通过流细胞学测定，测量自然获得的噬菌体诱导恶性疟Plasmodium falciparum原虫抗体

摘要

该协议的总体目标是指导如何测量自然接触恶性疟原虫感染的血清或血浆中的抗体的能力，以对抗和诱导寄生虫感染的红细胞（IEs）的噬菌体。 Plasmodium falciparum

摘要

该协议描述了如何建立和运行一个流细胞学为基础的噬菌体噬菌体测定恶性疟原虫 - 感染红细胞 （IE） 由自然获得的IgG抗体特异性VAR2CSA。VAR2CSA是一种寄生虫抗原，它调解胎盘中可引起严重疟疾的胎盘内 IEs 的选择性固原，称为胎盘疟疾 （PM）。防止PM由VAR2CSA特异性抗体进行调解，这些抗体被认为通过抑制地盘固存和/或通过治疗吞咽病的性病来发挥作用。该检测采用体外选择的晚期同步性，以表达VAR2CSA、in vitro具有自然获得PM特异性免疫力的妇女的血浆/血清抗体，以及噬菌体细胞系THP-1。然而，该协议可以很容易地修改，以检测抗体的功能，任何寄生虫抗原存在于国际化学品表面，无论是由自然接触或接种疫苗引起的。该测定方法对疟疾抗体中量免疫的一个重要功能方面进行了简单、高通量的评价，具有良好的可重复性。因此，在评估恶性疟原虫疟疾的临床免疫力时，它很有用，恶性疟原虫是热带地区，特别是撒哈拉以南非洲地区发病率和死亡率的主要原因。

引言

疟疾是一种病媒传播的疾病，在感染五种不同种类的疟原虫时，由人类引起。最常见的物种是恶性疟原虫，它也负责发病率和死亡率^1。疟疾临床表现从无症状或良性感染到复杂/严重疾病，后者主要发生在五岁以下儿童中。接触恶性疟原虫不会诱发无菌免疫，但生活在流行地区的个体对临床疾病的免疫力会慢慢发展。保护是年龄/暴露依赖和免疫力通常获得在生命的前5-10年^2。成年妇女是一个重要的例外，因为严重的疟疾可能发生在怀孕期间，在临床介绍称为胎儿素疟疾（PM）。PM 是流产、死产、早产、低出生体重、胎儿死亡和产妇贫血的重要原因。对PM的耐药性在连续怀孕时^{发展 3}。防止PM与获得抗体对VAR2CSA型PfEMP1^4，5，受感染的红细胞（IE）表面抗原，结合到软体素硫酸盐A（CSA），使国际在胎盘中固有。^4,抗体调解保护执行各种功能活动（^{审查在,6，7），}包括E的异化，以诱导吞噬。早期的体外研究表明，抗体可以通过^,噬菌体^8，9来限制单细胞的存在。⁹最近的研究表明，高浓度的噬菌体诱导抗体与更好的妊娠结果（在HIV共感染的情况下^{）10，11，,11}表明这种效应功能在自然获得的免疫反应的相关性。

在这里，我们提出了一个协议，测量存在于人类血浆/血清中的抗体的这一功能in vitro，使用体外培养的IES表达VAR2CSA与单细胞线THP-1。与早期的显微镜方案8相比^,,，该测定方法以前曾使用过^,,,11、12、13、14、15、16、17、18，被认为是一种改进^{12和更容易的方法，}因为它允许使用较小的抗体体积在一次运行中测试更多的抗体样本，并避免繁琐和偏颇的¹⁸显微镜计数。^{17,1113141516}尽管该测定方法已被多个实验室使用，而且执行过程非常简单，但它需要仔细规划和准备，因此，详细的协议将允许缺乏经验的实验室和研究人员应用该测定。例如，我们使用表示 VAR2CSA 的后期同步 IE 与从自然获得 PM 特异性免疫力的妇女收集的血清中存在的抗体进行结果化。然而，该协议可以很容易地修改，以检测抗体的功能，任何寄生虫抗原存在于国际化学品表面，无论是由自然接触或接种疫苗引起的。

研究方案

用于此处结果的人体血清样本在另外一项研究^19中收集。馆藏由加纳大学野口医学研究所机构审查委员会（研究报告038/10-11）和丹麦首都大区区域研究伦理委员会（协议H-4-2013-083）批准。

1. 寄生虫文化

注:遵守当地有关人类病原体处理的规定。

1. 根据寄生虫培养基20前所述的标准协议维持恶性疟原虫（参见²⁰材料表）。
2. 保持寄生虫紧密同步使用索比托治疗，如前面描述^的21。
3. 为确保VAR2CSA在 IE 表面的表达，使用抗 VAR2CSA 抗体（例如 PAM1.4 抗体，一种交叉反应人单克隆 VAR2CSA 特异性 IgG^22）与蛋白质 G 磁珠²³耦合，进行反复的免疫磁选择。
   1. 简言之，用磁珠与抗VAR2CSA抗体耦合的晚期三磷酸盐-IE孵育，并使用磁铁进行正向选择。
   2. 将培养中的选定寄生虫扩展几个周期，直到寄生虫病至少为 5%。
   3. 或者，选择与塑料固定CSA（VAR2CSA的受体）结合的寄生虫，如前面描述^的24。
4. 要验证VAR2CSA表达对选定的寄生虫执行流细胞测量，如前面描述^的25。
   1. 简言之，用用于磁性选择的相同抗体（步骤1.3）标记晚期三磷酸盐-IE，然后是荧光标记的二级抗体。
   2. 通过流式细胞测量测量 IE 表面反应。成功的抗体选择通常导致寄生虫群体在大多数寄生虫中表达VAR2CSA（≈80%）。
5. 对于噬菌体测定，使用纯化的中晚期三磷酸盐。使用前面描述的磁分离进行纯^{化，如前面所述}。
   注:为了准确确定寄生虫的阶段，对血液涂片进行Giemsa染色，然后进行光显微镜观察。遵循标准程序和形态学指南，如^{27之前所述}。后期纯化也可以使用密度梯度介质进行。然而，在我们的经验中，IE的收率较低，因此，磁纯化是可取的。
   1. 对于磁性分离，在室温下以 500 x g 旋转寄生虫培养（5-10% 寄生虫）旋转 10 分钟。去除上一提液，在10mL的寄生虫培养培养培养中重新悬浮细胞颗粒。
   2. 将寄生虫悬浮液加入到与磁铁耦合的 CS 柱中（ 参见材料表），让它慢慢穿过该柱。特罗福佐石-IEs是顺磁的（由于血佐因的存在），并将留在柱网中。
   3. 用50 mL的寄生虫培养培养培养柱清洗柱，使用50mL的寄生虫培养培养培养，从磁柱中洗出一个。
6. 在室温下，在 500 x g 下将埃卢酸盐从 1.5.3 旋转 10 分钟。小心丢弃上那物，在1mL的寄生虫培养培养中重新悬浮。
7. 使用血细胞计，计算 IEs 的数量（通过光显微镜很容易识别为具有深色血佐素色素的红细胞）和总细胞数，以计算最终寄生虫（IEs 的百分比）。
   注:仅使用纯度至少为 80%（80% IEs）的寄生虫。
8. 根据计划用于测试的血清/抗体样本数量，估计所需的 IE 总量，并相应地扩大寄生虫培养物。一个75厘米² 培养瓶与25 mL的培养在5%血肿和5-10%寄生虫应产生足够的 IEs 运行一个完整的96井板。对于全板（42 个样品加上 6 个重复的控件），至少需要 1.5 mL 寄生虫悬浮液，在 3.3 x 10⁷ IEs/mL 时。

2. THP-1细胞

注:THP-1细胞系用于此测定。此单细胞细胞系来自单细胞白血病²⁸ 患者，可从 ATCC 购买。根据 THP-1 培养介质中的提供者说明维护单元系（ 参见材料表）。

1. 为定期维护，当细胞浓度达到8 x 10 5细胞/mL时，在2-4 x 10⁵细胞/mL下开始THP-1细胞培养和亚培养。⁵
   注:不要让细胞浓度超过1 x 10^{6 6} 细胞/mL，并跟踪通过编号。避免使用超出第 25 段的细胞。THP-1 细胞系的平均倍增时间在 19-50 小时之间变化。在开始吞噬实验之前，确定细胞批次的倍增时间。这将有助于大致估计要测试的确定数量的血清样本所需的培养量（例如，对于完整的96井板，需要5 x 10⁵ 细胞/mL的培养量10 mL）。
2. 定期检查THP-1细胞的Fc+受体III（CD64）、II（CD32）和III（CD16）的表面表达，如前面^所述的15。
   1. 简言之，在室温下用抗CD64、抗CD32和抗CD16荧光标记抗体（材料表）将THP-1细胞（单独）染色30分钟（PBS中2%FBS中准备的1:100稀释）。
   2. 在 PBS 中用 2% FBS 洗涤三次，通过流式细胞仪测量表面染色。
      注:THP-1细胞对CD16呈阴性，CD32和CD64为阳性，如先前^{报告的第29、30（,30}图1）。
3. 对于噬菌体测定，在实验前一天设置具有2.5 x 10⁵ 细胞/mL的THP-1细胞培养瓶，在测定当天产生约5 x 10⁵ 细胞/mL。
   注:确保测定当天存在4-6 x^{10 5} 个细胞/mL。

3. 噬菌体测定（图S1）

1. 在开始检测之前，块 （>1 h） 两个圆底 96 孔板（一个用于异化，另一个用于噬菌体病），使用 150 μL 每孔无菌 2% FBS 在 PBS 中。
   注:标签板1作为标的板，并使用它为溴化乙基（EtBr）染色和去松化。标签板2作为噬菌体板，并用于THP-1细胞电镀和噬菌体步骤。
2. 寄生虫染色和操作
   1. 以 1.6 中制备的 IE 悬浮液，通过添加寄生虫培养基和 EtBr 将细胞计数调整为 3.3 x^{10 7 7 7} ML，以达到 2.5 μg/mL 的最终浓度（1:40 稀释，从 0.1 mg/mL 库存）。
      注:EtBr染色寄生虫DNA，允许通过流式细胞学检测。
      注意:EtBr 是一种突变和皮肤、眼睛和呼吸刺激物。根据当地法规，采取适当措施保护和处理废物。
   2. 从 96 个孔板（气化板）之一中拆下阻塞溶液，轻拂板，并清除一块毛巾纸上多余的液体。
   3. 在上面的板的上半部分加入上面准备的 IE 悬浮液井 30 μL。留空一井，加入30μL的寄生虫培养培养（没有用于THP-1单独控制的ES）。（图 S2A） 。在室温下孵育10分钟，防止光线。
   4. 每井添加170μL的寄生虫培养培养。在室温下以 500 x g 旋转 板 3 分钟，然后将盘子轻拂到适当的废物容器上，去除上流水线。
   5. 使用每井200 μL的寄生虫培养介质将带 EtBr 标签的 IE 再次清洗两次，在室温下以 500 x g 旋转板 3 分钟。第一次洗涤的上一次洗涤可以通过轻拂板去除。使用多通道移液器小心地从第二次洗涤中去除上流液，以确保去除整个洗涤介质体积。请勿干扰颗粒。
   6. 在寄生虫培养基中以所需浓度制备的 30 μL 抗体/血浆/血清溶液中重新悬挂 EtBr 标记的 IE。
   7. 始终包括以下控制（图S2B）:没有 IEs/THP-1 细胞控制的对照（寄生虫培养培养本）;没有任何抗体或血浆/血清的对照（非对照控制）;使用市售的兔子抗人类红细胞抗体在1:100稀释的阳性对照（ 见材料表）;两个阴性血浆/血清对1:5稀释（疟疾天真池和疟疾暴露男性池）;和阳性血清控制在1:5稀释（从疟疾暴露的妇女，谁以前怀孕（最好是多重力）池）。
      注:阳性对照的1:100稀释似乎在不同批次购买的抗体之间一致工作（未显示数据）。但是，建议在每次使用新一批抗体时，通过测试几种稀释法来排除批次之间的变异。
   8. 在37°C的黑暗中孵育45分钟。
3. THP-1细胞制剂和吞噬
   1. 当 I 被评估 （3.2.8） 时，开始准备 THP-1 细胞。
   2. 从培养瓶中去除 THP-1 细胞，将其旋转下来（室温下为 500 x g 5 分钟），在 THP-1 细胞培养培养培养中去除上一提液并重新悬浮颗粒。
   3. 再次旋转（500 x g， 室温下5分钟），在THP-1细胞培养培养培养的1 mL中，将上一级液中下一个液位重新悬浮。
   4. 确定上述溶液中的细胞计数，并添加更多介质，以获得 5 x 10^{5 5 细胞} /mL 的最终浓度。
   5. 通过轻拂板并去除毛巾纸上多余的液体，从剩余的 96 井板（磷酸化板）中去除阻塞溶液。
   6. 在3.3.4中制备的THP-1细胞悬浮液每井添加100μL，并放回细胞培养箱中（图S2C）。
   7. 抗体/血浆/血清孵育时间结束后，每井添加170μL的寄生虫培养基。在室温下以 500 x g 旋转 板 3 分钟，然后将盘子轻拂到适当的废物容器上，去除上流水线。
   8. 使用每井200μL的寄生虫培养培养介质，将蛋白化的 IEs 再次清洗两次，在室温下以 500 x g 旋转板 3 分钟。第一次洗涤的上一次洗涤可以通过轻拂板去除。使用多通道移液器小心地从第二次洗涤中去除上流液，以确保去除整个洗涤介质体积。请勿干扰颗粒。
   9. 最后在预热的THP-1细胞培养培养培养的100μL中重新悬浮了蛋白化的ES。将 50 μL 的蛋白化 IE 悬浮液转移到噬菌体板中的每一个井中。由于总共有 100 μL 的 IE，因此每个抗体/血清稀释都可以在噬菌体板中重复运行 （图S2D）
      注:测定中使用的 I 和 THP-1 细胞量对应于 10:1 的比例。
   10. 在黑暗中37°C孵育40分钟_，CO25% 。
       注:不要让吞噬继续超过40分钟。
   11. 在4°C（500 x g，5分钟）下离心停止噬菌体，通过轻拂板丢弃上经剂。加入150μL的室温氯化铵解合溶液（材料表），通过移液混合，孵育整整3分钟。
       注:此步骤将解化尚未由 THP-1 细胞吞噬的红细胞。
   12. 在 PBS 中加入 100 μL 的冰冷 2% FBS，从而停止解笑。在 4 °C（500 x g 3 分钟）旋转板，然后通过轻拂板在适当的废物容器上去除上流水。
   13. 在 PBS 中，使用每井 200 μL 的 200 μL 在 4°C（500 x g 3 分钟）旋转板时洗涤三次。最后洗涤后，在PBS中重新悬浮200μL的冰冷2%FBS，并立即通过流量细胞测定进行分析。
       注:以前的出版物在流式细胞学³¹之前在2%的半形式醛中使用了细胞固定，但这里显示的结果是在测定完成后立即获得的。不建议通过将板存储在 4°C 时延迟流式细胞测量数据is not采集，因为 EtBr⁼ THP-1 细胞的百分比会迅速衰变（图 S3）。
4. 流式细胞测量采集和分析
   注:任何支持 96 井板格式且具有适当的激光/滤波器测量 EtBr 荧光的流式细胞计都可以使用。
   1. 对于采集，使用线性正向散射（FSC）与线性侧散（SSC）图（使用井）的THP-1单元上的栅极未添加任何一个（图2A），并在此门上获取10，000个事件。
   2. 使用直方图图测量 THP-1 门上的 EtBr （FL3-Log） 的荧光强度。
   3. 对于浇注，在FSC与SSC密度图中THP-1细胞上的第一个栅极，使用井没有添加一个，没有添加一个（图2A）。然后使用 THP-1 单元（未添加 IE）和未结果控制（图2B）在 FL3 （EtBr） 直方图中设置正门。
   4. 在同一个板中测试的所有其他样本中复制这些门，并确定 EtBr 阳性 THP-1 细胞（至少经过一个 IE 的 THP-1 细胞）的百分比。对于每个测试样本，吞噬菌体可以报告为绝对值（EtBr⁺ THP-1细胞的百分比）或相对吞噬症，使用正对照作为最大值计算为百分比。

结果

在这里，我们详细介绍了^{一个协议，以前描述31，}并使用^{11，12，13，14，15，16，17，18,14,15,16,17,1811,12,}测量抗体的能力，目标为P.恶性疟原虫的表，诱导蛋白石化和吞噬的THP...

讨论

这里提出的协议先前已经描述，^{并使用,12，15，17，31,31}测量抗体的能力，针对P.恶性疟原虫的表层，以诱导蛋白位和吞噬的THP-1细胞。^15,此处提供的结果侧重于生活在恶性疟原虫流行地区的妇女的血浆/血清中自然获得的VAR2CSA特异性抗体。VAR2CSA 是一种参与 IEs 的塞盘固存的 PfEMP1 类型，是 ...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96 well cell culture plates, round bottom with lid	Corning	3799	Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-II	Gibco	11021-037
AlbuMAX-II (5%)	-	-	5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibody	Abcam	ab34858	Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBS	Sigma	P8622
Dynabeads Protein G	Invitrogen	10003D
Ethidium bromide solution	Sigma	E1510	Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometer	Beckman Coulter		Any flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco	10099-141	Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16	BD Biosciences	555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32	BD Biosciences	552883
FITC mouse anti-human CD64	BD Biosciences	555527
FlowLogic software	Inivai technologies		Any flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL)	Sigma	G1272
Hypoxanthine	Sigma	H9377
L-glutamine (200mM)	Sigma	G7513
Lysing solution	-	-	15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesories	Miltenyi Biotec	130-041-305
Parasite culture medium	-	-	2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)	Sigma	P0781
RPMI-1640 medium	Sigma	R5886
THP-1 culture medium	-	-	10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnet	Miltenyi Biotec