Application de thérapie de phage pour contrecarrer l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique

Résumé

Présenté ici est un protocole pour l’infection de Pseudomonas aeruginosa et l’application de thérapie de phage dans les embryons de poisson zèbre de fibrose kystique (CF).

Résumé

La résistance aux antimicrobiens, une conséquence majeure de l’incertitude diagnostique et de la surprescription antimicrobienne, est une cause de plus en plus reconnue d’infections graves, de complications et de mortalité dans le monde entier, avec un impact énorme sur notre société et sur le système de santé. En particulier, les patients dont le système immunitaire est affaibli ou qui souffrent de pathologies préexistantes et chroniques, comme la fibrose kystique (FK), sont soumis à des traitements antibiotiques fréquents pour contrôler les infections par l’apparition et la diffusion d’isolats multirésistants. Par conséquent, il est urgent de s’attaquer aux thérapies alternatives pour contrer les infections bactériennes. L’utilisation de bactériophages, ennemis naturels des bactéries, peut être une solution possible. Le protocole détaillé dans ce travail décrit l’application de la thérapie de phage contre l’infection de Pseudomonas aeruginosa dans les embryons de zebrafish de CF. Les embryons de poisson zèbre ont été infectés par P. aeruginosa pour démontrer que la thérapie par phage est efficace contre les infections à P. aeruginosa, car elle réduit la létalité, la charge bactérienne et la réponse immunitaire pro-inflammatoire chez les embryons atteints de FK.

Introduction

La thérapie par phages, l’utilisation des ennemis naturels des bactéries pour combattre les infections bactériennes, suscite un regain d’intérêt à mesure que la résistance bactérienne aux antibiotiques se^{généralise 1,2}. Cette thérapie, utilisée depuis des décennies en Europe de l’Est, pourrait être considérée comme un traitement complémentaire aux antibiotiques dans le traitement des infections pulmonaires chez les patients atteints de FK et une alternative thérapeutique possible pour les patients infectés par des bactéries qui sont résistantes à tous les antibiotiques^{actuellement utilisés 2,3}. Les avantages de la thérapie antibiotique sont que les bactériophages se multiplient au site de l’infection, tandis que les antibiotiques sont métabolisés et^{éliminés du corps 4,5}. En effet, l’administration de cocktails de phages virulents isolés dans différents laboratoires s’est avérée efficace dans le traitement des infections pseudomonas aeruginosa chez des modèles animaux aussi différents que les insectes et les^{mammifères 6,7,8}. Il a également été démontré que la thérapie par phages était en mesure de réduire le fardeau bactérien des brûlures infectées par P. aeruginosa et Escherichia coli dans le cadre d’un essai clinique^{randomisé 9}.

Zebrafish (Danio rerio) a récemment émergé comme un modèle précieux pour étudier les infections avec plusieurs agents pathogènes, y compris P. aeruginosa^10,11, Mycobacterium abccessus et Burkolderia cepacia^12,13. En microinjectant les bactéries directement dans la circulation sanguine de l’embryon^14, il est facile d’établir une infection systémique qui est contrecarrée par le système immunitaire inné du poisson zèbre, qui est évolutif conservé avec des neutrophiles et la génération de macrophages similaires à la contrepartie humaine. En outre, au cours du premier mois de vie, les embryons de poisson zèbre n’ont pas la réponse immunitaire adaptative, ce qui en fait des modèles idéaux pour étudier l’immunité innée, qui est le mécanisme de défense critique dans les infections pulmonaires^{humaines 15}. Zebrafish a récemment émergé comme un système de modèle génétique puissant pour mieux comprendre l’apparition des FC et de développer de nouveaux traitements pharmacologiques^10,16,17. Le modèle cf zebrafish de cftr knock-down généré par injection de morpholino chez le poisson zèbre présentait une réponse d’éclatement respiratoire amortie et une diminution de la migration des neutrophiles¹⁰, tandis que le knock-out cftr conduit à une altération de la position interne des organes et à la destruction du pancréas exocrine, un phénotype qui reflète la maladie humaine^16,17. Le plus grand intérêt était la conclusion que la charge bactérienne de P. aeruginosa était sensiblement plus élevée dans cftr-perte-de-fonction embryons que dans les contrôles à 8 heures après infection (hpi), qui fait le parallèle avec les résultats obtenus avec des souris et des cellules épithéliales bronchiques^{humaines 2,18}.

Dans ce travail, nous démontrons que la thérapie de phage est efficace contre des infections de P. aeruginosa dans les embryons de zebrafish.

Protocole

Le poisson zèbre adulte (Danio rerio) de la souche AB (European Zebrafish Resource Center EZRC) est maintenu selon les directives internationales (directive européenne 2010/63/UE) et nationales (décret italien du^{4 mars} 2014, n° 26) sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques. Les conditions normales sont fixées dans l’installation de pêche avec un cycle sombre de 14 h/10 h et une température de l’eau du réservoir à 28 °C.

1. Préparation de solutions et d’outils

1. Préparer une solution 50x stock et 1x solutions de travail pour le milieu embryonnaire E3 pour la culture d’embryons de poisson zèbre (voir tableau 1).
2. Faire la solution de blocage de pigmentation, pour bloquer la pigmentation de l’embryon de 24 heures après la fécondation (24 hpf) (voir le tableau 1).
3. Préparez 25x stock et 1x working Tricane solution anesthésique tel que décrit dans le tableau 1.
   REMARQUE : Pour éviter le gel et le dégel répétés de la solution qui pourraient endommager la solution de stock, faites des aliquots de 2 mL de tricaine 25x et stockez-les à -20 °C.
4. Préparer les traces de microinjection embryonnaire en dissolvant 1 g d’agarose dans 100 mL de H₂O distillé dans un flacon ou une bouteille micro-ondes. Cuire au micro-ondes de 1 à 3 minutes jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.
5. Placez les moules de microinjection de poisson zèbre (voir tableau des matériaux)retournés à l’envers dans une boîte de Pétri (90 mm x 15 mm) et couvrez toute la surface en versant le gel d’agarose liquide d’une largeur d’environ 10 mm.
6. Enlever le moule une fois que l’agarose s’est solidifiée. Remplir la boîte de Pétri d’un milieu embryonnaire 1x E3. Celui-ci peut être stocké à 4 °C pendant environ une semaine. Avant utilisation, remplacer par le milieu E3 frais contenant de la Tricaine.
   REMARQUE : Les moisissures plus anciennes peuvent développer des champignons ou des contaminations bactériennes.
7. Utilisez des capillaires borosilicate de 10 cm polis par le feu pour préparer les aiguilles à la microinjection et fixez-les au puller micropipette en serrant les poignées. Réglez le puller avec les réglages suivants : chaleur 500, vitesse 100, temps 150, tirez 150.

2. P. aeruginosa (PAO1) préparation inoculum

1. Inoculer 1 colonie de GFP⁺P. aeruginosa souche PAO1^{19 dans} 5 mL de bouillon LB (voir tableau 1) et grandir pendant la nuit à 37 °C avec secousses (200 rpm).
2. Diluer la culture de nuit ci-dessus_{à OD 600} = 0,1 dans 10 mL de bouillon LB et passer à_{OD 600} = 0,5 à 37 °C avec secousses (200 rpm).
3. Centrifugeuse 2 mL de la culture pendant 2 min à 4 °C à 16 100 x g et resuspendre la pastille cellulaire à_{od 600} = 1, équivalent à environ 1 x 10⁹ cfu/mL, dans 1 mL de la solution physiologique (voir le tableau 1).
4. Diluer la suspension cellulaire à environ 5 x 10⁷cfu/mL en solution physiologique et la conserver à 4 °C.

3. Préparation des stocks de phages

1. Inoculer 1 colonie de souche P. aeruginosa PAO1 dans 5 mL de bouillon LB et incuber pendant la nuit à 37 °C avec secousses. Diluer la culture du jour au lendemain à₆₀₀ OD = 0,01 dans 500 mL de bouillon LB et croître à 37 °C avec secouant à_{OD 600} = 0,05, équivalent à environ 2,5 x 10⁷ cfu/mL.
2. À la culture diluée de P. aeruginosa, ajouter environ 1,25 x 10⁷ phages, pour obtenir la multiplicité de l’infection (M.O.I.) de 10^-3. Incuber à 37 °C en secouant jusqu’à ce que_{l’OD 600} tombe à environ 0,1-0,3 (en environ 3 à 5 h, selon le phage utilisé).
   NOTE: Quatre phages ont été sélectionnés pour cette expérience qui infectent la souche PAO1: Deux Podoviridae, GenBank numéros d’adhésion vB_PaeP_PYO2, MF490236, et vB_PaeP_DEV, MF490238, et deux Myoviridae, vB_PaeM_E215, MF490241, et vB_PaeM_E217, MF490240. Effectuez les étapes ci-dessous pour chaque phage individuellement.
3. Incuber le lysate avec 1 mg/mL de DNase et de RNase pendant 30 min à 37 °C. Centrifugeuse à 5000 x g pendant 30 min à 4 °C et récupérer soigneusement le supernatant (SN). Filtrer le SN avec un filtre ayant un diamètre de pore de 0,8 μm.
4. Au SN, ajouter 58 g/L de NaCl et 105 g/L de PEG6000. Dissoudre en remuant à RT 20 min, puis le garder toute la nuit à 4 °C. Centrifugeuse à 20 000 x g pendant 30 min à 4 °C pour les précipitations de phage. Retirez le SN et dissolvez soigneusement la pastille de phage dans 15 mL de tampon TN (voir le tableau 1).
5. Purifiez les phages avec le gradient de densité de CsCl tel que décrit dans les étapes ci-dessous.
   1. Dans un tube d’ultracentrifugeuse polyallomer pour rotor SW41, préparez un gradient de densité d’étape CsCl en stratifiant 2 mL des quatre solutions CsCl décrites dans le tableau 1.  Ajouter 3,5 mL de suspension phage dans chacun des 4 tubes.
      REMARQUE : Le CsCl est toxique, adoptez les procédures de sécurité appropriées pour le manipuler et le jeter.
   2. Introduisez les tubes dans le rotor et assurez-vous que les tubes sont équilibrés (la différence de poids entre les deux tubes orientés doit être ≤ 0,01 g).
   3. Centrifugeuse de 2 h à 4 °C et 100 000 x g (25 000 rpm pour le rotor SW41). Après centrifugation, retirez lentement les tubes et immobilisez-les soigneusement sur un support. À l’aide d’une seringue à aiguille de 19 G, tracez la bande blanche/opalescente qui se trouve habituellement entre la région d=1,5 et la région de densité d=1,4.
   4. Transférez les suspensions de la seringue dans de nouveaux tubes en polyallomer pour le rotor SW60 et utilisez la solution d=1.4 pour équilibrer avec précision les tubes.
   5. Centrifugeuse la suspension à 4 °C et 150 000 x g (38 000 rpm pour le rotor SW60) pendant au moins 16 h.
   6. Recueillir la bande visible comme ci-dessus (voir l’étape 3.3.3) et les transférer dans des tubes de dialyse avec 6.000 Da cut-off. Dialyz la bande visible obtenue 2x pendant 20 min contre 500 mL d’eau et pendant la nuit contre 500 mL de tampon TN. Filtrer à l’intérieur d’un filtre pore de 0,22 μm et le conserver à 4 °C.

4. Préparation de cocktail de Phage

1. Faire un mélange de quatre phages qui infectent la souche PAO1, précédemment isolé et caractérisé⁸. Avant de mélanger, estimer le titer de chaque stock de phage par essai de plaque²⁰.
2. Assembler le cocktail phage, avec un titer global de 5 × 10⁸ pfu/mL, en mélangeant également quatre préparations de phages au même pfu/mL immédiatement avant chaque expérience, afin d’assurer des titres de phage précis.

5. Collecte et préparation d’embryons de poisson zèbre pour la microinjection de cftr morpholinos

REMARQUE : Recueillir 1 à 2 embryons cellulaires à partir de poissons zèbres de type sauvage pour la microinjection de cftr morpholinos(cftr-MOs).

1. Deux jours avant l’expérience de microinjection bactérienne, mettre en place des couples reproducteurs et recueillir des embryons comme décrit^{précédemment 21}. Le poisson zèbre adulte (Danio rerio) de la souche AB a été acheté auprès de l’European Zebrafish Resource Center, EZRC.
2. Le lendemain, recueillir les embryons immédiatement après la fécondation à l’aide d’une pipette en plastique ou à l’aide d’une passoire à mailles fines. Placez les embryons recueillis dans une boîte de Pétri contenant du milieu embryonnaire E3 et retirez soigneusement les débris avec une pipette en plastique pour éviter la contamination qui pourrait endommager le développement de l’embryon.
3. Préparer 5 μL de solution d’injection de morpholino en diluant les deux solutions de stock de morpholino (1 mM) dans l’eau stérile à une concentration finale de 0,25 pmol/embryon ATG-MO + 0,25 pmol/épissage embryonnaire-MO. Pour retracer l’injection d’embryons, ajouter 0,5 μL de rouge phénol au mélange de solution d’injection de morpholino.
4. Chargez une aiguille de microinjection avec environ 5 μL de la solution de mélange morpholino à l’aide d’une micropipette de 20 μL avec une pointe de chargement de gel fin. Fixez l’aiguille au micromanipulateur relié à un support et placez-la sous un stéréomicroscope.
   REMARQUE : Il n’est pas nécessaire que la solution atteigne le bout de l’aiguille car la pression de la pompe à microinjecteur la poussera.
5. Couper le bout de l’aiguille en coupant la pointe de l’aiguille à l’aide d’une pince stérile fine. Mesurer le diamètre de la chute à l’aide d’une barre d’échelle dans l’oculaire du microscope. Sinon, créez une goutte d’huile minérale sur une glissière de micromètre et réglez le volume de microinjection en injectant la solution dans la goutte d’huile pour évaluer la taille de la gouttelette. Utilisez une goutte d’un diamètre de 156 μm pour injecter un volume de 2 nL.
6. Réglez le microinjecteur en ajustant la pression de compensation à 15 hPa, le temps d’injection à 0,5 s, et la pression d’injection entre 300 et 600 hPa pour obtenir le volume d’injection correct selon l’aiguille utilisée.
7. À l’aide d’une pipette en plastique, disposer les embryons de l’étape 5.2 sur un verre placé dans une boîte petri de 96 mm de diamètre.
   REMARQUE : Trop de milieu E3 empêchera la pénétration appropriée de l’aiguille de microinjection dans la chorion des embryons.
8. Pénétrer dans la chorion, puis le jaune avec l’aiguille pour injecter 2 nL dans l’embryon comme décrit précédemment²².
9. Placer les embryons injectés dans une boîte de Pétri avec le milieu E3 et les mettre dans un incubateur à 28 °C pour les laisser se développer jusqu’au lendemain.

6. Microinjection d’embryons de poisson zèbre avec des bactéries et cocktail de phages

REMARQUE : Pour effectuer une infection systémique, l’embryon doit avoir une circulation sanguine qui commence habituellement après 26 hpf.

1. Après 26 hpf (pour les stades de développement du poisson zèbre se réfèrent à Kimmel²¹) embryons de déchorionate avec solution de pronase préparé en dissolvant la poudre de pronase dans le milieu E3 à une concentration de 2 mg/mL. Pipette doucement les embryons pour briser la chorion. Jeter le pronase/E3 moyen et rincer le plat plusieurs fois avec de l’E3 frais pour enlever toutes les pronases.
2. Anesthésier les embryons de poisson zèbre dans le milieu E3 contenant de la tricaine environ 5 minutes avant les injections.
3. Pipette les embryons anesthésiés dans la piste préparée à l’étape 1. Utilisez une pointe de chargement de gel fin pour tapisser les embryons en position latérale.
4. Chargez une aiguille de microinjection avec approximativement 5 μL de la préparation de P. aeruginosa telle que décrite dans la partie 5.
5. Insérez l’aiguille dorsalement au point de départ du conduit de Cuvier où elle commence à s’étendre sur le sac jaune. Injectez un volume de 1-3 nL et assurez-vous que le volume augmente directement dans le conduit et entre dans la circulation.
6. Environ après chaque 50 embryon injecté, injecter une goutte de la bactérie dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL avec 100 μL de PBS stérile pour vérifier si le volume d’injection reste le même. Plaquez l’inoculum sur l’agar LB (voir le tableau 1)à 37 °C pendant la nuit pour évaluer l’AFU.
7. Transférer les embryons microinjectés dans deux boîtes de Pétri propres avec un milieu E3 frais + PTU et les incuber à 28 °C.
8. À deux moments choisis : 30 min ou 3 h après l’injection bactérienne, sortez l’une des boîtes de Pétri avec des embryons injectés par des bactéries de l’incubateur et alignez-les sur la piste décrite dans 6,3 pour l’injection de cocktail de phage.
9. Chargez une aiguille de microinjection avec environ 5 μL du cocktail phage (préparé à l’étape 4) avec une pointe de chargement de gel fin et fixez-la au microinjecteur (voir l’étape 5).
10. Injecter le cocktail de phages dans le conduit de Cuvier des embryons précédemment injectés avec des bactéries.
11. Transférer les embryons microinjectés dans deux boîtes de Pétri propres avec un milieu E3 frais + PTU et les incuber à 28 °C.

7. Évaluation de la charge bactérienne des embryons injectés avec pao1 et phages

1. À 8 hpi, pipette 15 embryons anesthésiés de la boîte de Petri à un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
2. Remplacez la solution anesthésique par 300 μL de 1% Triton X-100 dans PBS (PBSTritonX) et homogénéisez les embryons en les passant au moins 15x par une seringue d’insuline avec une aiguille stérile de 27 G.
3. Préparer des dilutions en série d’homogénéités dans le PBS stérile en transférant 100 μL de l’homogénéité diluée en 900 μL de PBS stérile.
4. Pour sélectionner la souche PAO1 naturellement résistante aux amplis, plaquez 100 μL des dilutions sur l’agar LB ajoutées à l’ampicilline (100 μg/mL) et incubez à 37 °C la nuit.
5. Le lendemain, compter le nombre de colonies, multiplier par le facteur de dilution pour déterminer le nombre total de CFU, et diviser par le nombre d’embryons homogénéisés pour obtenir le nombre moyen de CFU / embryon infecté.

8. Évaluation de la létalité des embryons injectés avec pao1 et phages

1. Pour évaluer la létalité de l’infection à PAO1, évaluez les embryons injectés à 20 hpi sous un stéréomicroscope et comptez pour les embryons morts (blancs/non transparents).
2. Calculer la dose demi-maximale de concentration létale 50 (LD50) de PAO1 qui détermine la mort de 50 % des embryons injectés à 20 hpf.

9. Préparation embryonnaire pour l’imagerie en accéléré stéréomicroscope de l’infection à GFP⁺ PAO1

1. Preparate le moule pour l’imagerie d’embryon vivant en dissolvant 1.5% agarose de fusion basse dans 100 mL de solution d’E3.
2. Ajouter 1 % de Tricaine (voir le tableau 1)pour anesthésier les embryons.
3. À 4 hpi transférer un embryon avec une pipette en plastique dans un plat de fond de verre et ajouter la solution chaude à faible point de fusion agarose.
4. Placez le plat de fond en verre sous un stéréomicroscope et avec une position de pointe de l’embryon dans l’orientation désirée. Utilisez une pipette en plastique pour ajouter soigneusement une goutte d’agarose sur l’embryon.
5. Laisser refroidir l’agarose pendant 5-10 min et remplir délicatement le plat de fond en verre avec l’E3 contenant la solution anesthésique pour garder l’embryon humide.
6. Placez le plat de fond en verre avec l’embryon sous le stéréomicroscope fluorescent avec un filtre fluorescent (canal 488 nm) pour GFP⁺ bactéries. N’enlevez pas la boîte de Pétri jusqu’à d’autres acquisitions avec les mêmes paramètres à 9, 14 et 18 hpi.

10. Analyses d’expression des cytokines pro-inflammatoires

1. À 20 hpi anesthésier les embryons avec la solution tricaine 1x et les transférer de la boîte de Petri à un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.
2. Sous un capot de fumée enlever la solution anesthésique et remplacer par 200 μL de réagencé d’hydrochlorure de guanidium.
3. Homogénéiser les embryons en les pipetant de façon répétitive à travers une pipette de 200 μL d’abord, puis au moins 15x avec une seringue à insuline avec une aiguille stérile de 27 G.
4. Extraire l’ARN total des embryons homogénéisés de poisson zèbre à l’aide d’un hydrochlorure de guanidium disponible dans le commerce, selon les instructions du fabricant.
5. Traiter 1 μg de chaque échantillon d’ARN avec 2 μL de 1U/μL de DNase I (sans RNase), selon les instructions du fabricant.
6. Utilisez 1 μg d’ARN traité par DNase I pour la réaction de transcription inverse (RT) à l’aide du kit disponible dans le commerce (voir tableau des matériaux),dans un volume total de 20 μL selon les instructions du fabricant.
7. Effectuez la réaction rt qPCR dans un volume total de 10 μL contenant 1x SYBR Green mastermix en utilisant 1,5 μL d’une dilution de 1:6 de la réaction RT. À des fins de normalisation, utilisez les amorces pour les gènes d’entretien ménager rpl8 et pour les cytokines pro-inflammatoires, utilisez des amorces pour le TNF-α et l’IL-1β (voir le tableau 2). le protocole qPCR était : cycle 1 étape 1 : 95 °C, 2 min, répétition une fois ; cycle 2 : étape 1 95 °C, 10 s, étape 2 55 °C, 30 s, répétition 40x; cycle 3: étape 1 72 °C, 15 min.

Résultats

Les résultats et les chiffres présentés ici sont renvoyés aux embryons de FK générés par l’injection de cftr morpholinos tel que décrit^{précédemment 10} et à l’étape 5. Pour valider le phénotype de CF, la position altérée des organes internes tels que le coeur, le foie, et le pancréas comme^{précédemment décrit 17} (figure 1) ont été considérées. Des résultats similaires ont été obtenus dans le cas des embryons...

Discussion

Dans ce manuscrit, nous avons décrit le protocole pour effectuer l’infection de P. aeruginosa (PAO1) dans les embryons de poisson zèbre et comment appliquer la thérapie de phage avec un cocktail de phages précédemment identifiés comme capables d’infecter PAO1 pour le résoudre. L’utilisation de bactériophages comme alternative aux traitements antibiotiques est de plus en plus intéressante depuis quelques années. Cela est principalement dû à la diffusion d’infections bactériennes multirésista...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacto Agar	BD	214010
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	10043-52-4
CsCl	Sigma-Aldrich	289329
Dulbecco's phospate buffered saline PBS	Sigma-Aldrich	D8537
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma-Aldrich	886-86-2	common name tricaine
Femtojet Micromanipulator	Eppendorf	5247
Fleming/brown P-97	Sutter Instrument Company	P-97
LE-Agarose	Sigma-Aldrich	11685660001
Low Melting Agarose	Sigma-Aldrich	CAS 9012-36-6
Magnesium sulfate	Sigma-Aldrich	7487-88-9
Methyl Blue	Sigma-Aldrich	28983-56-4
Microinjection needles	Harvard apparatus
N-Phenylthiourea >=98%	Aldrich-P7629	103-85-5
Oligo Morpholino	Gene Tools		designed by the researcher
PEG6000	Calbiochem	528877
Phenol Red Solution	Sigma-Aldrich	CAS 143-74-B
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	7447-40-7
Pronase	Sigma-Aldrich	9036-06-0
Sodium chloride ACS reagent, ≥99.0%	Sigma-Aldrich	S9888
Stereomicroscope	Leica	S9I
Tris HCl	Sigma-Aldrich	T5941
Triton X	Sigma-Aldrich	T9284
Tryptone	Oxoid	LP0042B
Yeast extract	Oxoid	LP0021B
Z-MOLDS Microinjection	Word Precision Instruments