоплавильный раствор агарозы.
  4. Распоить стеклянное дно блюда под стереомикроскопом и с кончиком положения эмбриона в нужной ориентации. Используйте пластиковую пипету, чтобы аккуратно добавить каплю агарозы на эмбрион.
  5. Пусть агароза остыть в течение 5-10 минут и аккуратно заполнить стеклянное дно блюдо с E3, содержащий анестезии раствор, чтобы сохранить эмбрион влажным.
  6. Поместите стеклянную нижнюю тарелку с эмбрионом под флуоресцентный стереомикроскоп с флуоресцентным фильтром (канал 488 нм) длябактерий GFP. Не снимите чашку Петри до дальнейших приобретений с теми же параметрами на 9, 14 и 18 л.с.

10. Экспрессионистский анализ провоспалительных цитокинов

  1. При 20 л.с. анестезирует эмбрионы раствором трикаина 1x и перенесите их из чашки Петри в центрифугу 1,5 мл.
  2. Под дымовой капот снимите обезболивающее раствор и замените 200 МКЛ гидрохлоридного реагента гуанидия.
  3. Гомогенизировать эмбрионы, трубя их повторно через 200 мкл пипетки, а затем по крайней мере 15x с инсулиновым шприцем со стерильной иглой 27 G.
  4. Извлекайте полную РНК из гомогенизированных эмбрионов зебры с использованием коммерчески доступных гидрохлоридных реагентов гуанидия в соответствии с инструкциями производителя.
  5. Лечить 1 мкг каждого образца РНК с 2 йл 1U / йл DNase I (RNase-бесплатно), следуя инструкциям производителя.
  6. Используйте 1 мкг DNase я лечил РНК для обратной транскрипции реакции (RT) с использованием коммерчески доступного комплекта (см. Таблица материалов), в общем объеме 20 йл в соответствии с инструкциями производителя.
  7. Выполните реакцию RT qPCR в общем объеме 10 ЗЛ, содержащую 1x SYBR Green mastermix с использованием 1,5 МЛ 1:6 разбавления реакции RT. Для целей нормализации используйте праймеры для хранения генов rpl8 и провоспалительных цитокинов, используйте праймеры для TNF-α и IL-1 (см. таблицу 2). qPCR протокол был: цикл 1 шаг 1: 95 КК, 2 мин, повторить один раз; цикл 2: шаг 1 95 градусов по Цельсию, 10 с, шаг 2 55 градусов по Цельсию, 30 с, повторите 40x; цикл 3: шаг 1 72 КК, 15 мин.

Результаты

Результаты и цифры, представленные здесь, ссылаются на эмбрионы CF, генерируемые путем инъекции cftr morpholinos,как описано ранее 10 и в шаге 5. Для проверки фенотипа CF были рассмотрены нарушения положения внутренних органов, таких как сердце, печень иподжелудочная же...

Обсуждение

В этой рукописи мы описали протокол для выполнения P. aeruginosa (PAO1) инфекции в эмбрионах зебры и как применять фаг терапии с коктейлем фагов ранее определены как способные заразить PAO1, чтобы решить ее. Использование бактериофагов в качестве альтернативы лечению антибиотиками представ...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Итальянским фондом муковисцидоза (FFC No22/2017; Ассоциазионе "Gli amici della Ritty" Casnigo и FFC No23/2019; Un respiro в Пио Онлус Ла Мано теса Онлус).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Bacto AgarBD214010
Calcium chlorideSigma-Aldrich10043-52-4
CsClSigma-Aldrich289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBSSigma-AldrichD8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonateSigma-Aldrich886-86-2common name tricaine
Femtojet MicromanipulatorEppendorf5247
Fleming/brown P-97Sutter Instrument CompanyP-97
LE-AgaroseSigma-Aldrich11685660001
Low Melting AgaroseSigma-AldrichCAS 9012-36-6
Magnesium sulfateSigma-Aldrich7487-88-9
Methyl BlueSigma-Aldrich28983-56-4
Microinjection needlesHarvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98%Aldrich-P7629103-85-5
Oligo MorpholinoGene Toolsdesigned by the researcher
PEG6000Calbiochem528877
Phenol Red SolutionSigma-AldrichCAS 143-74-B
Potassium chlorideSigma-Aldrich7447-40-7
PronaseSigma-Aldrich9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0%Sigma-AldrichS9888
StereomicroscopeLeicaS9I
Tris HClSigma-AldrichT5941
Triton XSigma-AldrichT9284
TryptoneOxoidLP0042B
Yeast extractOxoidLP0021B
Z-MOLDS MicroinjectionWord Precision Instruments

Ссылки

  1. Cisek, A. A., Dąbrowska, I., Gregorczyk, K. P., Wyżewski, Z. Phage Therapy in Bacterial Infections Treatment: One Hundred Years After the Discovery of Bacteriophages. Current Microbiology. 74 (2), 277-283 (2017).
  2. Trend, S., Fonceca, A. M., Ditcham, W. G., Kicic, A., Cf, A. The potential of phage therapy in cystic fibrosis: Essential human-bacterial-phage interactions and delivery considerations for use in Pseudomonas aeruginosa-infected airways. Journal of Cystic Fibrosis. 16 (6), 663-667 (2017).
  3. Pacios, O., et al. Strategies to combat multidrug-resistant and persistent infectious diseases. Antibiotics. 9 (2), 65 (2020).
  4. Dubos, R. J., Straus, J. H., Pierce, C. The multiplication of bacteriophage in vivo and its protective effect against an experimental infection with shigella dysenteriae. Journal of Experimental Medicine. 78 (3), 161-168 (1943).
  5. Marza, J. A. S., Soothill, J. S., Boydell, P., Collyns, T. A. Multiplication of therapeutically administered bacteriophages in Pseudomonas aeruginosa infected patients. Burns. 32 (5), 644-656 (2006).
  6. Heo, Y. J., et al. Antibacterial efficacy of phages against Pseudomonas aeruginosa infections in mice and Drosophila melanogaster. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01646 (2009).
  7. McVay, C. S., Velásquez, M., Fralick, J. A. Phage therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in a mouse burn wound model. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 01028 (2007).
  8. Forti, F., et al. Design of a broad-range bacteriophage cocktail that reduces Pseudomonas aeruginosa biofilms and treats acute infections in two animal models. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02573 (2018).
  9. Jault, P., et al. Efficacy and tolerability of a cocktail of bacteriophages to treat burn wounds infected by Pseudomonas aeruginosa (PhagoBurn): a randomised, controlled, double-blind phase 1/2 trial. Lancet Infectious Diseases. 19 (1), 35-45 (2019).
  10. Phennicie, R. T., Sullivan, M. J., Singer, J. T., Yoder, J. A., Kim, C. H. Specific resistance to Pseudomonas aeruginosa infection in zebrafish is mediated by the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Infections and Immunity. 78, 4542-4550 (2010).
  11. Clatworthy, A. E., et al. Pseudomonas aeruginosa infection of zebrafish involves both host and pathogen determinants. Infections and Immunity. 77, 1293-1303 (2009).
  12. Bernut, A., et al. CFTR Protects against Mycobacterium abscessus Infection by Fine-Tuning Host Oxidative Defenses. Cell Reports. 26 (7), 1828-1840 (2019).
  13. Semler, D. D., Goudie, A. D., Finlay, W. H., Dennis, J. J. Aerosol phage therapy efficacy in Burkholderia cepacia complex respiratory infections. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. , 02388 (2014).
  14. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  15. Doring, G., Gulbins, E. Cystic fibrosis and innate immunity: how chloride channel mutations provoke lung disease. Cellular Microbiology. 11, 208-216 (2009).
  16. Navis, A., Bagnat, M. Loss of cftr function leads to pancreatic destruction in larval zebrafish. Developmental Biology. 399, 237-248 (2015).
  17. Navis, A., Marjoram, L., Bagnat, M. Cftr controls lumen expansion and function of Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 140, 1703-1712 (2013).
  18. Balloy, V., et al. Normal and cystic fibrosis human bronchial epithelial cells infected with Pseudomonas aeruginosa exhibit distinct gene activation patterns. PLoS One. 10, 0140979 (2015).
  19. Cafora, M., et al. Phage therapy against Pseudomonas aeruginosa infections in a cystic fibrosis zebrafish model. Science Reports. 9, 1527 (2019).
  20. Hershey, A. D., Kalmanson, G. M., Bronfenbrenner, J. Quantitative methods in the study of the phage-antiphage reaction. Journal of Immunology. 46, 267-279 (1943).
  21. Kimmel, C., Ballard, W., Kimmel, S., Ullmann, B., Schilling, T. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203, 253-310 (1995).
  22. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115 (2009).
  23. Traver, D., et al. The Zebrafish as a Model Organism to Study Development of the Immune System. Advances in Immunology. 81, 253-330 (2003).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

159Pseudomonas aeruginosa

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены