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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire istruzioni su come misurare la capacità degli anticorpi presenti nella sera o nel plasma degli individui, naturalmente esposti all'infezione da Plasmodium falciparum, di opsonizzare e indurre la fagonitosi degli etriciti infettati da parassiti (IE).

Abstract

Il protocollo descrive come impostare ed eseguire un'analisi della faciocitosi basata sulla citometria di flusso di erythrociti (IE) infettati da Plasmodium falciparum(IEs) opsonizzati da anticorpi IgG acquisiti naturalmente specifici per VAR2CSA. VAR2CSA è l'antigene parassita che media il sequestro selettivo di IE nella placenta che può causare una grave forma di malaria nelle donne in gravidanza, chiamata malaria placentale (PM). La protezione da PM è mediata da anticorpi specifici di VAR2CSA che si ritiene funzionino inibendo il sequestro placente e/o opsonizzando IEs per la fagocitosi. Il saggio impiega IE sincronizzati in fase avanzata che sono stati selezionati in vitro per esprimere VAR2CSA, plasma/siero-anticorpi da donne con immunità specifica PM acquisita naturalmente, e la linea cellulare fagocitica THP-1. Tuttavia, il protocollo può essere facilmente modificato per valutare la funzionalità degli anticorpi contro qualsiasi antigene parassita presente sulla superficie IE, sia indotto dall'esposizione naturale o dalla vaccinazione. Il saggio offre una valutazione semplice e ad alto rendimento, con buona riproducibilità, di un importante aspetto funzionale dell'immunità mediata dagli anticorpi nella malaria. È quindi utile quando si valuta l'immunità clinica alla malaria di P. falciparum, una delle principali cause di morbilità e mortalità nei tropici, in particolare nell'Africa sub-sahariana.

Introduzione

La malaria è una malattia trasmessa da vettori causata nell'uomo dopo l'infezione con cinque diverse specie del genere Plasmodium. La specie più diffusa è P. falciparum, che è anche responsabile della maggior morbilità e mortalità1. La presentazione clinica della malaria varia da infezioni asintomatiche o benigne a malattie complicate/gravi, quest'ultima che si verifica principalmente nei bambini di età inferiore ai cinque anni. L'esposizione a P. falciparum non induce l'immunità sterile, ma gli individui che vivono in aree endemiche sviluppano lentamente l'immunità contro la malattia clinica. La protezione dipende dall'età/esposizione e l'immunità viene normalmente acquisita durante i primi 5-10 anni di vita2. Le donne adulte sono un'eccezione importante, in quanto la malaria grave può verificarsi durante la gravidanza in una presentazione clinica nota come malaria placenteale (PM). Pm è una causa importante di aborto, parto morto, parto prematuro, basso peso alla nascita, morte fetale e anemia materna. La resistenza al PM si sviluppa su gravidanze successive3. La protezione da PM è associata all'acquisizione di anticorpi contro il tipo VAR2CSA PfEMP14,5, un antigene superficiale di etritocite infetto (IE) che si lega al solfato di condroitina A (CSA) consentendo il sequestro IE nella placenta. Gli anticorpi mediano la protezione svolgendo varie attività funzionali (riviste in6,7) tra cui l'opsonizzazione di IE per indurre la fagocitosi. I primi studi in vitro hanno dimostrato che gli anticorpi possono limitare la crescita di P. falciparum in presenza di monociti tramite fagocitosi8,9. Studi più recenti hanno dimostrato che livelli più elevati di anticorpi che inducono la fagocitosi sono associati a migliori esiti di gravidanza (nel contesto della co-infezione da HIV)10,11, indicando la rilevanza di questa funzione ersione nella risposta immunitaria naturalmente acquisita.

Qui presentiamo un protocollo per misurare questa funzione di anticorpi presenti nel plasma/siero umano, utilizzando IE in vitro colture che esprimono VAR2CSA insieme alla linea monocita THP-1. Il saggio è stato precedentemente utilizzato11,12,13,1414,15,16,17,18 edè considerato un approccio migliorato e più facile rispetto ai protocolli precedenti basati sumicroscopio 8, poiché consente la sperimentazione di un maggior numero di campioni di anticorpi in una singola corsa utilizzando piccoli volumi di anticorpi ed evitando il conteggio della microscopia noiosa e di parte. Anche se il saggio è stato utilizzato da più laboratori e la sua esecuzione è abbastanza semplice, richiede un'attenta pianificazione e preparazione, quindi, un protocollo dettagliato consentirebbe la sua applicazione da laboratori e ricercatori privi di esperienza precedente. Usiamo, ad esempio, IE sincronizzati in fase avanzata che esprimono VAR2CSA opsonizzati con anticorpi presenti nel siero raccolti da donne con immunità specifica PM acquisita naturalmente. Tuttavia, il protocollo può essere facilmente modificato per valutare la funzionalità degli anticorpi contro qualsiasi antigene parassita presente sulla superficie IE, sia indotto dall'esposizione naturale o dalla vaccinazione.

Protocollo

I campioni di siero umano utilizzati per i risultati qui presentati sono stati raccolti in uno studio separato19. La raccolta è stata approvata dall'Institutional Review Board del Noguchi Memorial Institute for Medical Research dell'Università del Ghana (studio 038/10-11) e dai Comitati Etici di Ricerca Regionali, Regione Capitale della Danimarca (protocollo H-4-2013-083).

1. Cultura parassita

NOTA: Seguire le normative locali per la manipolazione dei patogeni umani.

  1. Mantenere i parassiti P. falciparum secondo il protocollo standard come descritto prima20 nel mezzo di coltura dei parassiti (vedi Tabella dei materiali).
  2. Mantenere i parassiti strettamente sincronizzati utilizzando il trattamento del sorbitolo come descritto in precedenza21.
  3. Per garantire l'espressione VAR2CSA sulla superficie dell'IE, eseguire ripetuti cicli di selezione immuno-magnetica utilizzando un anticorpo anti-VAR2CSA (ad esempio, anticorpo PAM1.4, un IgG222specifico monoclonale umano cross-reattivo accoppiato alla proteina G-magneticheperline 23.
    1. In breve, incubare la trophozoite-IE in fase avanzata con perline magnetiche accoppiate ad un anticorpo anti-VAR2CSA e selezionate positivamente utilizzando un magnete.
    2. Espandere i parassiti selezionati in coltura per alcuni cicli fino a quando la parassitimia è almeno del 5%.
    3. In alternativa, selezionare i parassiti che si legano alla CSA in plastica (il recettore per VAR2CSA) come descritto inprecedenza 24.
  4. Per verificare l'espressione VAR2CSA sui parassiti selezionati eseguire la citometria di flusso come descritto inprecedenza 25.
    1. In breve, etichettare la trophozoite-IE in fase avanzata con lo stesso anticorpo utilizzato per la selezione magnetica (punto 1.3) seguito da un anticorpo secondario etichettato in modo fluorescente.
    2. Misurare la reattività della superficie di IE in base alla citometria del flusso. La selezione degli anticorpi di successo normalmente si traduce in una popolazione di parassiti che esprime VAR2CSA nella maggior parte dei parassiti (≈80%).
  5. Per il saggio della fagocitosi, utilizzare la trophozoite-IE purificata a metà-stadio tardivo. Eseguire la purificazione utilizzando la separazione magnetica come descritto inprecedenza 26.
    NOTA: Per determinare con precisione lo stadio dei parassiti, eseguire la colorazione Giemsa su strisci di sangue seguiti da osservazione leggera della microscopia. Seguire le procedure standard e le linee guida morfologiche descritte primadel 27. La purificazione in fase avanzata può essere eseguita anche utilizzando il mezzo di pendenza della densità. La resa di IE, tuttavia, nella nostra esperienza è inferiore e, quindi, la purificazione magnetica è preferibile.
    1. Per la separazione magnetica, far girare la coltura del parassita (5-10% di parassitia) a 500 x g per 10 min a temperatura ambiente. Rimuovere il supernante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 10 mL di mezzo di coltura parassita.
    2. Aggiungere la sospensione del parassita in una colonna CS accoppiata a un magnete (vedere Tabella dei materiali) e lasciarla passare lentamente attraverso la colonna. I Trophozoite-IE sono paramagnetici (a causa della presenza di emozoina) e rimarranno nella rete di colonne.
    3. Lavare la colonna con 50 mL di media coltura parassita e elute le IE dalla colonna magnetica utilizzando 50 mL di mezzo di coltura parassita.
  6. Ruotare l'eluiato da 1,5,3 a 500 x g per 10 min a temperatura ambiente. Scartare con cura il supernatant e ri-sospendere in 1 mL di mezzo di coltura parassita.
  7. Utilizzando un emocitometro, contare il numero di IE (facilmente identificabili dalla microscopia leggera come eritrociti con pigmento emozoina scuro) e il numero totale di cellule per calcolare la parassita finale (percentuale di IEs).
    NOTA: Utilizzare solo parassiti con almeno l'80% di purezza (80% IEs).
  8. Sulla base del numero di campioni di siero/anticorpi previsti per il test, stimare la quantità totale di IE necessaria e aumentare di conseguenza le colture di parassiti. Un flacone di 75 cm2 con 25 mL di coltura al 5% di ematocrito e 5-10% parassita dovrebbe produrre abbastanza IE per eseguire un piatto completo di 96 pozzetti. Per una piastra completa (42 campioni più 6 controlli in duplicato), sono necessarie una sospensione minima di 1,5 mL di parassiti a 3,3 x10 7 IE/mL.

2. Cellule THP-1

NOTA: La linea di celle THP-1 viene utilizzata in questo saggio. Questa linea cellulare monocita è derivata da un paziente con leucemia monocitica28 e può essere acquistata da ATCC. Mantenere la linea della cella in base alle istruzioni del provider nel supporto di coltura THP-1 (vedere Tabella dei materiali).

  1. Per una manutenzione regolare, iniziare la coltura cellulare THP-1 a 2-4 x 105 celle/mL e sottocultura quando la concentrazione cellulare raggiunge 8 x 105 celle/mL.
    NOTA: Non consentire alla concentrazione cellulare di superare 1 x 106 celle/mL e tenere traccia del numero di passaggio. Evitare l'uso di cellule che sono oltre il passaggio 25. Il tempo medio di raddoppio della linea cellulare THP-1 varia tra 19-50 h. Determinare il tempo di raddoppio del lotto cellulare prima di iniziare gli esperimenti di fagonecitosi. Ciò contribuirà a stimare approssimativamente la quantità necessaria di coltura necessaria per un determinato numero di campioni di siero da testare (ad esempio, per una piastra completa di 96 pormi, sono necessari 10 mL di coltura a 5 x10 5 cellule/mL).
  2. Controllare periodicamente le cellule THP-1 per l'espressione superficiale dei Fcγ-recettori I (CD64), II (CD32) e III (CD16) comedescritto in precedenza 15.
    1. In breve, macchiare le cellule THP-1 (separatamente) con anticorpi anti-CD64, anti-CD32 e anti-CD16 con etichetta fluorescente(Tabella dei Materiali) per 30 min a temperatura ambiente (1:100 diluizione preparata nel 2% FBS in PBS).
    2. Lavare tre volte con il 2% di FBS in PBS e misurare la colorazione superficiale mediante citometria di flusso.
      NOTA: le celle THP-1 sono negative per CD16 e positive per CD32 e CD64 come riportato inprecedenza 29,30 ( Figura1).
  3. Per il saggio sulla fagocitosi, impostare un flacone di coltura cellulare THP-1 con 2,5 x10 5 cellule/mL il giorno prima dell'esperimento per produrre circa 5 x10 5 cellule/mL il giorno del saggio.
    NOTA: Assicurarsi che 4-6 x10 5 celle/mL siano presenti il giorno del saggio.

3. Analisi della fagocitosi (Figura S1)

  1. Prima di iniziare il saggio, bloccare (>1 h) due piastre di pozzo 96 dal fondo rotondo (una per l'opsonizzazione e un'altra per la fagocitosi) utilizzando 150 lL per pozzo di sterile 2% FBS in PBS.
    NOTA: etichettare la piastra 1 come piastra di opsonizzazione e utilizzarla sia per la colorazione ethidium bromuro (EtBr) che per l'opsonizzazione. Etichettare la piastra 2 come piastra di fagocitosi e utilizzare sia per la placcatura cellulare THP-1 e per la fase di fagocitosi.
  2. Colorazione e opsonizzazione dei parassiti
    1. Prendere la sospensione IE preparata in 1,6 e regolare il numero di cellule a 3,3 x 107 IE/mL aggiungendo il mezzo di coltura del parassita e l'EtBr per ottenere una concentrazione finale di 2,5 g/mL (1:40 diluizione, da uno stock di 0,1 mg/mL).
      NOTA: EtBr macchia il DNA del parassita, consentendo il rilevamento per citometria del flusso.
      CAUTION: EtBr è un mutageno e pelle, occhio, e irritante respiratorio. Utilizzare un'adeguata protezione e smaltire i rifiuti secondo le normative locali.
    2. Rimuovere la soluzione di blocco da una delle 96 piastre di pozzo (piastra di opsonizzazione), facendo scorrere la piastra e rimuovendo l'eccesso di liquido su un pezzo di carta assorbente.
    3. Aggiungere 30 L per pozzo della sospensione IE preparata sopra nella metà superiore della piastra. Lasciare un pozzo vuoto e aggiungere 30 L di mezzo di coltura parassita (senza IE per il controllo da solo THP-1). (Figura S2A). Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente e protetto dalla luce.
    4. Aggiungere 170 L per pozzo di mezzo di coltura parassita. Ruotare la piastra a 500 x g per 3 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernante facendo scorrere la piastra su un contenitore di rifiuti appropriato.
    5. Lavare gli IE etichettati con EtBr altre due volte utilizzando 200 L per pozzo di coltura parassita media filatura della piastra a 500 x g per 3 min a temperatura ambiente. Il supernatanto del primo lavaggio può essere rimosso facendo scorrere la piastra. Rimuovere con attenzione il supernatant dal secondo lavaggio utilizzando una pipetta multicanale per assicurarsi che l'intero volume del mezzo di lavaggio venga rimosso. Non disturbare il pellet.
    6. Sospendere nuovamente gli IE etichettati con EtBr in 30 L di anticorpo/plasma/siero soluzione preparata alle concentrazioni desiderate nel mezzo di coltura dei parassiti.
    7. Includere sempre i seguenti controlli ( Figura 2B ): un controllo senza controllo delle celle IEs/THP-1 (media di coltura del parassita); un controllo senza anticorpi o plasma/siero (controllo non opsonizzato); un controllo positivo utilizzando l'anticorpo antiritocidato anti-umano coniglio disponibile in mercato a 1:100 diluizione (c'è la tabella dei materiali); due controlli negativi del plasma/siero a 1:5 diluizione (una piscina malaria-ingenua e una piscina da maschi esposti alla malaria); e un controllo positivo del siero a 1:5 diluizione (una piscina da donne esposte alla malaria, che in precedenza sono state incinte (preferibilmente multigravidae)).
      NOTA: Una diluizione 1:100 per il controllo positivo sembra funzionare in modo coerente su diversi lotti di anticorpi acquistati (dati non mostrati). Tuttavia, si raccomanda di escludere le variazioni tra i lotti testando diverse diluizioni ogni volta che viene utilizzato un nuovo lotto di anticorpi.
    8. Incubare per 45 minuti al buio a 37 gradi centigradi.
  3. Preparazione delle cellule THP-1 e fagonesi
    1. Mentre le IE sono in fase di opsonized (3.2.8), iniziare a preparare le cellule THP-1.
    2. Rimuovere le cellule THP-1 dal pallone di coltura, girarle verso il basso (500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente), decantare il supernante e ri-sospendere il pellet nel mezzo di coltura cellulare THP-1.
    3. Girare di nuovo (500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente), decantare il supernante e sospendere nuovamente il pellet cellulare in 1 mL di THP-1 base di coltura cellulare.
    4. Determinare il numero di celle nella soluzione preparata sopra e aggiungere più mezzo per ottenere una concentrazione finale di 5 x10 5 cellule / mL.
    5. Rimuovere la soluzione di blocco dalla piastra di 96 pozzetto rimanente (piastra di fagocitosi) facendo scorrere la piastra e rimuovendo l'eccesso di liquido su un pezzo di carta assorbente.
    6. Aggiungere 100 L per pozzo della sospensione cellulare THP-1 preparata in 3.3.4 e rimetterli nell'incubatore di coltura cellulare (Figura S2C).
    7. Una volta che il tempo di incubazione anticorpo/plasma/siero è terminato, aggiungere 170 L per pozzo di mezzo di coltura parassitaria. Ruotare la piastra a 500 x g per 3 minuti a temperatura ambiente e rimuovere il supernante facendo scorrere la piastra su un contenitore di rifiuti appropriato.
    8. Lavare l'IEs opsonizzato altre due volte utilizzando 200 L per pozzo di mezzo di coltura parassita, ruotando la piastra a 500 x g per 3 min a temperatura ambiente. Il supernatanto del primo lavaggio può essere rimosso facendo scorrere la piastra. Rimuovere con cura il supernatant dal secondo lavaggio, utilizzando una pipetta multicanale per assicurarsi che l'intero volume del mezzo di lavaggio venga rimosso. Non disturbare il pellet.
    9. Infine, riassate le IE opsonizzate in 100 L di mezzo di coltura cellulare THP-1 pre-riscaldata. Trasferire 50 L di sospensione IE opsonizzata ad ogni pozzo nella piastra di fagocitosi. Poiché vi è un totale di 100 L di IE, ogni anticorpo/diluizione del siero può essere eseguito in duplicati nella piastra di fagocitosi (Figura S2D)
      NOTA: la quantità di celle IE e THP-1 utilizzate nel saggio corrisponde a un rapporto 10:1.
    10. Incubare per 40 min al buio a 37 gradi centigradi, 5% CO2.
      NOTA: Non permettere alla fagocitosi di procedere per più di 40 min.
    11. Fermare la fagocitosi con la centrifugazione a 4 gradi centigradi (500 x g, 5 min) e scartare il supernante facendo scorrere la piastra. Aggiungere 150 L della soluzione di la percorsi del cloruro di ammonio a temperatura ambiente (Tabella dei materiali) e mescolare mediante pipetta, incubare per esattamente 3 min.
      NOTA: Questo passaggio lyserà gli erythrociti che non sono stati phagocytosed dalle cellule THP-1.
    12. Fermare la lisi aggiungendo 100 L di ghiaccio-freddo 2% FBS in PBS. Ruotare la piastra a 4 gradi centigradi (500 x g per 3 min) e rimuovere il supernante facendo scorrere la piastra su un contenitore di rifiuti appropriato.
    13. Lavare tre volte con 200 L per pozzo di ghiaccio freddo 2% FBS in PBS filatura della piastra a 4oC (500 x g per 3 min). Dopo il lavaggio finale, riasssferire in 200 L di GHIACCIO-freddo 2% FBS in PBS e analizzare immediatamente per citometria di flusso.
      NOTA: Le pubblicazioni precedenti hanno utilizzato la fissazione cellulare in paraformaldeide del 2% prima della citometria di flusso31, ma i risultati qui presentati sono stati acquisiti subito dopo il completamento del saggio. Non è consigliabile posticipare l'acquisizione dei dati is not di citometria del flusso memorizzando la piastra a 4 gradi centigradi, poiché la percentuale di celluleEtBr e THP-1 decade rapidamente (Figura S3).
  4. Acquisizione e analisi della citometria di flusso
    NOTA: è possibile utilizzare qualsiasi citometro di flusso che supporta il formato della piastra di 96 ben e che abbia i laser/filtri appropriati per misurare la fluorescenza EtBr.
    1. Per l'acquisizione, gate su celle THP-1 utilizzando un grafico lineare forward-scatter (FSC) vs side-scatter lineare (SSC) utilizzando i pozzi non sono stati aggiunti IE (Figura 2A) e acquisire 10.000 eventi su questo cancello.
    2. Misurare l'intensità della fluorescenza per EtBr (FL3-Log) sul cancello THP-1 utilizzando un grafico istogramma.
    3. Per il gating, è stato aggiunto il primo gate sulle celle THP-1 in un grafico di densità FSC e SSC, utilizzando i pozzi non sono stati aggiunti IE (Figura 2A). Impostare quindi un gate positivo in un istogramma FL3 (EtBr), utilizzando le celle THP-1 (nessun IEs aggiunto) e il controllo non opsonizzato (Figura 2B).
    4. Copiare questi cancelli in tutti gli altri campioni testati nella stessa piastra e determinare la percentuale di cellule THP-1 etbr-positive (cellule THP-1 che hanno phagocitizzato almeno un IE). Per ciascuno dei campioni testati, la fagocitosi può essere segnalata come valori assoluti (percentuale di celluleEtBr e THP-1) o come relativa fagocitosi calcolata come percentuale utilizzando il controllo positivo come massimo.

Risultati

Qui presentiamo in dettaglio un protocollo che è stato precedentementedescritto 31 eutilizzato 11,12,13,14,15,16,17,18 per misurare la capacità degli anticorpi mirati alla superficie di P. falciparum IEs per indurre l'oson...

Discussione

Il protocollo qui presentato è stato precedentemente descritto e utilizzato12,15,17,31 per misurare la capacità di anticorpi mirati alla superficie di P. falciparum IEs per indurre l'opsonizzazione e la faagocitosi da cellule THP-1. I risultati qui presentati si concentrano sugli anticorpi specifici var2CSA acquisiti naturalmente nel plasma/siero delle donne che vivono in una reg...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Maiken Visti è ringraziato per l'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato in parte finanziato da una sovvenzione (MAVARECA II; 17-02-KU) del Ministero degli Affari Esteri della Danimarca e amministrata dal Danida Fellowship Centre. Il finanziatore non ha avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well cell culture plates, round bottom with lidCorning3799Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-IIGibco11021-037
AlbuMAX-II (5%)--5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibodyAbcamab34858Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBSSigmaP8622
Dynabeads Protein GInvitrogen10003D
Ethidium bromide solutionSigmaE1510Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometerBeckman CoulterAny flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10099-141Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16BD Biosciences555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32BD Biosciences552883
FITC mouse anti-human CD64BD Biosciences555527
FlowLogic softwareInivai technologiesAny flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL)SigmaG1272
HypoxanthineSigmaH9377
L-glutamine (200mM)SigmaG7513
Lysing solution--15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesoriesMiltenyi Biotec130-041-305
Parasite culture medium--2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)SigmaP0781
RPMI-1640 mediumSigmaR5886
THP-1 culture medium--10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnetMiltenyi Biotec

Riferimenti

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