JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Общая цель этого протокола заключается в том, чтобы дать инструкцию о том, как измерить способность антител, присутствующих в сере или плазме людей, естественно подверженных Plasmodium falciparum инфекции, чтобы опсонизировать и вызвать фагоцитоз паразитов инфицированных эритроцитов (ИП).

Аннотация

Протокол описывает, как настроить и запустить поток цитометрии основе фагоцитоза анализ Plasmodium falciparum-инфицированныхэритроцитов (ИП) опоясывается естественно приобретенных антител IgG, характерных для VAR2CSA. VAR2CSA является паразитом антиген, который опосредует селективного секвестра ИП в плаценте, которые могут вызвать тяжелую форму малярии у беременных женщин, называется плацентарной малярии (ТЧ). Защита от ТЧ опосредована СПЕЦИФИЧЕСКИМИ антителами VAR2CSA, которые, как полагают, функционируют путем ингибирования плацентарный секвестр и/или путем опосредовки ИП для фагоцитоза. Анализ использует поздней стадии синхронизированных ИП, которые были выбраны в пробирке, чтобы выразить VAR2CSA, плазмы / сыворотки антитела от женщин с естественным приобретенным PM-специфический иммунитет, и фагоцитатической клеточной линии THP-1. Тем не менее, протокол может быть легко изменен, чтобы продать функциональность антител к любому антигену паразита, присутствуют на поверхности IE, будь то индуцированные естественным воздействием или вакцинацией. Анализ предлагает простую и высокую пропускную способность оценки, с хорошей воспроизводимости, важного функционального аспекта антител опосредованного иммунитета при малярии. Поэтому он полезен при оценке клинического иммунитета к малярии P. falciparum, основной причине заболеваемости и смертности в тропиках, особенно в странах Африки к югу от Сахары.

Введение

Малярия является трансмиссивной болезнью, вызываемой у людей при инфицировании пяти различных видов рода Plasmodium. Наиболее распространенным видом является P. falciparum, который также отвечает за наиболее заболеваемости и смертности1. Клиническое представление малярии варьируется от аимптоматических или доброкачественных инфекций до сложных/тяжелых заболеваний, последние происходят в основном у детей в возрасте до пяти лет. Воздействие P. falciparum не вызывает стерильного иммунитета, но у людей, живущих в эндемичных районах, медленно развивается иммунитет против клинической болезни. Защита зависит от возраста/экспозиции, а иммунитет обычно приобретается в течение первых 5-10 лет жизни2. Взрослые женщины являются важным исключением, так как тяжелая малярия может произойти во время беременности в клинической презентации, известной как плацентарный малярии (ТЧ). ТЧ является важной причиной абортов, мертворождений, преждевременных родов, низкой массы тела при рождении, смерти плода и материнской анемии. Сопротивление PM развивается в течение последовательных беременностей3. Защита от ТЧ связана с приобретением антител против PFEMP1 типа VAR2CSA4,5,инфицированного эритроцита (IE) поверхностного антигена, который связывает хондроитин сульфат A (CSA), позволяющий IE секвестрации в плаценте. Антитела посредником защиты выполнения различных функциональных мероприятий(рассмотрены в 6,7), в том числе опсонизации ИЭ, чтобы вызвать фагоцитоз. Ранние исследования in vitro показали, что антитела могут ограничить рост P. falciparum в присутствии моноцитов через фагоцитоз8,9. Более поздние исследования показали, что более высокие уровни фагоцитоз-индуцирующих антител связаны с лучшими исходами беременности (в контексте со-инфекции ВИЧ)10,11, что свидетельствует об актуальности этой функции эффектора в естественно приобретенных иммунных реакций.

Здесь мы представляем протокол для измерения этой функции антител, присутствующих в плазме/сыворотке человека, используя in vitro культурные IEs, выражаюющие VAR2CSA вместе с моноцитной линией THP-1. Анализ был ранее использован11 , 12,13,14,1514,16,17,18 и считаетсяулучшенным и более простой подход по сравнению с предыдущими микроскопомна основе протоколов 8, так как это позволяет тестирование большего числа образцов антител в одном запуске с использованием меньших объемов антител и избежать утомительного и предвзятого подсчета микроскопии. Несмотря на то, что анализ использовался несколькими лабораториями и его выполнение достаточно просто, оно требует тщательного планирования и подготовки, поэтому подробный протокол позволит использовать его лабораториям и исследователям, не имеющим предыдущего опыта. В качестве примера мы используем синхронизированные ИИ на поздней стадии, выражаюющие VAR2CSA, оссонированные антителами, присутствующими в сыворотке крови, собранными у женщин с естественным ТЧ-специфическим иммунитетом. Тем не менее, протокол может быть легко изменен, чтобы продать функциональность антител к любому антигену паразита, присутствуют на поверхности IE, будь то индуцированные естественным воздействием или вакцинацией.

протокол

Образцы сыворотки человека, используемые для представленных здесь результатов, были собраны в отдельномисследовании 19. Коллекция была одобрена Институциональным советом по обзору Института медицинских исследований Мемориала Ногути, Университетом Ганы (исследование 038/10-11), а также региональными комитетами по этике исследований, Столичный регион Дании (протокол H-4-2013-083).

1. Культура паразитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте местным правилам обработки патогенных микроорганизмов человека.

  1. Поддержание P. falciparum паразитов в соответствии со стандартным протоколом, как описанодо 20 в среде культуры паразитов (см. Таблицу материалов).
  2. Держите паразитов плотно синхронизированы с помощью лечения сорбитола, как описано ранее21.
  3. Для обеспечения экспрессии VAR2CSA на поверхности IE, выполните повторные раунды иммунно-магнитного отбора с помощью антитела anti-VAR2CSA (например, антитела PAM1.4, кросс-реактивного человека моноклонального VAR2CSA-специфического IgG22) в сочетании с белком G-магнитныхбусин 23.
    1. Короче говоря, инкубировать поздней стадии трофозоита-IEs с магнитными бусинами в сочетании с анти-VAR2CSA антитела и положительно выбрать с помощью магнита.
    2. Расширьте выбранных паразитов в культуре в течение нескольких циклов, пока паразитмия не составляет не менее 5%.
    3. Кроме того, выберите паразитов, которые связываются с пластиковой иммобилизованной CSA (рецептор VAR2CSA), как описано ранее24.
  4. Для проверки экспрессии VAR2CSA на выбранных паразитах выполняются цитометрии потока, как описаноранее 25.
    1. Короче говоря, этикетка поздней стадии трофозоита-IEs с тем же антителом, используемым для магнитного отбора (шаг 1.3), а затем флуоресцентно помечены вторичные антитела.
    2. Измерьте активность поверхности IE с помощью цитометрии потока. Успешный отбор антител обычно приводит к популяции паразитов, которая выражает VAR2CSA у большинства паразитов (≈80%).
  5. Для анализа фагоцитоза используйте очищенные от середины до поздней стадии тропозоит-IEs. Выполните очистку с помощью магнитного разделения, какописано ранее 26.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для точного определения стадии паразитов, выполнить Giemsa окрашивания на мазки крови следуют наблюдения световой микроскопии. Следуйте стандартным процедурам и морфологическим рекомендациям, описанным до27. Очистка поздней стадии также может быть выполнена с использованием градиентной среды плотности. Доходность IE, однако, по нашему опыту ниже и, следовательно, магнитная очистка предпочтительнее.
    1. Для магнитного разделения, спина паразита культуры (5-10% паразитов) на 500 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Удалите супернатант и повторно приостановит клеточные гранулы в 10 мл среды культуры паразитов.
    2. Добавьте подвеску паразита в CS-колонку в сочетании с магнитом (см. таблицу материалов)и дайте ему медленно пройти через столбец. Трофозоит-IEs являются парамагнитными (из-за присутствия гемозоина) и будет оставаться в колонне сетки.
    3. Вымойте колонку с 50 мл паразита культуры среды и elute IEs от магнитной колонки с помощью 50 мл паразита культуры среды.
  6. Спин элуат от 1.5.3 при 500 x g в течение 10 мин при комнатной температуре. Тщательно отбросьте супернатант и повторно приостанавливайте в 1 мл среды культуры паразитов.
  7. Используя гемоцитометр, подсчитайте количество ИЭ (легко идентифицированных по световой микроскопии как эритроциты с темным гемозоином пигмента) и общее количество клеток для расчета конечной паразитмии (в процентах от IEs).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте только паразитов с по крайней мере 80% чистоты (80% IEs).
  8. Основываясь на количестве образцов сыворотки/антител, запланированных для тестирования, оцените общее количество необходимых ИЭ и соответственно масштабируйте культуры паразитов. 75 см2 культуры колбу с 25 мл культуры на 5% гематокрит и 5-10% паразитамия должна дать достаточно IEs для запуска полного 96 хорошо пластины. Для полной пластины (42 образца плюс 6 элементов управления в дубликате) требуется как минимум 1,5 мл подвески паразита при 3,3х 10 7 ИЭ/мл.

2. Клетки THP-1

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом анализе используется линия ячейки THP-1. Эта линия клеток моноцитов получена от пациента с моноцитическимлейкозом 28 и может быть приобретена у ATCC. Поддерживайте линию ячейки в соответствии с инструкциями поставщика в среде культуры THP-1 (см. таблицу материалов).

  1. Для регулярного обслуживания, начать THP-1 клеточной культуры на 2-4 х10 5 клеток / мл и субкультуры, когда концентрация клеток достигает 8 х 105 клеток / мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте концентрации клеток превышать 1 х 106 клеток / мл и отслеживать проход номер. Избегайте использования ячеек, которые находятся за пределами прохода 25. Среднее время удвоения клеточной линии THP-1 колеблется между 19-50 ч. Определите время удвоения партии клеток перед началом экспериментов с фагоцитозом. Это поможет приблизительно оценить необходимое количество культуры, необходимое для проверки определенного количества образцов сыворотки (например, для полной пластины 96 колодец, 10 мл культуры при 5 х 105 клеток/мл).
  2. Периодически проверяйте клетки THP-1 на поверхностное выражение рецепторов FC-рецепторов I (CD64), II (CD32) и III (CD16), как описаноранее 15.
    1. Короче говоря, пятно THP-1 клетки (отдельно) с анти-CD64, анти-CD32 и анти-CD16 флуоресцентно помечены антитела (Таблицаматериалов ) в течение 30 мин при комнатной температуре (1:100 разбавления подготовлены в 2% FBS в PBS).
    2. Вымойте три раза с 2% FBS в PBS и измерения окрашивания поверхности потоком цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки THP-1 являются отрицательными для CD16 и положительными для CD32 и CD64,как сообщалось ранее 29,30 (Рисунок 1).
  3. Для анализа фагоцитоза, создать THP-1 клеточной культуры колбу с 2,5 х10 5 клеток / мл за день до эксперимента, чтобы дать около 5 х10 5 клеток / мл в день анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что 4-6х 10 5 ячеек / мл присутствуют в день анализа.

3. Анализ фагоцитоза (рисунок S1)

  1. Перед началом анализа, блок (Nogt;1 h) два круглых нижней 96 пластины (один для опсонизации, а другой для фагоцитоза) с использованием 150 йл на колодец стерильных 2% FBS в PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этикетка пластины 1 в качестве опсонизации пластины и использовать его как для бромистого этидия (EtBr) окрашивания и опсонизации. Этикетка пластины 2 как фагоцитоз пластины и использовать как для THP-1 клеточного покрытия и для шага фагоцитоза.
  2. Окрашивание паразитов и опсонизация
    1. Возьмите подвеску IE, подготовленную в 1.6, и отрегулируйте количество клеток до 3,3 х10 7 IEs/mL, добавив среду культуры паразитов и EtBr для достижения окончательной концентрации 2,5 мкг/мл (1:40 разбавления, от 0,1 мг/мл запасов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: EtBr пятна паразита ДНК, что позволяет обнаружения потока цитометрии.
      ВНИМАНИЕ: EtBr является мутаген и кожи, глаз и дыхательных раздражителей. Используйте соответствующую защиту и утилизируете отходы в соответствии с местными правилами.
    2. Удалите блокирующий раствор с одной из пластин 96 хорошо (опсонизация пластины), стряхивая пластины и удаления избытка жидкости над куском полотенцем бумаги.
    3. Добавьте 30 йл на колодец подвески IE, подготовленной выше в верхней половине пластины. Оставьте один хорошо пустой и добавить 30 йл паразита культуры среды (без ИП для THP-1 только контроль). (Рисунок S2A). Инкубировать в течение 10 минут при комнатной температуре и защищены от света.
    4. Добавьте 170 йл на колодец среды культуры паразитов. Спин пластины на 500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и удалить супернатант, щелкивая пластины над соответствующим контейнером отходов.
    5. Вымойте EtBr помечены IEs еще два раза, используя 200 йл на колодец паразита культуры среды спиннинг пластины на 500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Супернатант с первой стирки можно удалить, стряхивая пластину. Аккуратно снимите супернатант со второй стирки с помощью многоканальной пипетки, чтобы убедиться, что весь объем стиральной среды удаляется. Не беспокоить гранулы.
    6. Повторно приостанавливать EtBr-маркированы IEs в 30 йл антитела / плазмы / сыворотки раствора, подготовленного в желаемых концентрациях в среде культуры паразитов.
    7. Всегда включают следующие элементы управления(рисунок S2B):контроль без контроля IEs/THP-1 (среда культуры паразитов); контроль без каких-либо антител или плазмы/сыворотки (неопсонизированный контроль); положительный контроль с использованием коммерчески доступных кролика анти-человеческого эритроцита антитела в 1:100 разбавления (см. Таблицу материалов); два отрицательных контроля плазмы/сыворотки при разбавлении 1:5 (наивный бассейн с малярией и пул мужчин, подвергшихся воздействию малярии); и положительный контроль сыворотки при разбавлении 1:5 (бассейн от женщин, подвергшихся воздействию малярии, которые ранее были беременны (желательно мультигравиды)).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление 1:100 для положительного контроля, кажется, работает последовательно через различные партии закупленных антител (данные не показаны). Тем не менее, рекомендуется исключить различия между партиями, проверяя несколько разбавлений каждый раз, когда используется новая партия антител.
    8. Инкубировать в течение 45 минут в темноте при 37 градусов по Цельсию.
  3. Подготовка клеток THP-1 и фагоцитоз
    1. В то время как IEs в настоящее время opsonized (3.2.8), начать подготовку THP-1 клеток.
    2. Удалите клетки THP-1 из культуры колбы, спина их вниз (500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре), декант супернатант и повторно приостановить гранулы в THP-1 клеточной культуры среды.
    3. Спин снова (500 х г в течение 5 мин при комнатной температуре), декант супернатант и повторно приостановить гранулы клетки в 1 мл THP-1 клеточной культуры среды.
    4. Определите количество клеток в растворе, подготовленном выше, и добавьте больше среды, чтобы получить окончательную концентрацию 5 х10 5 клеток/мл.
    5. Удалите блокирующий раствор из оставшихся 96 хорошо пластины (фагоцитоз пластины), стряхивая пластины и удаления избытка жидкости над куском полотенцем бумаги.
    6. Добавьте 100 л на колодец клеточной суспензии THP-1, подготовленной в 3.3.4, и поместите обратно в инкубатор культуры клеток(рисунок S2C).
    7. После того, как антитела / плазмы / сыворотки инкубации время закончилось, добавить 170 йл на колодец паразита культуры среды. Спин пластины на 500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре и удалить супернатант, щелкивая пластины над соответствующим контейнером отходов.
    8. Вымойте opsonized IEs еще два раза, используя 200 йл на колодец паразита культуры среды, спиннинг пластины на 500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Супернатант с первой стирки можно удалить, стряхивая пластину. Аккуратно снимите супернатант со второй стирки, используя многоканальный пипетку, чтобы убедиться, что весь объем стиральной среды удаляется. Не беспокоить гранулы.
    9. Окончательно re-suspend opsonized IEs в 100 L pre-warmed среды культуры клетки THP-1. Передача 50 йл опсонизированной подвески IE к каждому хорошо в фагоцитоз пластины. Так как существует в общей сложности 100 йЛ IEs, каждое антитело / разбавления сыворотки может быть запущен в дубликаты в фагоцитоз пластины (Рисунок S2D)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ячеек IEs и THP-1, используемых в анализе, соответствует соотношению 10:1.
    10. Инкубационный в течение 40 мин в темноте при 37 градусов по Цельсию, 5% CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте фагоцитозу продолжаться более 40 минут.
    11. Остановите фагоцитоз путем центрифугации при 4 градусах по Цельсию (500 хг, 5 мин) и отбросьте супернатант, щелкнув пластину. Добавьте 150 МКЛ раствора хлорирования аммония комнатной температуры(таблица материалов)и смешайте с помощью пипетки, инкубировать ровно 3 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг будет лизировать эритроциты, которые не были фагоцитозированы клетками THP-1.
    12. Остановите лиз, добавив 100 йл ледяного 2% FBS в PBS. Закрутьте пластину при 4 градусов по Цельсию (500 х г в течение 3 минут) и удалите супернатант, щелкнуть пластину над соответствующим контейнером для отходов. x g
    13. Вымойте три раза, используя 200 йл на колодец ледяной 2% FBS в PBS спиннинг пластины при 4 градусов по Цельсию (500 х г в течение 3 мин). После окончательной стирки, повторно приостановить в 200 йл ледяной 2% FBS в PBS и сразу же проанализировать поток цитометрии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предыдущие публикации использовали фиксацию клеток в 2% параформальдегида доцитометрии потока 31, но результаты, представленные здесь, были получены сразу после завершения анализа. Откладывать сбор данных о цитометрии потока путем хранения пластины при 4 градусов по Цельсию не рекомендуется, так как процентклеток EtBr и THP-1 быстро распадается(рисунок S3).
  4. Приобретение и анализ цитометрии потока
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любой поток цитометра поддержки 96 хорошо формат пластины и имеющие соответствующие лазеры / фильтры для измерения флуоресценции EtBr могут быть использованы.
    1. Для приобретения, ворота на THP-1 клетки с использованием линейного вперед-scatter (FSC) против линейного бокового рассеяния (SSC) участок с использованием скважин не были добавлены IEs (Рисунок 2A) и приобрести 10000 событий на этом ворота.
    2. Измерьте интенсивность флуоресценции для EtBr (FL3-Log) на воротах THP-1 с помощью гистограммы участка.
    3. Для gating, первые ворота на THP-1 клеток в FSC против SSC плотности участка, используя скважины не были добавлены IEs (Рисунок 2A). Затем установите положительные ворота в гистограмме FL3 (EtBr), используя ячейки THP-1 (без добавления IEs) и НЕ-опсонизированный контроль(рисунок 2B).
    4. Копировать эти ворота во всех других образцах, протестированных в той же пластине и определить процент EtBr-положительных клеток THP-1 (THP-1 клеток, которые фагоцитизируют по крайней мере один IE). Для каждого из проверенных образцов, фагоцитоз может быть сообщено как абсолютные значения (процентetBr и THP-1 клеток) или как относительный фагоцитоз рассчитывается в процентах, используя положительный контроль как максимум.

Результаты

Здесь мы представляем подробно протокол, который ранеебыл описан 31 и используется 11,12,13,14,15,16,17,,,18 для измерения способности ант...

Обсуждение

Протокол, представленный здесь, был ранееописан и использован 12,15,17,31 для измерения способностиантител,направленных на поверхность P. falciparum IEs, чтобы вызвать опсонизацию и фагоцитоз клетками THP-1. Представленные з...

Раскрытие информации

Авторов нечего раскрывать.

Благодарности

Майкен Висти благодарит за отличную техническую помощь. Эта работа частично финансировалась за счет гранта (MAVARECA II; 17-02-KU) министерства иностранных дел Дании и администрироваться Центром стипендий Даниды. Спонсор не играл никакой роли в разработке, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well cell culture plates, round bottom with lidCorning3799Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-IIGibco11021-037
AlbuMAX-II (5%)--5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibodyAbcamab34858Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBSSigmaP8622
Dynabeads Protein GInvitrogen10003D
Ethidium bromide solutionSigmaE1510Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometerBeckman CoulterAny flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10099-141Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16BD Biosciences555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32BD Biosciences552883
FITC mouse anti-human CD64BD Biosciences555527
FlowLogic softwareInivai technologiesAny flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL)SigmaG1272
HypoxanthineSigmaH9377
L-glutamine (200mM)SigmaG7513
Lysing solution--15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesoriesMiltenyi Biotec130-041-305
Parasite culture medium--2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)SigmaP0781
RPMI-1640 mediumSigmaR5886
THP-1 culture medium--10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnetMiltenyi Biotec

Ссылки

  1. World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
  2. Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
  3. Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
  4. Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
  5. Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
  6. Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
  7. Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
  8. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
  9. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
  10. Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
  11. Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
  12. Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
  13. Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
  14. Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
  15. Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
  16. Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
  17. Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
  18. Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
  19. Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
  20. Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
  21. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
  22. Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
  23. Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
  24. Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
  25. Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
  26. Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2013).
  27. WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
  28. Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  29. Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
  30. Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
  31. Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

162VAR2CSA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены