Aplicación de terapia de phage para contrarrestar la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de peces cebra de fibrosis quística

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para la infección por Pseudomonas aeruginosa y la aplicación de terapia de fagos en embriones de peces cebra de fibrosis quística (CF).

Resumen

La resistencia a los antimicrobianos, una consecuencia importante de la incertidumbre diagnóstica y la sobrescripción antimicrobiana, es una causa cada vez más reconocida de infecciones graves, complicaciones y mortalidad en todo el mundo con un enorme impacto en nuestra sociedad y en el sistema de salud. En particular, los pacientes con sistemas inmunitarios comprometidos o patologías preexistentes y crónicas, como la fibrosis quística (CF), son sometidos a frecuentes tratamientos antibiótico para controlar las infecciones con la aparición y difusión de aislados multirresistentes. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de abordar terapias alternativas para contrarrestar las infecciones bacterianas. El uso de bacteriófagos, los enemigos naturales de las bacterias, puede ser una posible solución. El protocolo detallado en este trabajo describe la aplicación de la terapia de fagos contra la infección por Pseudomonas aeruginosa en embriones de pez cebra CF. Los embriones de pez cebra se infectaron con P. aeruginosa para demostrar que la terapia de fagos es eficaz contra las infecciones por P. aeruginosa, ya que reduce la letalidad, la carga bacteriana y la respuesta inmunitaria proinflamatoria en embriones CF.

Introducción

La terapia de fagos, el uso de los enemigos naturales de las bacterias para combatir las infecciones bacterianas, está acayendo un renovado interés a medida que la resistencia bacteriana a los antibióticos se generaliza^1,,2. Esta terapia, utilizada durante décadas en Europa del Este, podría considerarse un tratamiento complementario a los antibióticos en el curado de infecciones pulmonares en pacientes con FQ y una posible alternativa terapéutica para pacientes infectados con bacterias que son resistentes a todos los antibióticos actualmente en uso^2,,3. Las ventajas de la terapia antibiótica son que los bacteriófagos se multiplican en el lugar de la infección, mientras que los antibióticos se metabolizan y eliminan del cuerpo^4,,5. De hecho, la administración de cócteles de fagos virulentos aislados en diferentes laboratorios ha demostrado ser eficaz en el tratamiento de las infecciones por Pseudomonas aeruginosa en modelos animales tan diferentes como insectos y mamíferos^6,,7,,8. La terapia de fagos también demostró ser capaz de reducir la carga bacteriana en las heridas por quemaduras infectadas con P. aeruginosa y Escherichia coli en un ensayo clínico aleatorizado⁹.

El pez cebra (Danio rerio) ha surgido recientemente como un modelo valioso para estudiar infecciones con varios patógenos, incluyendo P. aeruginosa^10,11, Mycobacterium abscessus y Burkolderia cepacia^12,13. Mediante la microinyección de bacterias directamente en la circulación sanguínea embrionaria¹⁴ es fácil establecer una infección sistémica que es contrarrestado por el sistema inmune innato de pez cebra, que es evolutivo conservado con neutrófilos y generación de macrófagos similar a la contraparte humana. Además, durante el primer mes de vida, los embriones de pez cebra carecen de la respuesta inmune adaptativa, lo que los convierte en modelos ideales para estudiar la inmunidad innata, que es el mecanismo crítico de defensa en las infecciones pulmonares humanas¹⁵. Zebrafish surgió recientemente como un potente sistema de modelos genéticos para comprender mejor el inicio del CF y desarrollar nuevos tratamientos farmacológicos^10,,16,,17. El modelo de pez cebra CF de derribo de cftr generado con inyección de morfolino en peces cebra presentó una respuesta amortiguada de ráfaga respiratoria y una migración de neutrófilos reducida^10,mientras que el knock-out del cftr conduce a una alteración de la posición interna del órgano y a la destrucción del páncreas exocrino, un fenotipo que refleja la enfermedad humana^16,,17. De mayor interés fue la constatación de que la carga bacteriana de P. aeruginosa fue significativamente mayor en embriones cftr-pérdida de función que en controles a las 8 horas posteriores a la infección (hpi), que es paralela a los resultados obtenidos con ratones y células epiteliales bronquiales humanas^2,18.

En este trabajo, demostramos que la terapia de fagos es eficaz contra las infecciones por P. aeruginosa en embriones de pez cebra.

Protocolo

El pez cebra adulto (Danio rerio) de la cepa AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) se mantiene de acuerdo con las directrices internacionales (Directiva 2010/63/UE de la UE) y nacionales (decreto italiano 4 de marzo^de 2014, n. 26) sobre la protección de los animales utilizados con fines científicos. Las condiciones estándar se establecen en la instalación de peces con un ciclo oscuro de 14 h de luz/10 h y una temperatura del agua del tanque a 28oC.

1. Preparación de soluciones y herramientas

1. Preparar una solución de stock 50x y 1x soluciones de trabajo para el medio embrionario E3 para el cultivo de embriones de pez cebra (ver Tabla 1).
2. Hacer la solución de bloqueo de pigmentación, para bloquear la pigmentación del embrión de 24 horas después de la fertilización (24 hpf) (ver Tabla 1).
3. Preparar 25x stock y 1x solución anestésica de tricano de trabajo como se describe en la Tabla 1.
   NOTA: Para evitar la congelación y descongelación repetidas de la solución que podría dañar la solución en stock, haga alícuotas de 2 ml de tricaína 25x y guárdelas a -20 oC.
4. Preparar orugas para la microinyección embrionaria disolviendo 1 g de agarosa en 100 ml de H₂O destilado en un matraz o frasco microwavable. Microondas durante 1-3 min hasta que la agarosa se disuelva por completo.
5. Coloque los moldes de microinyección de pez cebra (ver Tabla de Materiales)al revés en una placa Petri (90 mm x 15 mm) y cubra toda la superficie vertiendo el gel de agarosa líquida con una anchura de aproximadamente 10 mm.
6. Retire el molde una vez que la agaria se haya solidificado. Llene el plato Petri con 1x medio embrionario E3. Esto se puede almacenar a 4 oC durante aproximadamente una semana. Antes de su uso, sustituir por el medio E3 fresco que contenga Tricaine.
   NOTA: Los mohos más antiguos pueden desarrollar hongos o contaminaciones bacterianas.
7. Utilice capilares de borosilicato pulidos al fuego de 10 cm para preparar agujas para la microinyección y fijarlas al tirador de micropipetas apretando las asas. Ajuste el tirador con los siguientes ajustes: calor 500, velocidad 100, tiempo 150, tirar 150.

2. P. aeruginosa (PAO1) preparación del inóculo

1. Inocular 1 colonia de GFP⁺P. aeruginosa cepa PAO1¹⁹ en 5 ml de caldo LB (ver Tabla 1) y crecer durante la noche a 37 oC con temblores (200 rpm).
2. Diluir el cultivo de la noche anterior a_{OD 600} a 0,1 en 10 ml de caldo de LB y crecer hasta_{OD 600} a 0,5 a 37 oC con agitación (200 rpm).
3. Centrífuga 2 ml del cultivo durante 2 min a 4oC a 16.100 x g y resuspend el gránulo celular a_{OD 600o} 1, equivalente a aproximadamente 1 x 10⁹ cfu/ml, en 1 ml de la solución fisiológica (ver Tabla 1).
4. Diluir la suspensión celular a aproximadamente 5 x^{10 7}cfu/ml en solución fisiológica y almacenar a 4 oC.

3. Preparación de material de phage

1. Inocular 1 colonia de P. aeruginosa cepa PAO1 en 5 ml de caldo de LB e incubar durante la noche a 37 oC con temblor. Diluir el cultivo nocturno a_{OD 600} a 0,01 en 500 ml de caldo de LB y crecer a 37 oC con agitación a_{OD 600} a 0,05, equivalente a aproximadamente 2,5 x 10⁷ cfu/ml.
2. Al cultivo diluido de P. aeruginosa,añadir alrededor de 1,25 x 10⁷ fagos, para obtener la multiplicidad de infección (M.O.I.) de 10^-3. Incubar a 37oC con temblor hasta que el OD₆₀₀ caiga a aproximadamente 0,1-0,3 (en aproximadamente 3 a 5 h, dependiendo del fago utilizado).
   NOTA: Se seleccionaron cuatro fagos para este experimento que infectan la cepa PAO1: dos Podoviridae, números de adhesión de GenBank vB_PaeP_PYO2, MF490236 y vB_PaeP_DEV, MF490238 y dos Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241 y vB_PaeM_E217, MF490240. Realice los pasos a continuación para cada fago individualmente.
3. Incubar el izado con 1 mg/ml de DNase y RNase durante 30 min a 37oC. Centrifugar a 5.000 x g durante 30 min a 4oC y recuperar cuidadosamente el sobrenadante (SN). Filtrar el SN con un filtro con un diámetro de poro de 0,8 m.
4. Al SN, agregue 58 g/L de NaCl y 105 g/L de PEG6000. Disolver con agitación a RT 20 min y luego mantenerlo durante la noche a 4oC. Centrifugar a 20.000 x g durante 30 min a 4oC para la precipitación del fago. Retire el SN y disuelva cuidadosamente el pellet de fago en 15 ml de tampón TN (ver Tabla 1).
5. Purifique los fagos con gradiente de densidad CsCl como se describe en los pasos a continuación.
   1. En un tubo de ultracentrífuga poliallomer para rotor SW41, prepare un gradiente de densidad de paso CsCl estratificando 2 ml de las cuatro soluciones CsCl descritas en la Tabla 1.  Añadir 3,5 ml de suspensión de fagos en cada uno de los 4 tubos.
      NOTA: CsCl es tóxico, adoptar procedimientos de seguridad adecuados para manejarlo y desecharlo.
   2. Introducir los tubos en el rotor y asegurarse de que los tubos están equilibrados (la diferencia de peso entre los dos tubos de orientación debe ser ≤ 0.01g).
   3. Centrífuga para 2 h a 4oC y 100,000 x g (25.000 rpm para rotor SW41). Después de la centrifugación, retire lentamente los tubos e inmovilícelos cuidadosamente en un soporte. Usando una jeringa con aguja de 19 G, extraiga la banda blanca/opalescente que se encuentra generalmente entre la d-1.5 y la región de densidad d-1.4.
   4. Transfiera las suspensiones de la jeringa a nuevos tubos de poliallomer para el rotor SW60 y utilice la solución d-1.4 para equilibrar con precisión los tubos.
   5. Centrifugar la suspensión a 4oC y 150.0000 x g (38.000 rpm para el rotor SW60) durante al menos 16 h.
   6. Recoja la banda visible como arriba (consulte el paso 3.3.3) y transfiéralas a tubos de diálisis con 6.000 Da de corte. Dialyze la banda visible obtenida 2x durante 20 min contra 500 mL de agua y durante la noche contra 500 mL de tampón TN. Filtrar con un filtro de poro de 0,22 m y conservar a 4 oC.

4. Preparación de cócteles de phage

1. Hacer una mezcla de cuatro fagos que infectan la cepa PAO1, previamente aislada y caracterizada⁸. Antes de mezclar, estime el título de cada material de fagos por ensayo de placa²⁰.
2. Montar el cóctel de fagos, con un título general de 5 ×^{10 8} pfu/ml, mezclando igualmente cuatro preparaciones de fago en el mismo pfu/ml inmediatamente antes de cada experimento, para asegurar títulos de fago precisos.

5. Recolección y preparación de embriones de pez cebra para la microinyección de cftr morpholinos

NOTA: Recoger 1-2 embriones celulares de peces cebra de tipo salvaje para la microinyección cftr morpholinos (cftr-MOs).

1. Dos días antes del experimento de microinyección bacteriana, configure parejas reproductoras y recoja embriones como se describió anteriormente²¹. El pez cebra adulto (Danio rerio) de la cepa AB se compró en el Centro Europeo de Recursos de Peces Debras, EZRC.
2. Al día siguiente, recoger los embriones inmediatamente después de la fertilización con una pipeta de plástico o utilizando un colador de malla fina. Coloque los embriones recogidos en un plato de Petri que contenga el medio embrionario E3 y retire cuidadosamente los residuos con una pipeta de plástico para evitar la contaminación que pueda dañar el desarrollo embrionario.
3. Preparar 5 l de solución inyectable de morfolino diluyendo las dos soluciones de stock de morfolino (1 mM) en agua estéril a una concentración final de 0,25 pmol/embryo ATG-MO + 0,25 pmol/embryo splice-MO. Para rastrear la inyección de embriones, añada 0,5 l de rojo fenol a la mezcla de solución inyectable de morfolino.
4. Cargue una aguja de microinyección con aproximadamente 5 ml de la solución de mezcla de morfolino utilizando una micropipeta de 20 l con una punta de carga de gel fino. Fije la aguja al micromaniprógrafo conectado a un soporte y colóquela debajo de un estereomicroscopio.
   NOTA: No es necesario que la solución llegue a la punta de la aguja, ya que la presión de la bomba microinyector la empujará.
5. Sujete la punta de la aguja cortando la punta de la aguja con pinzas estériles finas. Mida el diámetro de la gota utilizando una barra de escala en el ocular del microscopio. Alternativamente, cree una gota de aceite mineral en un portaobjetos de micrómetros y ajuste el volumen de microinyección inyectando la solución en la gota de aceite para evaluar el tamaño de la gota. Utilice una gota con un diámetro de 156 m para inyectar un volumen de 2 nL.
6. Ajuste el microinyector ajustando la presión de compensación a 15 hPa, el tiempo de inyección a 0,5 s y la presión de inyección entre 300 y 600 hPa para obtener el volumen de inyección correcto en función de la aguja utilizada.
7. Con una pipeta de plástico, coloque los embriones del paso 5.2 en un vidrio colocado en una placa Petri de 96 mm de diámetro.
   NOTA: Demasiado medio E3 evitará la correcta penetración de la aguja de microinyección en la tarea de los embriones.
8. Penetrar la tarea y luego la yema con la aguja para inyectar 2 nL en el embrión como se describió anteriormente²².
9. Colocar embriones inyectados en un plato de Petri con E3 medio y ponerlos en una incubadora a 28 oC para que se desarrollen hasta el día siguiente.

6. Microinyección de embriones de pez cebra con bacterias y cóctel de fagos

NOTA: Para realizar una infección sistémica, el embrión debe tener circulación sanguínea que generalmente comienza después de 26 cvf.

1. Después de 26 hpf (para las etapas de desarrollo del pez cebra se refieren a Kimmel²¹⁾embriones de descorionato con solución de pronasa preparada mediante la disolución de polvo de pronasa en E3 medio a una concentración de 2 mg/ml. Pipetear suavemente los embriones para romper el coro. Deseche el medio pronasa/E3 y enjuague el plato varias veces con E3 fresco para eliminar toda pronasa.
2. Anesthetizar embriones de pez cebra en medio E3 que contenga Tricaine aproximadamente 5 minutos antes de las inyecciones.
3. Pipetear los embriones anestesificados en la pista preparados en el paso 1. Utilice una punta de carga de gel fino para forrar los embriones en la posición lateral.
4. Cargue una aguja de microinyección con aproximadamente 5 oL de la preparación de P. aeruginosa como se describe en la parte 5.
5. Inserte la aguja dorsalmente hasta el punto de partida del conducto de Cuvier donde comienza a extenderse sobre el saco de yema. Inyectar un volumen de 1-3 nL y asegurarse de que el volumen se expande directamente dentro del conducto y entra en la circulación.
6. Aproximadamente después de cada 50 embrión inyectados, inyecte una gota de la bacteria en un tubo centrífugo de 1,5 ml con 100 ml de PBS estéril para comprobar si el volumen de inyección sigue siendo el mismo. Encuado el inóculo en el agar LB (ver Tabla 1) a 37oC durante la noche para evaluar la CFU.
7. Transfiera los embriones microinyectados en dos platos Limpios de Petri con medio E3 fresco + PTU e incubarlos a 28oC.
8. En dos puntos de tiempo seleccionados: 30 min o 3 h después de la inyección bacteriana, saque uno de los platos De Petri con embriones inyectados bacterianos de la incubadora y alinee en la pista como se describe en 6.3 para la inyección de cóctel de fagos.
9. Cargue una aguja de microinyección con aproximadamente 5 ml del cóctel de fagos (preparado en el paso 4) con una punta de carga de gel fino y fíjela al microinyector (ver paso 5).
10. Inyectar el cóctel de fagos en el conducto de Cuvier de los embriones previamente inyectados con bacterias.
11. Transfiera los embriones microinyectados en dos platos Limpios de Petri con medio E3 fresco + PTU e incubarlos a 28oC.

7. Evaluación de la carga bacteriana de embriones inyectados con PAO1 y fagos

1. A 8 hpi, pipeta 15 embriones anestesiados de la placa Petri a un tubo centrífugo de 1,5 ml.
2. Sustituya la solución anestésica por 300 l de 1% Tritón X-100 en PBS (PBSTritonX) y homogeneice los embriones pasándolos al menos 15 veces a través de una jeringa de insulina con una aguja estéril de 27 G.
3. Preparar diluciones en serie de homogeneados en PBS estéril mediante la transferencia de 100 l del homogenerato diluido a 900 l de PBS estéril.
4. Para seleccionar la cepa PAO1 resistente a los amplificadores de forma natural, la placa de 100 ml de las diluciones en el agar LB añadido con ampicilina (100 g/ml) e incubar a 37 oC durante la noche.
5. Al día siguiente, contar el número de colonias, multiplicar por el factor de dilución para determinar el número total de UFC, y dividir por el número de embriones homogeneizados para obtener el número promedio de UFC/ embrión infectado.

8. Evaluación de la letalidad de embriones inyectados con PAO1 y fagos

1. Para evaluar la letalidad de la infección PAO1, puntúe los embriones inyectados a 20 hpi bajo un estereomicroscopio y cuente para los embriones muertos (blanco/no transparente).
2. Calcular la concentración letal medio máxima 50 (LD50) dosis de PAO1 que determina la muerte del 50% de los embriones inyectados a 20 cvf.

9. Preparación de embriones para imágenes de lapso de tiempo estereomicroscopio de la infección por GFP⁺ PAO1

1. Preparar el molde para la toma de imágenes de embrión vivo disolviendo un 1,5% de agarosa de baja fusión en 100 ml de solución E3.
2. Añadir 1% Tricaine (ver Tabla 1) para anestesiar los embriones.
3. A 4 hpi transfiera un embrión con una pipeta de plástico en un plato de fondo de vidrio y agregue la solución cálida de agarosa de punto de fusión baja.
4. Coloque la placa inferior de vidrio debajo de un estereomicroscopio y con una punta coloque el embrión en la orientación deseada. Utilice una pipeta de plástico para añadir cuidadosamente una gota de agarosa en el embrión.
5. Dejar enfriar la agarosa durante 5-10 min y llenar suavemente el plato de fondo de vidrio con E3 que contiene la solución anestésica para mantener el embrión húmedo.
6. Coloque la placa inferior de vidrio con el embrión debajo del estereomicroscopio fluorescente con un filtro fluorescente (canal 488 nm) para GFP⁺ bacterias. No retire el plato Petri hasta nuevas adquisiciones con los mismos parámetros a 9, 14 y 18 hpi.

10. Análisis de expresión de citoquinas proinflamatorias

1. A 20 hpi anestesiar los embriones con solución de tricaína 1x y transferirlos de la placa Petri a un tubo centrífugo de 1,5 ml.
2. Bajo una campana de humo retire la solución anestésica y sustitúyala con 200 l de reactivo de clorhidrato de guanidio.
3. Homogeneizar los embriones pipeteándolos repetitivamente a través de una pipeta de 200 l primero y luego al menos 15 veces con una jeringa de insulina con una aguja estéril de 27 G.
4. Extraiga el ARN total de embriones de pez cebra homogeneizados utilizando reactivos de clorhidrato de guanidio disponibles comercialmente según las instrucciones del fabricante.
5. Tratar 1 g de cada muestra de ARN con 2 ml de 1U/L de DNase I (sin RNase), siguiendo las instrucciones del fabricante.
6. Utilice 1 g de ARN tratado con DNase I para la reacción de transcripción inversa (RT) utilizando un kit disponible comercialmente (ver Tabla de materiales),en un volumen total de 20 ml de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
7. Realice la reacción RT qPCR en un volumen total de 10 l que contenga 1 mezcla maestra SYBR Green utilizando 1,5 l de una dilución de 1:6 de reacción RT. Para fines de normalización, utilice las imprimaciones para los genes de mantenimiento de la casa rpl8 y para las citoquinas proinflamatorias, utilice imprimaciones para TNF-α e IL-1 (ver Tabla 2). el protocolo qPCR fue: ciclo 1 paso 1: 95 oC, 2 min, repetir una vez; ciclo 2: paso 1 95 oC, 10 s, paso 2 55 oC, 30 s, repetir 40x; ciclo 3: paso 1 72 oC, 15 min.

Resultados

Los resultados y las cifras aquí presentados se refieren a embriones CF generados a través de la inyección de cftr morpholinos como se describió anteriormente¹⁰ y en el paso 5. Para validar el fenotipo CF, se consideró la posición deteriorada de órganos internos como el corazón, el hígado y el páncreas como se describió anteriormente¹⁷ (Figura 1). Se obtuvieron resultados similares en el caso de los embriones WT, como se inf...

Discusión

En este manuscrito, describimos el protocolo para realizar la infección por P. aeruginosa (PAO1) en embriones de pez cebra y cómo aplicar la terapia de fagos con un cóctel de fagos previamente identificados como capaces de infectar PAO1 para resolverlo. El uso de bacteriófagos como alternativa a los tratamientos antibiótico ha sido de creciente interés desde los últimos años. Esto se debe principalmente a la difusión de infecciones bacterianas multirresistentes (MDR), que constituyen un problema grave p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	BD	214010
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
CsCl	Sigma-Aldrich	289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich	886-86-2	common name tricaine
Femtojet Micromanipulator	Eppendorf	5247
Fleming/brown P-97	Sutter Instrument Company	P-97
LE-Agarose	Sigma-Aldrich	11685660001
Low Melting Agarose	Sigma-Aldrich	CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Methyl Blue	Sigma-Aldrich	28983-56-4
Microinjection needles	Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98%	Aldrich-P7629	103-85-5
Oligo Morpholino	Gene Tools		designed by the researcher
PEG6000	Calbiochem	528877
Phenol Red Solution	Sigma-Aldrich	CAS 143-74-B
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Pronase	Sigma-Aldrich	9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	S9888
Stereomicroscope	Leica	S9I
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tryptone	Oxoid	LP0042B
Yeast extract	Oxoid	LP0021B
Z-MOLDS Microinjection	Word Precision Instruments