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要約

このプロトコルの全体的な目標は、自然に 熱帯熱マラリア原虫 感染にさらされた個人のセラまたは血漿中に存在する抗体の容量を測定する方法についての指示を提供し、寄生虫感染赤血球(IE)の貪食を誘導する。

要約

プロトコルは、VAR2CSAに特異的な自然に取得したIgG抗体によってオソニンを生成した熱帯熱マラリア 原虫(IE)のフローサイトメトリーベースの食作用アッセイを設定して実行する方法を説明しています。VAR2CSAは、胎盤マラリア(PM)と呼ばれる妊婦に重篤な形態のマラリアを引き起こす可能性のある胎盤中のIEの選択的隔離を媒介する寄生虫抗原である。PMからの保護は、胎盤隔離を阻害することによって機能すると考えられているVAR2CSA特異的抗体および/または食細胞性のためのIEを助長することによって媒介される。このアッセイは、VAR2CSA、自然に獲得したPM特異的免疫を有する女性からの血漿/血清抗体、および食作用細胞株THP-1を発現するために インビトロで 選択された後期同期IEを採用している。しかし、プロトコルは、IE表面に存在する任意の寄生虫抗原に対する抗体の機能性を、自然暴露によって誘導されるか、またはワクチン接種によって誘発されるか否かを容易にアッセイするように修飾することができる。このアッセイは、マラリアにおける抗体媒介性免疫の重要な機能的側面を再現性の高い、シンプルで高スループットの評価を提供します。したがって、熱帯地方、特にサハラ以南のアフリカにおける罹患率と死亡率の主な原因である P.熱帯熱マラリア に対する臨床免疫を評価する際に有用である。

概要

マラリアは、5種類のマラリア原虫属に感染したヒトに引き起こされるベクター媒介性疾患である。最も一般的な種はP.熱帯熱化であり、最も罹患率と死亡率も1に及んでいます。マラリアの臨床プレゼンテーションは、無症候性または良性感染症から複雑/重度の疾患までさまざまであり、後者は主に5歳未満の小児で発生する。P.熱帯熱化は、無菌免疫を誘発しませんが、固有の地域に住む個人は、臨床疾患に対する免疫をゆっくりと発症します。保護は年齢/暴露依存であり、免疫は通常、人生の最初の5〜10年の間に取得される2.成人女性は、胎盤マラリア(PM)として知られている臨床プレゼンテーションで妊娠中に重度のマラリアが発生する可能性がありますので、重要な例外です。PMは、中絶、死産、早産、低出生体重、胎児死亡、および母性貧血の重要な原因である。PMに対する耐性は、連続妊娠3を超えて発達する。PMからの保護は、VAR2CSA型PfEMP144,55に対する抗体の取得に関連しており、コンドロイチン硫酸A(CSA)に結合する感染性赤血球(IE)表面抗原であり、胎盤内でのIE隔離を可能にする。抗体は、様々な機能活性を行う抗体媒介性保護(6,7),7に、食作用を誘導するIEのオプゾン化を含む。初期のin vitro研究は、抗体が貪食症88、99を介して単球の存在下でP.熱帯熱岩の成長を制限できることを示した。最近の研究では、より高いレベルの貪食誘導抗体が、より良い妊娠結果(HIV共感染の文脈において)10,11に関連していることを示しており10、11自然に獲得した免疫応答におけるこのエフェクター機能の関連性を示している。

ここでは、VAR2CSAを発現するin vitro培養IEを単球線THP-1と共に用いて、ヒト血漿/血清中に存在する抗体のこの機能を測定するプロトコルを提示する。アッ8セイは以前に11、12、13、14、15、16、17、18を使用しており、より少量の抗体を使用して1回の実行でより多くの抗体サンプルをテストし、退屈で偏った顕微鏡検数を避けるため、以前の顕微鏡ベースのプロトコル8と比較して改善され、より簡単なアプローチと考えられています。11,12,13,14,15,16,17,18アッセイは複数の研究所で使用されており、その実行は十分に簡単ですが、慎重な計画と準備が必要であるため、詳細なプロトコルは、以前の経験を欠いている研究所や研究者による適用を可能にします。我々は、一例として、自然に獲得したPM特異的免疫を有する女性から採取された血清中に存在する抗体を用いてVAR2CSA opson化された後期同期IEを使用する。しかし、プロトコルは、IE表面に存在する任意の寄生虫抗原に対する抗体の機能性を、自然暴露によって誘導されるか、またはワクチン接種によって誘発されるか否かを容易にアッセイするように修飾することができる。

プロトコル

ここで提示した結果に用いたヒト血清サンプルを別の研究19で収集した。コレクションは、ガーナ大学野口記念医学研究所の機関審査委員会(研究038/10-11)、デンマーク首都地域地域地域研究倫理委員会(プロトコルH-4-2013-083)によって承認されました。

1. 寄生虫文化

注:ヒト病原体取扱については、現地の規制に従ってください。

  1. P. 熱帯熱虫 寄生虫を、寄生虫培地で20 以前に説明した標準プロトコルに従って維持する( 資料表を参照)。
  2. 前述の21のようにソルビトール処理を使用して寄生虫をしっかりと同期させておく。
  3. IEの表面にVAR2CSA発現を確実にするため、抗VAR2CSA抗体(例えば、PAM1.4抗体、クロス反応性ヒトモノクローナルVAR2CSA特異的IgG22)をタンパク質G-磁気ビーズ23に結合して免疫磁気選択を繰り返し行う。
    1. 簡単に言えば、磁気ビーズを抗VAR2CSA抗体に結合して後期の栄養物-IEをインキュベートし、磁石を使用して積極的に選択します。
    2. 選択した寄生虫を、寄生虫が5%以上になるまで数サイクル培養して展開する。
    3. あるいは、前述の24のように、プラスチック固定化CSA(VAR2CSAの受容体)に結合する寄生虫を選択する。
  4. 選択した寄生虫に対するVAR2CSA発現を確認するために、前述の25と同様にフローサイトメトリーを行う。
    1. 簡単に言えば、磁気選択に使用したのと同じ抗体(ステップ1.3)に続いて、蛍光標識された二次抗体を使用して後期トロッホゾアイト-IEを標識します。
    2. フローサイトメトリーによりIE表面反応性を測定します。正常な抗体選択は、通常、ほとんどの寄生虫(≈80%)でVAR2CSAを発現する寄生虫集団をもたらす。
  5. 食細胞性アッセイの場合は、精製中期から後期の栄養細胞-IEを使用してください。先に説明した磁気分離を用いて精製を行う26.
    注:寄生虫の段階を正確に決定するには、血液スミアにギームサ染色を行い、その後に軽い顕微鏡観察を行います。27の前に説明した標準的な手順と形態学的ガイドラインに従ってください。後期精製は、密度勾配媒体を用いて行うこともできます。しかし、IEの収率は低く、したがって、磁気浄化が好ましい。
    1. 磁気分離のために、寄生虫培養物(5-10%パラジテミア)を室温で10分間500 x g で回します。上清を取り除き、10mLの寄生虫培養培地で細胞ペレットを再懸濁させた。
    2. 寄生虫懸濁液を磁石に結合したCS列に追加し( 材料表を参照)、ゆっくりとカラムを通過させます。トロフォゾイトIEは(ヘモゾインの存在による)常磁性であり、カラムメッシュにとどまります。
    3. 50 mLの寄生虫培養培地でカラムを洗浄し、50 mLの寄生虫培養培地を用いて磁柱からIEを溶出します。
  6. 500 x g で 1.5.3 から溶出液を室温で 10 分間回転させます。上清を慎重に捨て、1mLの寄生虫培養培地で再中断する。
  7. 血球計を使用して、IEの数(暗い血ゾイン顔料を有する赤血球として光顕微鏡で容易に識別する)と最終的な寄生虫血症(IEの割合)を計算するために総細胞数を数える。
    注: 少なくとも 80% 純度 (80% の IE) を持つ寄生虫のみを使用してください。
  8. 検査のために計画された血清/抗体サンプルの数に基づいて、必要なIEの総量を推定し、それに応じて寄生虫培養物をスケールアップします。5%ヘマトクリットと5-10%の寄生虫血症で培養25 mLを持つ75cm2 培養フラスコは、完全な96ウェルプレートを実行するのに十分なIEを得る必要があります。フルプレート(42サンプルと重複する6コントロール)の場合、3.3 x 107 IE/mLで最低1.5 mLの寄生虫懸濁液が必要です。

2. THP-1細胞

注:THP-1細胞株はこのアッセイで使用されます。この単球細胞株は、単球性白血病28 を有する患者由来であり、ATCCから購入することができる。THP-1 培地のプロバイダの指示に従ってセルラインを維持します ( 資料表を参照)。

  1. 定期的なメンテナンスのために、THP-1細胞培養を2-4 x 105 細胞/mLで開始し、細胞濃度が8 x 105 細胞/mLに達するとサブカルチャーを開始します。
    注意:細胞濃度が1 x 106 セル/mLを超えないようにし、通過数を追跡しないでください。通過25を超える細胞の使用を避ける。THP-1細胞株の平均倍倍時間は19-50時間の間で変化する。細胞バッチの倍加時間を食前の実験を開始する前に決定します。これは、テストされる血清サンプルの決定された数に必要な培養量を概算するのに役立ちます(例えば、フル96ウェルプレートの場合、5 x 105 細胞/mLで10mLの培養が必要です)。
  2. 前に述べたように、Fcγ受容体I(CD64)、II(CD32)およびIII(CD16)の表面発現についてTHP-1細胞を定期的にチェック15する。
    1. 簡単に言えば、THP-1細胞(別々)に抗CD64、抗CD32および抗CD16蛍光標識抗体(材料表)を室温で30分間染色する(PBSでは2%FBSで1:100希釈を調製)。
    2. PBSで2%FBSで3回洗浄し、フローサイトメトリーによる表面染色を測定します。
      注: THP-1 セルは、CD16 では負数で、CD32 および CD64 では正の値が29、,30 (図 1)に報告されています。
  3. 食細胞性アッセイの場合、実験の前日に2.5 x 105 細胞/mLのTHP-1細胞培養フラスコを設定し、アッセイの日に約5 x 105 細胞/mLを得る。
    注:4-6 x 105 細胞/mLがアッセイの日に存在することを確認してください。

3. 食細胞性アッセイ (図 S1)

  1. アッセイを開始する前に、ブロック(>1 h)2つのラウンドボトム96ウェルプレート(オプスオン化用と貪食用のプレート)をPBSの無菌2%FBSのウェルあたり150 μLを使用します。
    注:オプソナイゼーションプレートとしてプレート1をラベルし、エチジウムブロマイド(EtBr)染色とオプソナイゼーションの両方に使用してください。ラベルプレート2を食細胞化板として、THP-1細胞めっき及び食細胞化工程の両方に使用する。
  2. 寄生虫染色とオプゾン化
    1. 1.6で調製したIE懸濁液を取り、寄生虫培地とEtBrを添加して細胞数を3.3 x 10 7 IE/mLに調整し、2.5 μg/mL(0.1 mg/mLストックから1:40希釈)の最終濃度を達成します。7
      注:EtBrは寄生虫DNAを染色し、フローサイトメトリーによる検出を可能にします。
      注意:EtBrは、皮膚、眼、呼吸器刺激性の皮膚です。適切な保護を使用し、現地の規制に従って廃棄物を処分する。
    2. 96ウェルプレート(オプソン化プレート)の1つからブロッキング溶液を取り出し、プレートをフリックし、タオルペーパーの上に液体過剰を取り除きます。
    3. プレートの上半分に上で用意したIE懸濁液のウェルあたり30μLを加えます。1つの井戸を空にして、30 μLの寄生虫培養培地を追加します(THP-1単独制御のIEは不要)。(図 S2A)室温で10分間インキュベートし、光から保護します。
    4. 寄生虫培養培地のウェルあたり170μLを加えます。500 x g で室温で 3 分間プレートを回転させ、適切な廃棄物容器の上にプレートをフリックして上清を取り除きます。
    5. EtBr標識されたIEをさらに2回洗浄し、500 x g でプレートを室温で3分間回転させる寄生虫培養培地のウェル当たり200 μLを使用します。最初の洗浄からの上清は、プレートをフリックすることによって除去することができる。マルチチャンネルピペットを使用して2回目の洗浄から上清を慎重に取り出し、洗浄媒体の全容を確実に除去します。ペレットを邪魔しないでください。
    6. 寄生虫培養培地で所望の濃度で調製した抗体/血漿/血清溶液の30 μLでEtBr標識されたIEを再中断します。
    7. 常に次のコントロールを含める (図 S2B): IE/THP-1 細胞コントロールを含まないコントロール (寄生虫培地);抗体または血漿/血清を含まないコントロール(非オプソナイズコントロール);1:100希釈時に市販のウサギ抗ヒト赤血球抗体を使用した陽性対照( 材料表を参照)。1:5希釈時の2つの陰性血漿/血清制御(マラリアのナイーブプールとマラリアにさらされた男性からのプール);そして1:5希釈時の陽性血清制御(以前に妊娠していたマラリアにさらされた女性からのプール(好ましくはマルチグラビダエ))。
      注:陽性対照のための1:100希釈は、購入した抗体の異なるバッチ間で一貫して動作するようです(データは示されていません)。しかし、抗体の新しいバッチを使用するたびにいくつかの希釈をテストすることによって、バッチ間の変動を排除することが推奨されます。
    8. 暗闇の中で45分間、37°Cでインキュベートします。
  3. THP-1細胞の調製および貪食症
    1. IE が opon 化されている間 (3.2.8), THP-1 細胞の準備を開始します。.
    2. THP-1細胞を培養フラスコから取り出し、それらをスピンダウン(室温で5分間 500×g)、 上清をデカントし、THP-1細胞培養培地中のペレットを再懸濁する。
    3. 再びスピン(室温で5分間 500xg)、 上清をデカントし、THP-1細胞培養培地の1mLで細胞ペレットを再懸濁する。
    4. 上記で調製した溶液中の細胞数を決定し、培地を加えて5 x 105 細胞/mLの最終濃度を得る。
    5. 残りの96ウェルプレート(食細胞性プレート)からブロッキング液を取り出し、プレートをフリックし、タオルペーパーの上に液体過剰を取り除きます。
    6. 3.3.4で調製したTHP-1細胞懸濁液のウェルあたり100μLを加え、細胞培養インキュベーターに戻す(図S2C)。
    7. 抗体/血漿/血清インキュベーション時間が終了したら、寄生虫培養培地のウェルあたり170 μLを加えます。500 x g で室温で 3 分間プレートを回転させ、適切な廃棄物容器の上にプレートをフリックして上清を取り除きます。
    8. オプソナイズされたIEを、寄生虫培養培地のウェル当たり200 μLを使用してさらに2回洗浄し、プレートを室温で3分間500 x g で回転させます。最初の洗浄からの上清は、プレートをフリックすることによって除去することができる。上清を2回目の洗浄から慎重に取り出し、マルチチャンネルピペットを使用して洗浄媒体の全容を確実に除去する。ペレットを邪魔しないでください。
    9. 最後に、予め温めたTHP-1細胞培養培地の100μLでオプス化されたIEを再中断する。50 μL のオプソン化 IE 懸濁液を食細胞性プレートの各ウェルに移します。IEの合計100 μLがあるので、各抗体/血清希釈は、貪食プレート内の重複で実行することができます (図 S2D)
      注: アッセイで使用される IE および THP-1 細胞の量は、10:1 の比率に相当します。
    10. 暗闇の中で40分間インキュベートし、37°C、5%CO2.2
      注:食道細胞症が40分以上進行しないようにしてください。
    11. 4°C(500xg、5分)で遠心分離により食前細胞症x gを停止し、プレートをフリックして上清を捨てます。150 μLの室温塩化アンモニウム溶解液(材料表)を加え、ピペットで混ぜ合わせ、正確に3分間インキュベートします。
      注:このステップはTHP-1細胞によって貪食されていない赤血球をリセ化します。
    12. PBSに100 μLの氷冷2%FBSを加えて、溶出を止める。プレートを4°C(500 x g) で回転させ、適切な廃棄物容器の上にプレートをフリックして上清を取り除きます。
    13. 4°C(3分間500 x g) でプレートを回転させるPBSで、氷冷2%FBSのウェルあたり200 μLを使用して3回洗浄します。最終洗浄後、PBSで200 μLの氷冷2%FBSで再中断し、すぐにフローサイトメトリーで分析します。
      注:これまでの資料では、フローサイトメトリー31の前に2%パラホルムアルデヒドに細胞固定を使用していましたが、ここで提示された結果はアッセイ完了直後に取得されました。EtBr+ THP-1細胞の割合が急速に減衰するため、プレートを4°Cに保存して後流サイトメトリーデータを取得することは推奨されません(図S3)。
  4. フローサイトメトリーの取得と分析
    注:96ウェルプレートフォーマットをサポートし、EtBr蛍光を測定するための適切なレーザー/フィルタを備えたフローサイトメーターを使用できます。
    1. 取得のために、ウェルを使用した線形前方散乱(FSC)と線形側散乱(SSC)プロットを用いたTHP-1細胞上のゲートは、IEを追加しなかった(図2A)、このゲート上で10,000個のイベントを獲得した。
    2. ヒストグラムプロットを使用してTHP-1ゲートのEtBr(FL3-Log)の蛍光強度を測定します。
    3. ゲートについては、FSC対SSC密度プロットにおけるTHP-1細胞の第1ゲートを、ウェルを使用してもIEは添加されなかった(図2A)。次に、THP-1 セル (IE を追加しない) および非オプソニング コントロール (図 2B)を使用して、FL3 (EtBr) ヒストグラムに正のゲートを設定します。
    4. 同じプレートでテストした他のすべてのサンプルでこれらのゲートをコピーし、EtBr陽性THP-1細胞(少なくとも1つのIEを貪食したTHP-1細胞)の割合を決定します。試験した各サンプルについて、貪食細胞化は絶対値(EtBr+THP-1細胞のパーセンテージ)として+、または陽性対照を最大として使用してパーセンテージとして計算された相対的な食細胞症として報告することができる。

結果

ここでは,、THP-1細胞によるオプソ化および貪食を誘導するP.ファルシカルムIEの表面を標的とする抗体の容量を測定するために16、31、12、13、14、15、17、18を使用したプロトコルを詳細に提示する。31 11,12,13,14,15,

ディスカッション

ここで提示されるプロトコルは、前述し、12、15、17、3115,17,31を使用して12、P.熱帯熱化IEの表面を標的とする抗体の容量を測定し、THP-1細胞によるオプトニゼーションおよび貪食を誘導する。ここで示した結果は、P.熱帯熱膜固有領域に住む女性の血漿/血清中の天然に獲得したVAR2CSA特...

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

マイケン・ビスティは、優れた技術支援に感謝しています。この作品の一部は、デンマーク外務省からの助成金(MAVARECA II;17-02-KU)によって資金提供され、ダニダ・フェローシップ・センターが管理していました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、出版の決定、原稿の作成には何の役割も持っていませんでした。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
96 well cell culture plates, round bottom with lidCorning3799Any similar plate can be used, make sure it is compatible with the flow cytometer instrument you intend to use
AlbuMAX-IIGibco11021-037
AlbuMAX-II (5%)--5% AlbuMAX-II (Gibco, 11021-037), 0.2g/L hypoxanthine (Sigma, H9377) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Anti-Red Blood Cells antibodyAbcamab34858Prepare 2μl aliquots and freeze a -20°C. Use one aliquot per experiment.
DPBSSigmaP8622
Dynabeads Protein GInvitrogen10003D
Ethidium bromide solutionSigmaE1510Prepare a stock solution at 0.1mg/mL in RPMI1640 (R5886). Store protected from light
FC500 flow cytometerBeckman CoulterAny flow cytometer supporting 96 well plate format and having the appropriate lasers/filters to measure EtBr fluorescence can be used.
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco10099-141Heat inactivate before use.
FITC mouse anti-human CD16BD Biosciences555406 or 556618
FITC mouse anti-human CD32BD Biosciences552883
FITC mouse anti-human CD64BD Biosciences555527
FlowLogic softwareInivai technologiesAny flow cytometry analysis can be used, for example FlowJo or Winlist
Gentamicin (10mg/mL)SigmaG1272
HypoxanthineSigmaH9377
L-glutamine (200mM)SigmaG7513
Lysing solution--15mM NH4Cl, 10mM NaHCO3, 1mM EDTA
MACS CS-column and accesoriesMiltenyi Biotec130-041-305
Parasite culture medium--2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 50µg/mL Gentamicin (Sigma, G1272), 0.5% AlbuMAX-II (AlbuMAX-II 5%) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Penicillin/Streptomycin (10000U and 10mg/mL)SigmaP0781
RPMI-1640 mediumSigmaR5886
THP-1 culture medium--10%FBS (Gibco, 10099-141), 2mM L-glutamine (Sigma, G7513), 100U/mL Penicillin, 0.1mg/mL Streptomycin (Sigma, P0781) in RPMI1640 (Sigma, R5886)
Vario MACS magnetMiltenyi Biotec

参考文献

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