JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokolün genel amacı, plasmodium falciparum enfeksiyonuna doğal olarak maruz kalan bireylerin sera veya plazmasında bulunan antikorların kapasitesinin nasıl ölçüleceklerine, parazit enfekte eritrositlerin (IEs) fagositozunu opsonize etmek ve indüklemek tir.

Özet

Protokol, VAR2CSA'ya özgü doğal olarak edinilmiş IgG antikorları tarafından opsonize edilen Plasmodium falciparumenfekte eritrositlerin (IEs) akış sitometri tabanlı fagositoz testinin nasıl kurulup çalıştırılabildiğini açıklamaktadır. VAR2CSA, plasentadaki IE'lerin seçici sekansasyonuna aracılık eden ve plasental sıtma (PM) adı verilen hamile kadınlarda ciddi bir sıtma formuna neden olabilecek parazit antijenidir. PM'den korunma, plasental sekestrasyonu inhibe ederek ve/veya fagositoz için IE'leri opsonize ederek çalıştığına inanılan VAR2CSA spesifik antikorlar aracılık eder. Taht, VAR2CSA'yı ifade etmek için in vitro olarak seçilen geç evre senkronize IE'ler, doğal olarak edinilmiş PM spesifik bağışıklığı olan kadınlardan plazma/serum-antikorları ve fagositik hücre hattı THP-1'i kullanır. Ancak protokol, ister doğal maruzkalma ister aşılama ile indüklenen, IE yüzeyinde bulunan herhangi bir parazit antijenine antikorların işlevselliğini test etmek için kolayca değiştirilebilir. Titre, sıtmada antikor aracılı bağışıklığın önemli bir fonksiyonel yönünüiyi tekrarlanabilirlik ile basit ve yüksek iş letimatisi değerlendirme sunar. Bu nedenle, özellikle Sahra-altı Afrika'da, tropik bölgelerde morbidite ve mortalitenin önemli bir nedeni olan P. falciparum sıtmasına karşı klinik bağışıklığı değerlendirirken yararlıdır.

Giriş

Sıtma, Plasmodiumcinsinin beş farklı türüyle enfeksiyon anına bağlı olarak insanlarda meydana gelen vektör kaynaklı bir hastalıktır. En yaygın türler P. falciparum, aynı zamanda en morbidite ve mortalite sorumludur1. Sıtma klinik sunumu asemptomatik veya benign enfeksiyonlardan komplike/ağır hastalıklara kadar değişmekteolup, ikincisi çoğunlukla beş yaşın altındaki çocuklarda görülür. P. falciparum maruz steril bağışıklık neden olmaz, ancak endemik bölgelerde yaşayan bireyler yavaş yavaş klinik hastalığa karşı bağışıklık geliştirmek. Koruma yaşa/maruziyete bağlıdır ve bağışıklık normalde yaşamın ilk 5-10 döneminde elde edilir2. Plasental sıtma (PM) olarak bilinen klinik bir sunumda gebelik sırasında şiddetli sıtma meydana gelebileceğinden yetişkin kadınlar önemli bir istisnadır. PM kürtaj, ölü doğum, erken doğum, düşük doğum ağırlığı, fetal ölüm ve maternal anemi önemli bir nedenidir. PM direnci art arda gebelikler üzerinde gelişir3. PM'den korunma, plasentada IE sekestrasyonu sağlayan4,5kondroitin sülfat A 'ya (CSA) bağlanan enfekte eritrosit (IE) yüzey antijenine karşı antikor ların elde edilmesiyle ilişkilidir. Antikorlar çeşitli fonksiyonel faaliyetler gerçekleştiren koruma aracılık(6,,7)Fagositagozis indüklemek için IEs opsonizasyonu da dahil olmak üzere. Erken in vitro çalışmalar antikorların fagositozyoluylamonosit varlığında P. falciparum büyümesini sınırlayabilir gösterdi 8,9. Daha yeni çalışmalar fagositoz indükleyen antikorların daha yüksek düzeyde daha iyi gebelik sonuçları ile ilişkili olduğunu göstermiştir (HIV co-enfeksiyon bağlamında)10,11, doğal olarak elde edilen bağışıklık yanıtı bu efektör fonksiyonun alaka gösteren.

Burada insan plazmasında/serumunda bulunan antikorların bu işlevini ölçmek için, VAR2CSA'yı teksit hattı THP-1 ile birlikte in vitro kültürlü IE'ler kullanarak bir protokol saklıyız. Titredaha önce kullanılmıştır11,12,13,14,15,16,17,,18 ve daha önceki mikroskop tabanlı protokollere göre geliştirilmiş ve daha kolay bir yaklaşım olarak kabul edilir8, antikor daha küçük hacimlerde kullanarak tek bir çalışmaantikor örneklerinin daha büyük sayıda test sağlar ve sıkıcı ve önyargılı mikroskop sayma kaçınarak beri. Tayın birden fazla laboratuvar tarafından kullanılmasına ve yürütülmesi yeterince basit olmasına rağmen, dikkatli bir planlama ve hazırlık gerektirir, bu nedenle ayrıntılı bir protokol laboratuvarlar ve araştırmacılar tarafından daha önce deneyimi olmayan uygulamalara izin verir. Örnek olarak, doğal olarak elde edilen PM'ye özgü bağışıklığı olan kadınlardan toplanan serumda bulunan antikorlarla opsonize edilmiş VAR2CSA'yı ifade eden geç evre senkronize edilmiş IE'leri kullanıyoruz. Ancak protokol, ister doğal maruzkalma ister aşılama ile indüklenen, IE yüzeyinde bulunan herhangi bir parazit antijenine antikorların işlevselliğini test etmek için kolayca değiştirilebilir.

Protokol

Burada sunulan sonuçlar için kullanılan insan serumu örnekleri ayrı bir çalışmada toplanmıştır19. Koleksiyon, Gana Üniversitesi Noguchi Memorial Institute for Medical Research Kurumsal İnceleme Kurulu (çalışma 038/10-11) ve Danimarka'nın Başkenti Bölgesel Araştırma Etik Komiteleri (H-4-2013-083 protokolü) tarafından onaylanmıştır.

1. Parazit kültürü

NOT: İnsan patojenlerinin kullanımı yla ilgili yerel yönetmeliklere uyun.

  1. P. falciparum parazitlerini20'den önce açıklanan standart protokole göre parazit kültür ortamında muhafaza edin (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Parazitleri daha önce açıklandığı gibi sorbitol tedavisi ile sıkıca senkronize tutun21.
  3. IE yüzeyinde VAR2CSA ifade sağlamak için, bir anti-VAR2CSA antikor kullanarak bağışıklık-manyetik seçim tekrarlanan tur gerçekleştirmek (örneğin, PAM1.4 antikor, çapraz reaktif insan monoklonal VAR2CSA özgü IgG22) protein G-manyetik boncuklar23birleştiğinde .
    1. Kısacası, bir anti-VAR2CSA antikor ile birleştiğinde manyetik boncukile son dönem trophozoit-IEs inkübat ve olumlu bir mıknatıs kullanarak seçin.
    2. Parazitmi en az%5 olana kadar kültürde seçilen parazitleri birkaç döngü boyunca genişletin.
    3. Alternatif olarak, daha önce açıklandığı gibi plastik immobilize CSA (VAR2CSA reseptörü) bağlamak parazitler seçin24.
  4. Seçili parazitler üzerinde VAR2CSA ifadesini doğrulamak için daha önce açıklandığı gibi akış sitometrisi gerçekleştirmek25.
    1. Kısacası, manyetik seçim için kullanılan aynı antikor ile geç aşama trophozoit-IEs etiket (adım 1.3) bir floresan ikincil antikor etiketli izledi.
    2. Akış sitometrisi ile IE yüzey reaktivitesini ölçün. Başarılı antikor seçimi normalde parazitlerin çoğunda VAR2CSA'yı ifade eden bir parazit popülasyonuyla sonuçlanır (%≈ %80).
  5. Fagositoz teşrifi için, saflaştırılmış orta-geç evre trophozoit-IE kullanın. Daha önce açıklandığı gibi manyetik ayırma kullanarak arıtma gerçekleştirin26.
    NOT: Parazitlerin evresini doğru bir şekilde belirlemek için, ışık mikroskobu gözlemini takip eden kan yaymalarında Giemsa boyama yapın. 27'denönce açıklandığı gibi standart prosedürleri ve morfolojik yönergeleri izleyin. Son aşama arıtma da yoğunluk gradyan orta kullanılarak yapılabilir. IE verim, ancak, bizim deneyim olarak daha düşüktür ve bu nedenle, manyetik arıtma tercih edilir.
    1. Manyetik ayırma için parazit kültürünü (5-10% parazitmi) oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 x g'da döndürün. Süpernatant çıkarın ve parazit kültür orta 10 mL hücre pelet yeniden askıya.
    2. Parazit süspansiyonuna bir mıknatısla birleşen CS sütununa ekleyin (Bkz. Malzeme Tablosu)ve yavaşça sütundan geçmesine izin verin. Trophozoit-IEs paramanyetik (hemozoin varlığı nedeniyle) ve sütun örgü içine kalacaktır.
    3. 50 mL parazit kültür ortamı kullanarak kolonu 50 mL parazit kültür ortamı ile yıkayın ve MANYETIK KOLONDAN IE'leri uzaklaştırın.
  6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 500 x g'de 1,5,3'ten eluate'yi döndürün. Dikkatle supernatant atın ve parazit kültür ortamı1 mL yeniden askıya.
  7. Bir hemositometre kullanarak, son parazitmi (IEs yüzdesi) hesaplamak için, IEs sayısını (ışık mikroskobu ile kolayca koyu hemozoin pigmenti ile eritrositler olarak tanımlanır) ve toplam hücre numarası saymak.
    NOT: Sadece en az % 80 saflıkta (%80 IEs) parazit kullanın.
  8. Test için planlanan serum/antikor örneklerinin sayısına göre, ihtiyaç duyulan toplam SAY'ı tahmin edin ve parazit kültürlerini buna göre ölçeklendirin. %5 hematokrit ve %5-10 paraziti ile 25 mL kültüre sahip 75 cm2 kültür şişesi, tam 96 kuyu plakasını çalıştıracak kadar IE sağlamalıdır. Tam plaka (42 numune artı 6 kontrol) için en az 3,3 x 107 IEs/mL'de en az 1,5 mL parazit süspansiyonu gereklidir.

2. THP-1 hücreleri

NOT: Bu tsözde THP-1 hücre hattı kullanılır. Bu monosit hücre hattı monositik lösemi28 olan bir hastadan türetilmiştir ve ATCC'den satın alınabilir. HÜCRE satırını THP-1 kültür ortamındaki sağlayıcının talimatlarına göre koruyun (bkz. Malzemeler Tablosu).

  1. Düzenli bakım için, hücre konsantrasyonu 8 x 105 hücre/mL'ye ulaştığında THP-1 hücre kültürünü 2-4 x 105 hücre/mL ve alt kültürolarak başlatın.
    NOT: Hücre konsantrasyonunun 1 x 106 hücre/mL'yi aşmesine izin vermeyin ve geçiş sayısını takip edin. 25. geçidin ötesindeki hücrelerin kullanımından kaçının. THP-1 hücre hattının ortalama iki katına çıkarma süresi 19-50 saat arasında değişmektedir. Fagositöz deneylere başlamadan önce hücre toplu iki katına zaman belirleyin. Bu, test edilecek kararlı sayıda serum numunesi için gerekli kültür miktarını kabaca tahmin etmeye yardımcı olacaktır (örn. tam 96 kuyu plakası için, 5 x 105 hücre/mL'de 10 mL kültür gereklidir).
  2. Daha önce15olarak açıklandığı gibi Fcγ-reseptörleri I (CD64), II (CD32) ve III (CD16) yüzey ekspresyonu için THP-1 hücrelerini periyodik olarak kontrol edin.
    1. Kısacası, thp-1 hücrelerini (ayrı ayrı) anti-CD64, anti-CD32 ve anti-CD16 floresan olarak etiketlenmiş antikorlar(Malzeme Tablosu)ile 30 dakika oda sıcaklığında (PBS'de %2 FBS'de hazırlanan 1:100 seyreltme) lekelayın.
    2. PBS'de %2 FBS ile üç kez yıkayın ve akış sitometrisi ile yüzey boyamasını ölçün.
      NOT: THP-1 hücreleri CD16 için negatif, CD32 ve CD64 için daha önce bildirilen29,30 (Şekil 1)pozitiftir.
  3. Fagositoz analizi için, denemeden bir gün önce 2,5 x 105 hücre/mL içeren bir THP-1 hücre kültürü şişesi kurarak deneme gününde 5 x 105 hücre/mL civarında verim elde edin.
    NOT: 4-6 x 105 hücre/mL'nin titrek gününde bulunduğundan emin olun.

3. Fagositositöz isme (Şekil S1)

  1. Teşbeye başlamadan önce, PBS'de steril %2 FBS kuyubaşına 150 μL kullanarak iki yuvarlak alt 96 kuyu plakasını (biri optimizasyon için, diğeri fagositoz için) bloke edin.
    NOT: Etiket plaka sıcanda opsonizasyon plakası olarak ve ethidium bromür (EtBr) boyama ve opsonizasyon için hem kullanın. Etiket plakası 2 fagositoz plakası olarak ve hem THP-1 hücre kaplaması hem de fagositoz adımı için kullanın.
  2. Parazit boyama ve opsonizasyon
    1. 1.6'da hazırlanan IE süspansiyonu alın ve parazit kültür ortamı nı ve EtBr'yi ekleyerek hücre sayısını 3,3 x 107 IEs/mL'ye ayarlayın ve 0,1 mg/mL'lik bir stoktan 2,5 g/mL (1:40 seyreltme) nihai konsantrasyonu elde edin.
      NOT: EtBr parazit DNA'sını lekeler, akış sitometrisi ile tespit edilmesine izin verir.
      DİkKAT: EtBr bir mutajen ve deri, göz ve solunum tahriş edici. Uygun korumayı kullanın ve atıkları yerel yönetmeliklere göre bertaraf edin.
    2. 96 kuyu plakasından (opsonizasyon plakası) birinden blokaj çözeltisini çıkarın, plakayı hareket ettirin ve bir havlu kağıdı nın üzerindeki sıvı fazlalığı kaldırın.
    3. Yukarıda hazırlanan plakanın üst yarısında hazırlanan IE süspansiyonun kuyubaşına 30°L'lik kısmını ekleyin. Bir iyi boş bırakın ve parazit kültür ortamı 30 μL ekleyin (THP-1 tek başına kontrol için IEs olmadan). (Şekil S2A). Oda sıcaklığında 10 dakika kuluçka ve ışıktan korunmaktadır.
    4. Parazit kültür ortamının kuyu başına 170 μL ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında 3 dk boyunca 500 x g'de döndürün ve plakayı uygun bir atık kabının üzerine vurarak süpernatantı çıkarın.
    5. EtBr etiketli IE'leri, oda sıcaklığında 3 dk boyunca 500 x g'da dönen parazit kültür ortamının kuyubaşına 200 μL'lik bir kısmını kullanarak iki kez daha yıkayın. İlk yıkamadan gelen supernatant plaka sıcarak çıkarılabilir. Yıkama ortamının tüm hacminin çıkarıldığından emin olmak için çok kanallı pipet kullanarak süpernatantı ikinci yıkamadan dikkatlice çıkarın. Peleti rahatsız etmeyin.
    6. Parazit kültür ortamında istenilen konsantrasyonlarda hazırlanan 30 μL antikor/plazma/serum çözeltisinde EtBr etiketli IE'leri yeniden askıya alın.
    7. Her zaman aşağıdaki kontrolleri içerir(Şekil S2B):IEs/THP-1 hücre kontrolü olmayan bir kontrol (parazit kültür ortamı); herhangi bir antikor veya plazma/serum (opsonize olmayan kontrol) olmadan bir kontrol; 1:100 seyreltme de ticari olarak kullanılabilir tavşan anti-insan eritrosit antikor kullanarak olumlu bir kontrol (Malzemeler Tablosubakınız); 1:5 seyreltme de iki negatif plazma / serum kontrolleri (sıtma-naif havuz ve sıtma yalıtkan erkeklerden bir havuz); ve 1:5 seyreltme de pozitif bir serum kontrolü (sıtmaya maruz kalan kadınlardan bir havuz, daha önce hamile olan (tercihen multigravidae)).
      NOT: Pozitif kontrol için 1:100 seyreltme satın alınan antikor farklı gruplar arasında tutarlı bir şekilde çalışmak gibi görünüyor (veriler gösterilmez). Ancak, her yeni bir antikor toplu kullanıldığında birkaç seyreltme test ederek toplu gruplar arasındaki varyasyonları ekarte etmek önerilir.
    8. 37 °C karanlıkta 45 dakika kuluçka.
  3. THP-1 hücre hazırlama ve fagositoksis
    1. IEs opsonized (3.2.8) iken, THP-1 hücreleri hazırlamaya başlar.
    2. THP-1 hücrelerini kültür şişesinden çıkarın, aşağı doğru döndürün (oda sıcaklığında 5 dk için 500 x g), süpernatant'ı çıkarın ve THP-1 hücre kültürü ortamındaki peleti yeniden askıya alın.
    3. Tekrar döndürün (oda sıcaklığında 5 dk için 500 x g), süpernatant'ı dekantlayın ve THP-1 hücre kültürü ortamının 1 mL'sinde hücre peletini yeniden askıya alın.
    4. Yukarıda hazırlanan çözeltideki hücre sayısını belirleyin ve 5 x 105 hücre/mL'lik son konsantrasyonu elde etmek için daha fazla ortam ekleyin.
    5. Plakayı hareket ettirerek ve bir havlu kağıdının üzerindeki sıvı fazlalığını çıkararak kalan 96 kuyu plakasından (fagositoz plakası) bloke solüsyonu çıkarın.
    6. 3.3.4'te hazırlanan THP-1 hücre süspansiyonunun kuyubaşına 100°L ekleyin ve hücre kültürü kuluçka makinesine geri koyun(Şekil S2C).
    7. Antikor/plazma/serum kuluçka süresi bittikten sonra parazit kültür ortamının kuyubaşına 170°L ekleyin. Tabağı oda sıcaklığında 3 dk boyunca 500 x g'de döndürün ve plakayı uygun bir atık kabının üzerine vurarak süpernatantı çıkarın.
    8. Opsonize IE'leri parazit kültür ortamının kuyusu başına 200 μL'lik bir kuyu kullanarak iki kez daha yıkayın ve tabağı oda sıcaklığında 3 dk boyunca 500 x g'da döndürün. İlk yıkamadan gelen supernatant plaka sıcarak çıkarılabilir. Yıkama ortamının tüm hacminin çıkarıldığından emin olmak için çok kanallı pipet kullanarak süpernatantı ikinci yıkamadan dikkatlice çıkarın. Peleti rahatsız etmeyin.
    9. Son olarak, önceden ısıtılmış THP-1 hücre kültürü ortamının 100 μL'lik opsonize iEs'ini yeniden askıya alın. Fagosittoz plakasındaki her kuyuya 50 μL opsonize IE süspansiyon aktarın. Toplam 100 μL'lik IE olduğundan, her antikor/serum seyreltme fagositositöz plakasında ki kopyalarda çalıştırılabilir (Şekil S2D)
      NOT: Teşbede kullanılan IE ve THP-1 hücrelerinin miktarı 10:1 oranına karşılık gelir.
    10. 37 °C, %5 CO2karanlıkta 40 dk kuluçka .
      NOT: Fagositizin 40 dakikadan fazla devam etmesine izin vermeyin.
    11. 4 °C 'de (500 x g, 5 dk) fagositoyu santrifüj ile durdurun ve plakayı hareket ettirerek süpernatantı atın. 150 μL oda sıcaklığında amonyum klorür lysing çözeltisi(Malzeme Tablosu)ekleyin ve tam 3 dakika boyunca tüple karıştırarak karıştırın.
      NOT: Bu adım THP-1 hücreleri tarafından fagositoz edilmemiş eritrositleri ayrıştıracaktır.
    12. PBS'ye 100 μL buz gibi %2 FBS ekleyerek lysis'i durdurun. Plakayı 4 °C'de (3 dk için 500 x g) döndürün ve plakayı uygun bir atık kabının üzerine vurarak süpernatantı çıkarın.
    13. PBS'de 4°C'de (3 dk için 500 x g) dönen PBS'de buz gibi %2 FBS kuyusu başına 200 μL'lik bir kuyu kullanarak üç kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, PBS'de 200 μL buz gibi %2 FBS'de yeniden askıya alın ve akış sitometrisi ile hemen analiz edin.
      NOT: Önceki yayınlarda akış sitometrisi31'denönce %2 paraformaldehitte hücre fiksasyonu kullanılmıştır, ancak burada sunulan sonuçlar tahkikat tamamlandıktan hemen sonra elde edilmiştir. EtBr+ THP-1 hücrelerinin yüzdesi hızla çürüyündiye(Şekil S3)4°C'de plakayı depolayarak akış sitometri veri sitometrisinin aktarılması önerilmez.
  4. Akış sitometri alımı ve analizi
    NOT: 96 iyi plaka biçimini destekleyen ve EtBr floresansını ölçmek için uygun lazerlere/filtrelere sahip herhangi bir akış sitometresi kullanılabilir.
    1. Satın alma için, thp-1 hücrelerinde doğrusal ileri dağılım (FSC) ve doğrusal yan dağılım (SSC) çizimini kullanarak kuyuları kullanan kapı,(Şekil 2A)eklenmedi ve bu kapıda 10.000 olay elde edildi.
    2. ThP-1 kapısında bir histogram çizimi kullanarak EtBr (FL3-Log) için floresan şiddetini ölçün.
    3. Gating için, bir FSC vs SSC yoğunluk arsa THP-1 hücrelerinin ilk kapı, kuyular kullanılarak hiçbir IEs eklendi(Şekil 2A). Daha sonra THP-1 hücreleri (hiçbir IEs eklendi) ve un-opsonized kontrol(Şekil 2B)kullanarak, bir FL3 (EtBr) histogram pozitif bir kapı kurmak.
    4. Bu kapıları aynı plaka içinde test edilen diğer örneklerde kopyalayın ve EtBr-pozitif THP-1 hücrelerinin (en az bir IE fagositize edilmiş THP-1 hücreleri) yüzdesini belirleyin. Test edilen örneklerin her biri için fagositoz mutlak değerler (EtBr+ THP-1 hücrelerinin yüzdesi) veya pozitif kontrolü maksimum olarak kullanarak yüzde olarak hesaplanan göreli fagositoz olarak rapor edilebilir.

Sonuçlar

Burada ayrıntılı olarak31 tarif edilmiş ve kullanılan bir protokol sunmak11,12,13,14,15,16,17,18 THP-1 hücreleri tarafından opsonizasyon ve fagosityolis indüklemek için P. falciparum IEs yüzeyini hedefleyen antikor...

Tartışmalar

Burada sunulan protokol daha önce tanımlanmış ve thp-1 hücreleri tarafından opsonizasyon ve fagositoz indüklemek için P. falciparum IEs yüzeyini hedefleyen antikorların kapasitesini ölçmek için12,15,17,31 kullanılmıştır. Burada sunulan sonuçlar, P. falciparum endemik bölgede yaşayan kadınların plazma/serumunda doğal olarak edinilmiş VAR2CSA spesifik ant...

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Maiken Visti mükemmel teknik yardım için teşekkür edilir. Bu çalışma kısmen Danimarka Dışişleri Bakanlığı'ndan bir hibe (MAVARECA II; 17-02-KU) tarafından finanse edilmiş ve Danida Burs Merkezi tarafından yönetilmiştir. Funder çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, yayımlama kararı, ya da el yazması hazırlanmasında hiçbir rolü vardı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well cell culture plates, round bottom with lidCorning3799Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-IIGibco11021-037
AlbuMAX-II (5%)--5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibodyAbcamab34858Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBSSigmaP8622
Dynabeads Protein GInvitrogen10003D
Ethidium bromide solutionSigmaE1510Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometerBeckman CoulterAny flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10099-141Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16BD Biosciences555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32BD Biosciences552883
FITC mouse anti-human CD64BD Biosciences555527
FlowLogic softwareInivai technologiesAny flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL)SigmaG1272
HypoxanthineSigmaH9377
L-glutamine (200mM)SigmaG7513
Lysing solution--15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesoriesMiltenyi Biotec130-041-305
Parasite culture medium--2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)SigmaP0781
RPMI-1640 mediumSigmaR5886
THP-1 culture medium--10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnetMiltenyi Biotec

Referanslar

  1. World Health Organization. World Malaria Report - 2018. World Health Organization. , (2018).
  2. Pierce, S. K., Miller, L. H. World Malaria Day 2009: What malaria knows about the immune system that immunologists still do not. Journal of Immunology. 182 (9), 5171-5177 (2009).
  3. Gamain, B., Smith, J. D., Viebig, N. K., Gysin, J., Scherf, A. Pregnancy-associated malaria: Parasite binding, natural immunity and vaccine development. International Journal for Parasitology. 37 (3-4), 273-283 (2007).
  4. Staalsoe, T., et al. Variant surface antigen-specific IgG and protection against clinical consequences of pregnancy-associated Plasmodium falciparum malaria. Lancet. 363 (9405), 283-289 (2004).
  5. Feng, G., et al. Antibodies to variant surface antigens of plasmodium falciparum -Infected erythrocytes are associated with protection from treatment failure and the development of anemia in pregnancy. The Journal of Infectious Diseases. 200 (2), 299-306 (2009).
  6. Teo, A., Feng, G., Brown, G. V., Beeson, J. G., Rogerson, S. J. Functional Antibodies and Protection against Blood-stage Malaria. Trends in Parasitology. 32 (11), 1-12 (2016).
  7. Aitken, E. H., Mahanty, S., Rogerson, S. J. Antibody effector functions in malaria and other parasitic diseases: a few needles and many haystacks. Immunology & Cell Biology. 98 (4), 264-275 (2020).
  8. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Opsonic activity of human immune serum on in vitro phagocytosis of Plasmodium falciparum infected red blood cells by monocytes. Clinical and Experimental Immunology. 47 (3), 635-644 (1982).
  9. Celada, A., Cruchaud, A., Perrin, L. H. Phagocytosis of Plasmodium falciparum-Parasitized Erythrocytes by Human Polymorphonuclear Leukocytes. The Journal of Parasitology. 69 (1), 49-53 (1983).
  10. Jaworowski, A., et al. Relationship between human immunodeficiency virus type 1 coinfection, anemia, and levels and function of antibodies to variant surface antigens in pregnancy-associated malaria. Clinical and Vaccine Immunology. 16 (3), 312-319 (2009).
  11. Ataíde, R., Mwapasa, V., Molyneux, M. E., Meshnick, S. R., Rogerson, S. J. Antibodies that induce phagocytosis of malaria infected erythrocytes: Effect of HIV infection and correlation with clinical outcomes. PLoS One. 6 (7), 22491 (2011).
  12. Ghumra, A., et al. Immunisation with recombinant PfEMP1 domains elicits functional rosette-inhibiting and phagocytosis-inducing antibodies to Plasmodium falciparum. PloS One. 6 (1), 0016414 (2011).
  13. Ghumra, A., et al. Induction of strain-transcending antibodies against Group A PfEMP1 surface antigens from virulent malaria parasites. PLoS Pathogens. 8 (4), 1002665 (2012).
  14. Chan, J. A., et al. Targets of antibodies against erythrocytes in malaria immunity. J Clin Invest. 122 (9), 3227-3238 (2012).
  15. Quintana, M. P., Angeletti, D., Moll, K., Chen, Q., Wahlgren, M. Phagocytosis inducing antibodies to Plasmodium falciparum upon immunization with a recombinant PfEMP1 NTS DBL1α domain. Malaria Journal. 1, 1-9 (2016).
  16. Chan, J. A., et al. A single point in protein trafficking by Plasmodium falciparum determines the expression of major antigens on the surface of infected erythrocytes targeted by human antibodies. Cellular and Molecular Life Sciences. 73, 4141-4158 (2016).
  17. Quintana, M. P., et al. Antibodies in children with malaria to PfEMP1, RIFIN and SURFIN expressed at the Plasmodium falciparum parasitized red blood cell surface. Scientific Reports. 8 (1), 3262 (2018).
  18. Hommel, M., et al. Evaluating antibody functional activity and strain-specificity of vaccine candidates for malaria in pregnancy using in vitro phagocytosis assays. Parasites & Vectors. 11 (69), 1-7 (2018).
  19. Ampomah, P., Stevenson, L., Ofori, M. F., Barfod, L., Hviid, L. B-cell responses to pregnancy-restricted and -unrestricted Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 antigens in Ghanaian women naturally exposed to malaria parasites. Infection and Immunity. 82 (5), 1860-1871 (2014).
  20. Cranmer, S. L., Magowan, C., Liang, J., Coppel, R. L., Cooke, B. M. An alternative to serum for cultivation of Plasmodium falciparum in vitro. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 91 (3), 363-365 (1997).
  21. Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. Journal of Parasitology. 65 (3), 418-420 (1979).
  22. Barfod, L., et al. Human pregnancy-associated malaria-specific B cells target polymorphic, conformational epitopes in VAR2CSA. Molecular Microbiology. 63 (2), 335-347 (2007).
  23. Staalsoe, T., et al. In vitro selection of Plasmodium falciparum 3D7 for expression of variant surface antigens associated with severe malaria in African children. Parasite Immunology. 25 (8-9), 421-427 (2003).
  24. Chan, S., et al. Regulation of PfEMP1-VAR2CSA translation by a Plasmodium translation-enhancing factor. Nature Microbiology. 2, 17068 (2017).
  25. Barfod, L., et al. Evasion of immunity to Plasmodium falciparum malaria by IgM masking of protective IgG epitopes in infected erythrocyte surface-exposed PfEMP1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (30), 12485-12490 (2011).
  26. Moll, K., Kaneko, A., Scherf, A., Wahlgren, M. . Methods in Malaria Research. , (2013).
  27. WHO. Basic malaria microscopy. Part I. Learner's Guide. World Health Organization. , (1991).
  28. Tsuchiya, S. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). International Journal of Cancer. Journal International Du Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  29. Fleit, H. B., Kobasiuk, C. D. The human monocyte-like cell line THP-1 expresses FcyRl and Fc'yRIl. Journal of Leukocyte Biology. 49, 556-565 (1991).
  30. Auwerx, J., Staels, B., Van Vaeck, F., Ceuppens, J. L. Changes in IgG Fc receptor expression induced by phorbol 12-myristate 13-acetate treatment of THP-1 monocytic leukemia cells. Leukemia research. 16 (3), 317-327 (1992).
  31. Ataíde, R., et al. Using an improved phagocytosis assay to evaluate the effect of HIV on specific antibodies to pregnancy-associated malaria. PloS One. 5 (5), 10807 (2010).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

mm noloji ve EnfeksiyonSay 162fagositozopsonizasyonantikorlarplasental s tmaparazit enfekte eritrositlerIEsVAR2CSA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır