JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא לספק הוראה כיצד למדוד את היכולת של נוגדנים הנוכחי סרה או פלזמה של אנשים, באופן טבעי חשוף Plasmodium זיהום falciparum, כדי opsonize ו לגרום phagocytosis של אריתרוציטים נגועים טפילים (IEs).

Abstract

הפרוטוקול מתאר כיצד להגדיר ולהפעיל זרימה ציטומטריה מבוססי phagocytosis אסייג של Plasmodium falciparum-נגוע אריתרוציטים (IEs) opsonized על ידי נוגדנים IgG שנרכשו באופן טבעי ספציפי עבור VAR2CSA. VAR2CSA הוא אנטיגן טפיל המתווכת את ההפרדה הסלקטיבית של IEs שליה שיכול לגרום לצורה חמורה של מלריה בנשים בהריון, הנקרא מלריה שליה (PM). הגנה מפני PM מתווך על ידי נוגדנים ספציפיים VAR2CSA כי הם האמינו לתפקד על ידי עיכוב ההשתה שליה ו / או על ידי opsonizing IEs עבור phagocytosis. ה-assay משתמש IEs בשלב מאוחר מסונכרן in vitro שנבחרו במבחנה לבטא VAR2CSA, פלזמה / סרום-נוגדנים מנשים עם חסינות ספציפית PM שנרכש באופן טבעי, ואת קו התא הפוגוציצי THP-1. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לומר את הפונקציונליות של נוגדנים לכל אנטיגן טפיל קיים על פני השטח IE, אם מושרה על ידי חשיפה טבעית או על ידי חיסון. ההסכם מציע הערכה פשוטה ותפוקה גבוהה, עם רבייה טובה, של היבט תפקודי חשוב של חסינות בתיווך נוגדנים במלריה. זה, לכן, שימושי בעת הערכת חסינות קלינית P. falciparum מלריה, גורם מרכזי של תלודים ותמותה באזורים הטרופיים, במיוחד באפריקה שמדרום לסהרה.

Introduction

מלריה היא מחלה הנישנת על ידי וקטור הנגרמת בבני אדם על זיהום עם חמישה מינים שונים של סוג Plasmodium. המינים הנפוצים ביותר הם P. falciparum, שאחראי גם על התפלואה והתמותה הגבוהותביותר 1. מצגת קלינית מלריה משתנה מזיהומים א-תסמינים או שפירים למחלה מסובכת/חמורה, האחרונה מתרחשת בעיקר בילדים מתחת לגיל חמש שנים. חשיפה P. falciparum אינה לגרום חסינות סטרילית, אבל אנשים החיים באזורים אנדמיים לאט לפתח חסינות מפני המחלה הקלינית. הגנה היא גיל / חשיפה תלויה חסינות נרכשת בדרך כלל במהלך 5-10 השנים הראשונות שלהחיים 2. נשים בוגרות הן יוצא מן הכלל חשוב, כמו מלריה חמורה יכולה להתרחש במהלך ההריון במצגת קלינית המכונה מלריה שליה (PM). ראש הממשלה היא סיבה חשובה להפלות, לידה מתות, לידה מוקדמת, משקל לידה נמוך, מוות עוברי ואנמיה אימהית. התנגדות לראש הממשלה מתפתחת על הריונות רצופים3. הגנה מפני PM קשורה לרכישת נוגדנים נגד PfEMP1 מסוג VAR2CSA4,5, אנטיגן אריתרושייט נגוע (IE) החייב לכונדרויטין גופרתי A (CSA) המאפשר IE סירוקציה שליה. נוגדנים לתווך הגנה ביצוע פעילויותפונקציונליות שונות (נבדק ב 6,,7)כולל opsonization של IEs כדי לגרום phagocytosis. מחקרים מוקדמים במבחנה הראו כי נוגדנים יכולים להגביל את צמיחת P. falciparum בנוכחות של מונוציטים באמצעות phagocytosis8,9. מחקרים עדכניים יותר הראו כי רמות גבוהות יותר של נוגדנים הזורמים פוגוציטוזיס קשורים לתוצאות הריון טובות יותר (בהקשר של HIV שיתוף זיהום)10,,11, המציין את הרלוונטיות של פונקציה זו אפקט בתגובה חיסונית שנרכשה באופן טבעי.

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד פונקציה זו של נוגדנים נוכחים פלזמה אנושית / סרום, באמצעות IEs מתורבתת חוץ חוץ להביע VAR2CSA יחד עם קו מונוצייט THP-1. ההסכם שימש בעבר11,12,13,14,15,16,17,18 והואנחשב גישה משופרת וקלה יותר בהשוואהפרוטוקולים מבוססי מיקרוסקופ קודם 8, שכן הוא מאפשר בדיקה של מספר גדול יותר של דגימות נוגדנים בריצה אחת באמצעות כמויות קטנות יותר של נוגדנים ונמנע ספירת מיקרוסקופים מייגעים ומוטה. למרות שהאסא היה בשימוש על ידי מעבדות מרובות וביצועו הוא פשוט מספיק, זה דורש תכנון והכנה זהירים, לכן, פרוטוקול מפורט יאפשר את יישומו על ידי מעבדות וחוקרים חסר ניסיון קודם. אנו משתמשים, כדוגמה, IEs בשלב מאוחר מסונכרן לבטא VAR2CSA opsonized עם נוגדנים נוכחים בסרום שנאספו מנשים עם חסינות ספציפית PM שנרכש באופן טבעי. עם זאת, ניתן לשנות את הפרוטוקול בקלות כדי לומר את הפונקציונליות של נוגדנים לכל אנטיגן טפיל קיים על פני השטח IE, אם מושרה על ידי חשיפה טבעית או על ידי חיסון.

Protocol

דגימות הנסיוב האנושי המשמשות לתוצאות המוצגות כאן נאספו במחקר נפרד19. האוסף אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של מכון נוגוצ'י למחקר רפואי, אוניברסיטת גאנה (מחקר 038/10-11), ועל ידי ועדות האתיקה של המחקר האזורי, אזור הבירה של דנמרק (פרוטוקול H-4-2013-083).

1. תרבות טפילים

הערה: בצע את התקנות המקומיות לטיפול בפתוגנים אנושיים.

  1. שמור על טפילי P. falciparum על פי הפרוטוקול הסטנדרטי כמתוארלפני 20 במדיום תרבות טפילים (ראה טבלת חומרים).
  2. שמור את הטפילים מסונכרנים היטב באמצעות טיפול סורביטול כפי שתואר קודםלכן 21.
  3. כדי להבטיח ביטוי VAR2CSA על פני השטח של IE, לבצע סיבובים חוזרים ונשנים של בחירה חיסונית-מגנטית באמצעות נוגדן נגד VAR2CSA (למשל, PAM1.4 נוגדן, CROSS-תגובתי אנושי מונוקלוני ספציפי IgG22)יחד עם חלבון G-מגנטיחרוזים 23.
    1. בקצרה, דגירה בשלב מאוחר trophozoite-IEs עם חרוזים מגנטיים יחד עם נוגדן ANTI-VAR2CSA ולבחור באופן חיובי באמצעות מגנט.
    2. להרחיב את הטפילים שנבחרו בתרבות לכמה מחזורים עד parasitemia הוא לפחות 5%.
    3. לחלופין, בחר טפילים המאגדים ל- CSA ללא תנועה מפלסטיק (הקולטן עבור VAR2CSA) כפי שתואר קודםלכן 24.
  4. כדי לוודא ביטוי VAR2CSA על הטפילים שנבחרו לבצע ציטומיה זרימה כפי שתואר קודםלכן 25.
    1. בקצרה, לתייג את trophozoite-IEs בשלב מאוחר עם אותו נוגדן המשמש לבחירה מגנטית (שלב 1.3) ואחריו נוגדן משני תיוג פלורסנט.
    2. מדוד את יהוכית פני השטח של IE על-ידי ציתום זרימה. בחירת נוגדנים מוצלחת גורמת בדרך כלל לאוכלוסיית טפילים המבטאת VAR2CSA ברוב הטפילים (≈80%).
  5. לתסיסה של הפוגוציטוזיס, השתמשו בטרופוזואיט-IEs מטוהרים באמצע עד שלב מאוחר. בצע טיהור באמצעות הפרדה מגנטית כפי שתואר קודםלכן 26.
    הערה: כדי לקבוע במדויק את השלב של הטפילים, לבצע הכתמת Giemsa על כתמי דם ואחריו תצפית מיקרוסקופית אור. פעל בהתאם לנוהלי הנהלים הסטנדרטיים ולהנחיות המורפולוגיות כמתוארלפני 27. ניתן לבצע טיהור בשלב מאוחר גם באמצעות צפיפות הדרגתית בינונית. עם זאת, תפוקת ה-IE מניסיוןינו נמוכה יותר, ולכן עדיף טיהור מגנטי.
    1. להפרדה מגנטית, סובבו את תרבות הטפילים (5-10% טפילים) ב-500 x g ל-10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 10 מ"ל של תרבות טפילים בינוני.
    2. הוסף את מתלה הטפיל לעמודת CS בשילוב עם מגנט (ראה טבלת חומרים)ותן לו לעבור באיטיות דרך העמודה. Trophozoite-IEs הם paramagnetic (בשל הנוכחות של המוזוין) ותישאר לתוך רשת הטור.
    3. לשטוף את העמודה עם 50 מ"ל של תרבות טפילים בינוני ולך את IEs מהעמוד המגנטי באמצעות 50 מ"ל של תרבות טפילים בינוני.
  6. סובבו את ההברטה מ-1.5.3 ב-500 x g ל-10 דקות בטמפרטורת החדר. בזהירות להשליך את supernatant ולהשעות מחדש ב 1 מ"ל של תרבות טפילים בינוני.
  7. באמצעות hemocytometer, לספור את מספר IEs (מזוהה בקלות על ידי מיקרוסקופיה אור כמו אריתוציטים עם פיגמנט המוזוין כהה) ומספר תא הכולל כדי לחשב את parasitemia הסופי (אחוז של IEs).
    הערה: השתמש רק טפילים עם לפחות 80% טוהר (80% IEs).
  8. בהתבסס על מספר דגימות הסרום/נוגדן המתוכננות לבדיקה, העריך את הכמות הכוללת של ה-IEs הדרושה וצמצם את תרביות הטפילים בהתאם. בקבוקון תרבות 75 ס"מ2 עם 25 מ"ל של תרבות ב 5% המטוקריט ו 5-10% parasitemia צריך להניב מספיק IEs כדי להפעיל צלחת מלאה 96 באר. עבור לוח מלא (42 דגימות ועוד 6 פקדים בכפילויות), יש צורך בהשעיית טפילים של 1.5 מ"ל לפחות ב- 3.3 x 107 IEs/mL.

2. תאי THP-1

הערה: קו התא THP-1 משמש בהודעה זו. קו תא מונוציט זה נגזר ממטופל עם לוקמיהמונוציטית 28, ניתן לרכוש מ ATCC. שמור על קו התא בהתאם להוראות הספק במדיום תרבות THP-1 (ראה טבלת חומרים).

  1. לצורך תחזוקה שוטפת, הפעל את תרבות התא THP-1 ב- 2-4 x10 5 תאים/מ"ל ותת-תרבות כאשר ריכוז התא מגיע ל- 8 x 105 תאים/מ"ל.
    הערה: אל תאפשר לריכוז התא לחרוג מ- 1 x10 6 תאים/מ"ל ולעקוב אחר מספר המעבר. הימנע משימוש בתאים שהם מעבר למעבר 25. זמן ההכפלה הממוצע של קו התא THP-1 משתנה בין 19-50 שעות. לקבוע את זמן ההכפלה של אצווה התא לפני תחילת ניסויי phagocytosis. זה יעזור בערך להעריך את הכמות הנדרשת של תרבות הדרושה עבור מספר נחוש של דגימות סרום להיבדק (למשל, עבור צלחת מלאה 96 באר, 10 מ"ל של תרבות ב 5 x 105 תאים / מ"ל נדרשים).
  2. בדוק מעת לעת את תאי THP-1 לקבלת ביטוי פני השטח של קולטני Fcơ-I (CD64), II (CD32) ו- III (CD16) כמתוארקודם לכן 15.
    1. בקצרה, הכתים את תאי THP-1 (בנפרד) עם אנטי CD64, אנטי CD32 ואנטי CD16 פלואורסצנטית מסומן נוגדנים(טבלת חומרים)במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר (1:100 דילול הוכן 2% FBS ב PBS).
    2. לשטוף שלוש פעמים עם 2% FBS ב PBS ומדד כתמים פני השטח על ידי ציתום זרימה.
      הערה: תאי THP-1 שליליים עבור CD16 וחיוביים עבור CD32 ו- CD64 כפי שדווחבעבר 29,30 ( איור1).
  3. עבור תסיסת phagocytosis, להגדיר בקבוקון תרבות תא THP-1 עם 2.5 x10 5 תאים / מ"ל יום לפני הניסוי להניב סביב 5 x 105 תאים / מ"ל ביום של ציון.
    הערה: ודא 4-6 x10 5 תאים / מ"ל נוכחים ביום של ההסכם.

3. תסיסה Phagocytosis (איור S1)

  1. לפני תחילת ההתארגנות, לחסום (>1 h) שתי עגול-התחתון 96 לוחות גם (אחד עבור opsonization ועוד עבור phagocytosis) באמצעות 150 μL לכל באר של סטרילי 2% FBS ב PBS.
    הערה: תווית צלחת 1 כמו לוח opsonization ולהשתמש בו גם עבור אתידיום ברומיד (EtBr) כתמימה opsonization. תווית צלחת 2 כמו לוח phagocytosis ולהשתמש הן עבור ציפוי תא THP-1 עבור שלב phagocytosis.
  2. כתמים טפילים ואופוזוניזציה
    1. קח את השעיית IE מוכן 1.6 ולהתאים את ספירת התאים 3.3 x10 7 IEs / מ"ל על ידי הוספת תרבות טפילים בינוני EtBr כדי להשיג ריכוז סופי של 2.5 μg/mL (1:40 דילול, מתוך 0.1 מ"ג/ מ"ל).
      הערה: EtBr מכתים את ה-DNA הטפיל, המאפשר זיהוי על ידי ציתום זרימה.
      התראה: EtBr הוא מוטגן ועור, עין, וגירוי נשימתי. השתמש בהגנה המתאימה והשלך פסולת בהתאם לתקנות המקומיות.
    2. הסר את תמיסת החסימה מאחת מ-96 לוחות הבאר (לוח האופוסוניזציה), העיף את הצלחת והסרת עודף נוזלים על חתיכת נייר מגבת.
    3. הוסף 30 μL לכל באר של מתלי IE שהוכנו לעיל בחצי העליון של הצלחת. השאר אחד ריק היטב ולהוסיף 30 μL של תרבות טפילים בינוני (ללא IEs עבור THP-1 לבד שליטה). (איורS2A). דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ומוגנת מפני אור.
    4. להוסיף 170 μL לכל באר של תרבות טפילים בינוני. סובבו את הצלחת ב-500 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר והסרו את ה-supernatant על-ידי הטסת הצלחת מעל מיכל פסולת מתאים.
    5. לשטוף את IEs תווית EtBr פעמיים נוספות באמצעות 200 μL לכל באר של תרבות טפילים בינוני ספינינג הצלחת ב 500 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להסיר את supernatant מהשטיפה הראשונה על ידי הטסת הצלחת. הסירו בזהירות את הסופרנטנט מהשטף השני באמצעות פיפטה רב ערוצית כדי לוודא שכל נפח הכביסה של מדיום מוסר. נא לא להפריע את הכדור.
    6. להשעות מחדש את IEs התווית EtBr ב 30 μL של נוגדן / פלזמה / תמיסת סרום מוכן בריכוזים הרצויים במדיום תרבות טפילים.
    7. כלול תמיד את הפקדיםהבאים (איור S2B):פקד ללא בקרת תאי IEs/THP-1 (מדיום תרבות טפילים); שליטה ללא נוגדן או פלזמה/סרום (בקרה לא-אופוניסטית); שליטה חיובית באמצעות נוגדן אריתרושייט אנטי-אנושי זמין מסחרית בשעה 1:100 דילול (ראה טבלת חומרים); שתי בקרות פלזמה/סרום שליליות ב-1:5 דילול (בריכה תמימה למלריה ובריכה מזכרים שנחשפו למלריה); ובקרת סרום חיובית ב-1:5 דילול (בריכה של נשים שנחשפו למלריה, שהיו בהריון בעבר (רצוי רב-גרביידי)).
      הערה: דילול של 1:100 עבור השליטה החיובית נראה לעבוד באופן עקבי על פני אצוות שונות של נוגדנים שנרכשו (הנתונים לא מוצגים). עם זאת, מומלץ לשלול וריאציות בין אצוות על ידי בדיקת מספר דילולים בכל פעם אצווה חדשה של נוגדנים משמש.
    8. דגירה במשך 45 דקות בחושך ב 37 °C.
  3. הכנת תאי THP-1 ופלגוציטוזיס
    1. בעוד IEs הם להיות opsonized (3.2.8), להתחיל להכין את תאי THP-1.
    2. הסר את תאי THP-1 מ בקבוקון התרבות, סובב אותם כלפי מטה (500 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר), תסיר את הסופרנטנט והשעה מחדש את הגלולה במדיום תרבות התא THP-1.
    3. ספין שוב (500 x g עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר), decant supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של THP-1 תא תרבות בינונית.
    4. לקבוע את ספירת התאים בפתרון שהוכן לעיל ולהוסיף מדיום יותר כדי להשיג ריכוז סופי של 5 x10 5 תאים/מ"ל.
    5. הסר את תמיסת החסימה מצלחת 96 הבאר הנותרים (צלחת phagocytosis) על-ידי ההפלת הצלחת והסרת עודף נוזל על פיסת נייר מגבת.
    6. להוסיף 100 μL לכל באר של מתלה תא THP-1 מוכן 3.3.4 ולשים בחזרה ב אינקובטור תרבותהתא (איור S2C).
    7. לאחר הנוגדן / פלזמה / סרום זמן הדגירה הסתיים, להוסיף 170 μL לכל באר של תרבות טפילים בינוני. סובבו את הצלחת ב-500 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר והסרו את ה-supernatant על-ידי הטסת הצלחת מעל מיכל פסולת מתאים.
    8. לשטוף את IEs opsonized פעמיים נוספות באמצעות 200 μL לכל באר של תרבות טפילים בינוני, ספינינג הצלחת ב 500 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר. ניתן להסיר את supernatant מהשטיפה הראשונה על ידי הטסת הצלחת. הסירו בזהירות את הסופרנטנט מהשטף השני, תוך שימוש בפיפטה רב-ערוצית כדי לוודא שכל נפח הכביסה של מדיום מוסר. נא לא להפריע את הכדור.
    9. לבסוף להשעות מחדש את IEs opsonized ב 100 μL של THP-1 חימום מראש תא תרבות בינונית. להעביר 50 μL של השעיית IE opsonized לכל באר בצלחת phagocytosis. מאז יש סך של 100 μL של IEs, כל דילול נוגדן / סרום ניתן להפעיל בכפילויות בצלחת phagocytosis (איור S2D)
      הערה: כמות ה-IEs ותאי THP-1 המשמשים בהסאא תואמת ליחס של 10:1.
    10. דגירה במשך 40 דקות בחושך ב 37 °C, 5% CO2.
      הערה: אל תאפשר לפלגוציטוזיס להמשיך במשך יותר מ- 40 דקות.
    11. עצרו את הפאגוציטוזיס על-ידי צנטריפוגציה ב-4°C (500 x g, 5 דקות) והשליכו את הסופרנטנט על-ידי הטסת הלוח. מוסיפים 150 μL של תמיסת אמוניום כלורי בטמפרטורת החדר ( טבלתחומרים) ומערבבים על ידי צנרת, דגירה בדיוק 3 דקות.
      הערה: שלב זה יהיה lyse אריתרושיטים שלא היו phagocytosed על ידי תאי THP-1.
    12. לעצור את הליזה על ידי הוספת 100 μL של קר כקרח 2% FBS ב PBS. סובבו את הצלחת ב-4°C (500 x g למשך 3 דקות) והסרו את ה-supernatant על-ידי הטסת הצלחת מעל מיכל פסולת מתאים.
    13. לשטוף שלוש פעמים באמצעות 200 μL לכל באר של קר כקרח 2% FBS ב PBS ספינינג הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס (500 x גרם עבור 3 דקות). לאחר השטיפה הסופית, להשעות מחדש ב 200 μL של קר כקרח 2% FBS ב PBS ומיד לנתח על ידי ציתימטריה זרימה.
      הערה: פרסומים קודמים השתמשו קיבעון תא ב 2% paraformaldehyde לפני ציתוםזרימה 31, אבל התוצאות שהוצגו כאן נרכשו מיד לאחר השלמת הודעה. דחיית רכישת נתוני ציתימטריה זרימה על ידי אחסון הלוח ב 4 מעלות צלזיוס אינה מומלצת, מאז אחוז תאי EtBr+ THP-1 נרקב במהירות(איור S3).
  4. רכישה וניתוח ציתומיה של זרימה
    הערה: כל ציטומטר זרימה התומך 96 פורמט צלחת גם ויש לייזרים מתאימים / מסננים כדי למדוד פלואורסצנט EtBr ניתן להשתמש.
    1. לרכישה, שער בתאי THP-1 באמצעות פיזור קדמי ליניארי (FSC) לעומת חלקת פיזור צד ליניארי (SSC) באמצעות הבארות לא נוספו(איור 2A)ורכשו 10,000 אירועים בשער זה.
    2. למדוד את עוצמת הפלואורסצנט עבור EtBr (FL3-Log) בשער THP-1 באמצעות עלילה היסטוגרמה.
    3. עבור gating, השער הראשון על תאי THP-1 ב- FSC לעומת SSC צפיפות העלילה, באמצעות הבאות לא היו IEs נוספו(איור 2A). לאחר מכן להגדיר שער חיובי בהיסטוגרמה FL3 (EtBr), באמצעות תאי THP-1 (ללא IEs נוסף) ואת השליטה un-opsonized(איור 2B).
    4. העתק שערים אלה בכל הדגימות האחרות שנבדקו באותה צלחת ולקבוע את אחוז תאי THP-1 חיוביים EtBr (תאי THP-1 בעלי פלגוציטר לפחות IE אחד). עבור כל אחת מהדגימות שנבדקו, phagocytosis ניתן לדווח כערכים המוחלטים (אחוז של תאי EtBr+ THP-1) או כמו phagocytosis יחסי מחושב כאחוז באמצעות הפקד החיובי כמקסימום.

תוצאות

כאן אנו מציגים בפירוט פרוטוקול שתואר בעבר31 והשתמש 11 ,12,13,14,15,15,16,17,18 כדי למדוד את הקיבולת של נוגדנים מיקוד פני השטח של P. falciparum ...

Discussion

הפרוטוקול שהוצג כאן תואר בעבר ונעשה בושימוש 12,15,17,31 כדילמדוד את הקיבולת של נוגדנים מיקוד פני השטח של P. falciparum IEs כדי לגרום opsonization ו phagocytosis על ידי תאי THP-1.15 התוצאות המוצגות כאן מתמקדות בתרופות נוגדנים ספציפיות ל-VAR2CSA ש?...

Disclosures

לסופרים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

Maiken Visti הוא הודה על סיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי מענק (MAVARECA II; 17-02-KU) ממשרד החוץ של דנמרק ומנוהלת על ידי מרכז המעבדות דנידה. ל-funder לא היה כל תפקיד בעיצוב מחקר, איסוף וניתוח נתונים, החלטה לפרסם או הכנת כתב היד.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well cell culture plates, round bottom with lidCorning3799Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-IIGibco11021-037
AlbuMAX-II (5%)--5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibodyAbcamab34858Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBSSigmaP8622
Dynabeads Protein GInvitrogen10003D
Ethidium bromide solutionSigmaE1510Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometerBeckman CoulterAny flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10099-141Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16BD Biosciences555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32BD Biosciences552883
FITC mouse anti-human CD64BD Biosciences555527
FlowLogic softwareInivai technologiesAny flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL)SigmaG1272
HypoxanthineSigmaH9377
L-glutamine (200mM)SigmaG7513
Lysing solution--15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesoriesMiltenyi Biotec130-041-305
Parasite culture medium--2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)SigmaP0781
RPMI-1640 mediumSigmaR5886
THP-1 culture medium--10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnetMiltenyi Biotec

References

  1. World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
  2. Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
  3. Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
  4. Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
  5. Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
  6. Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
  7. Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
  8. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
  9. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
  10. Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
  11. Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
  12. Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
  13. Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
  14. Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
  15. Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
  16. Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
  17. Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
  18. Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
  19. Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
  20. Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
  21. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
  22. Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
  23. Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
  24. Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
  25. Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
  26. Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2013).
  27. WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
  28. Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  29. Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
  30. Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
  31. Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

162phagocytosisopsonizationIEsVAR2CSA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved