亚细胞结构的超分辨率活细胞成像

摘要

这里介绍了一个在完整组织中进行超分辨率活细胞成像的协议。我们已经标准化了在其原生组织环境中成像高度敏感的成人干细胞群的条件。该技术涉及平衡时间和空间分辨率，以便直接观察活组织中的生物现象。

摘要

长期以来，在成像的空间和时间分辨率之间一直存在关键的权衡。传统上，超过光衍射极限的成像仅限于在标有强荧光信号的组织外的固定样品或活细胞上使用。当前的超分辨率活细胞成像技术需要使用特殊的荧光探头、高照明、多次图像采集和收购后处理，或者通常这些过程的组合。这些先决条件显著限制了该技术可以应用于的生物样本和上下文。

在这里，我们描述了一种在现场执行超分辨率（+140 nm XY 分辨率）延时荧光活细胞成像的方法。该技术还与低荧光强度相容，例如，EGFP 或 mCherry 内生标记在低表达基因。作为原理证明，我们使用这种方法可视化 德罗索菲拉 睾肠中的多个子细胞结构。在组织准备过程中，细胞结构和组织形态都保持在解剖睾膜内。在这里，我们使用这项技术来成像微管动力学，微管和核膜之间的相互作用，以及微管与中心体的附着。

该技术要求在样品准备、样品安装和标本固定方面进行特殊程序。此外，标本必须在解剖后保持数小时，同时不影响细胞功能和活动。虽然我们已经优化了活超分辨率成像的条件，特别是在 果蝇 雄性生殖干细胞（GSC）和祖细胞在解剖睾酮组织，这项技术广泛适用于各种不同的细胞类型。能够在不牺牲空间或时间分辨率的情况下观察细胞的生理条件，对于寻求解决细胞生物学关键问题的研究人员来说，将是一个宝贵的工具。

引言

可视化活细胞中的亚细胞结构和蛋白质动力学，其分辨率超过光的衍射极限，通常具有非常具有挑战性的^1-3。虽然已经开发了多种超分辨率技术，如随机光学-光学重建-显微镜（STORM）、光激活-本地化-显微镜（PALM）和刺激-排放-消耗（STED）4、5、6显微镜，但标本制备中的并发症以及保持生存能力和活性（外视）的需要，限制了传统超分辨率显微镜对成像活体样品的使用。传统的共聚焦显微镜不能达到空间分辨率超过+230纳米XY分辨率，往往不足以观察复杂的细胞下部结构^5，6。然而，最近在共聚焦显微镜，Airyscan超分辨率成像的发展，能够达到约140纳米（XY分辨率^）7，8，并具有相对简单的样品制备，与实时成像兼容。由于这种成像检测系统需要较长的采集时间，其高空间分辨率确实要以时间分辨率⁹为代价。因此，需要一种方法来确保活细胞成像以高空间分辨率扩展。

在这里，我们开发了一种方法，以最佳分辨率观察完整组织中的活细胞，以破译具有详细空间信息的亚细胞结构。此方法的设计是这样的，以便样品可以稳定地安装很长一段时间 （+ 10 小时）， 而无需移动或退化。该技术中使用的活细胞介质可以在超分辨率显微镜下支持细胞功能，避免光出血长达 10 小时。最后，此协议将激光在长时间内持续照明（如缺氧、湿度和温度变化以及营养耗尽）造成的大多数压力降至最低。

利用这个协议来成像果蝇雄性生殖系干细胞（GSC），我们能够观察微管的不对称活性如何允许与表观遗传上不同的姐妹染色体^{10，11，12，13}的优先相互作用。这些类型的细胞事件具有高度动态性，很难使用其他超分辨率成像方法（如风暴、PALM 或 STED）在活细胞中可视化。我们预计，这种方法将变得非常有用的细胞生物学家，因为他们的目标是了解活细胞的动态亚细胞结构，生活在组织。有许多领域可以应用这种方法，如研究蛋白质的动态:了解细胞的运动;和血统追踪和细胞分化过程，以及其他可能的应用。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1. 准备活细胞成像鸡尾酒（活细胞介质）

1. 补充施耐德的 果蝇 介质与15%的胎儿牛血清（FBS）和0.6倍青霉素/链霉素。将 pH 值调整到大约 7.0。
2. 在使用介质之前，将胰岛素添加到最终浓度为 200 μg/mL 的浓度中。
   注:这种介质对于在延时成像^10、14期间保持正常细胞分裂和果蝇睾睾司发育至关重要。

2. 准备玻璃底细胞培养皿

1. 使用直径为35毫米的多L-赖氨酸涂层玻璃底细胞培养皿进行果蝇睾膜。盘内井有一个直径为23毫米的玻璃底，一面高程为1毫米（图1A-a）。
   注:选择玻璃底盘，允许更短的工作距离，更大的数值孔径和更高的放大目标:这些功能对于获得超分辨率图像至关重要。
2. 使用透析膜 （MWCO: 12/14kD）， 允许气态交换。将膜切成小块。
   注:膜片应小于盘面的玻璃面积，但大到足以覆盖标本。
3. 用 100 μL 的活细胞介质浸泡膜 5 分钟。不要在样品上使用干燥膜，因为它可能会损坏它。膜有助于预防缺氧应激。
4. 准备 2+3 轻质玻璃或塑料片放在膜上，使组织不会漂浮。为此，请首先取取 50 mL 离心机管的外环，将其切成小块。然后，在使用前用70%乙醇对碎片进行消毒。
   注:此步骤可确保样品在成像过程中保持在表面，并且不会漂浮，这对获得最佳结果至关重要。
5. 准备一个直径为 25 毫米的戒指，并将其放置在盘子的高架侧。在它上放一个盖子，生成两个腔室。底部腔室将包含样品，而顶部腔室将用作湿度室，以防止样品干燥。
   1. 要制造这个环，请从 50 mL 离心机管中切断外环，这样它便能牢固地安装在 35 mm 盘的高架侧。类似的环可以以其他方式制作，例如，使用橡皮筋或塑料扭曲领带，以适应盘的高架侧，以正确保持盖片，而不会干扰样品。
      注:此步骤至关重要，特别是对于对压力敏感的样品，如缺氧条件以及温度和湿度的变化。

3. 从雄性苍蝇和安装中解剖睾司

1. 以10对年轻的雄性苍蝇（2~3天大）为例，解剖活细胞介质中的睾试，获得10对 果蝇 成人睾睾。
   1. 使用细钳在解剖盘的解剖显微镜下解剖苍蝇。
      注: 果蝇 （果蝇）菌株携带UAS-α-图布林-GFP转基因由早期生殖细胞驱动纳米-Gal4驱动。
   2. 使用 CRISPR-Cas9 技术生成以下敲击 性果蝇黑色素加斯特 菌株:拉明-米切里 （C-终端标签） 和 CENP-A-Dendra2-CENP-A [内部站点标签（第 118 - 第 119 个科顿之间）] 。
      注:虽然每个实验只需要一个质量优良的测试，但安装足够数量的组织（15-20）或细胞将确保至少有一个具有优秀荧光信号的健康样本进行延时成像。
2. 在解剖盘中的活细胞介质中清洗睾测试两次。
   1. 使用移液器添加介质，然后删除实时单元格介质作为洗涤步骤。
   2. 使用钳子去除多余的组织。任何额外的组织都会干扰成像。
      注意:不要使用磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行洗涤，因为它可能会影响某些细胞组件的动态。
3. 将 100°150 μL 的活细胞介质添加到盘子中（以第 2.1 步准备），然后使用移液器尖端将其铺在玻璃表面。将介质传播到表面，使组织能够正确粘在盘子上。
4. 使用细钳将睾试者转移到盘子中，并将它们带到菜的中心（图1A-b）。
   注意:避免传输碎片，因为它会干扰成像，并可能降低图像的质量。
5. 去除多余的活细胞介质（离开大约 10 μL 的介质），使组织平整并正确粘在盘上。快速执行此步骤以避免干燥样品。
6. 将预湿膜（以第 2.2 步和 2.3 步准备）放在睾片上（图 1A-c）。
7. 将 2+3 小塑料重量（以步骤 2.4 制备）放在膜上，这样样品就不会漂浮，并快速添加 100+150 μL 的活细胞介质（图 1A-d）。
   注:快速、温和地添加介质，确保样品不会干涸或变质。
8. 将塑料环（以第 2.5 步为准备）放在盘子的高架侧（图 1B-a）。
9. 在环顶部放置 22 mm x 22 mm 盖片（图 1B-b）。这将生成两个腔室。
10. 拿一张纸巾，用水抑制它，然后旋转它，并把它放在盖片上，创造一个潮湿的腔室（图1B-c）。关闭盘子的盖子（图1B-d），开始活细胞成像。
    注意:如果样品对光敏感，请在黑暗中执行第 3 节。

4. 就地进行 果蝇 雄性生殖系干细胞的活细胞成像

1. 将盘子放在超分辨率显微镜下，用舞台夹固定。
   1. 打开成像软件，打开传输的光，并使用 63 倍的目标，以焦点旋钮聚焦睾门组织。
      注意:如果难以找到具有 63 倍目标的样本，则首先使用 40 倍或 20 倍目标，然后再切换到 63 倍。
   2. 打开激光，单击 Live，找到最佳位置和条件的GSC。避免睾测试具有低荧光信号或有中心（小）远离表面。
      注:在 果蝇 睾测试中，GSC 连接到中心。
2. 调整 GSC 的对焦，确定样品的正确设置，包括激光功率、电子乘数 （EM） 增益、平均值和 Airyscan 模式的变焦。使用以下设置作为 德罗索菲拉 睾睾睾石表达EGFP标记α-图布林在早期生殖细胞的例子。
   1. 通过单击帧大小，将帧大小设置在 512 x 512 像素和 1024 x 1024 像素之间。
   2. 通过单击 平均值将帧平均值设置为 1 或 2。
      注:增加帧尺寸（>1024 x 1024 像素）和执行更多的平均值（即超过 2）可能导致光出血或光毒性。
   3. 通过单击激光将激光功率设置为 1%-2%。
      注意:增强激光功率也可能导致光出血或光毒。
   4. 通过单击 主增益将 EM 增益设置为低于建议级别（< 800）。
      注:较高的 EM 增益可能会生成器件。
   5. 放大感兴趣的区域或单元格，以减少图像采集时间并减少光模糊。这也使标本能够存活更长时间。
3. 使用 Airyscan 模式通过单击 "开始实验"启动延时图像捕获。
   1. 在单击 "开始实验"之前，请确保采集配置最佳。
   2. 如果它显示警告与通知"Airyscan 收购配置不最佳"，然后单击帧大小部分 的最佳值 ，单击 Z 堆栈部分 的最佳值 ，并单击 最佳 扫描区域部分（超分辨率成像至少需要 1.3 变焦）。
4. 根据实验设计和标本类型优化时间间隔、z 切片数量和延时成像的持续时间，这样图像的质量就不会受到影响，细胞不会在细胞周期的特定阶段被拘捕。
   1. 例如，在早期生殖系中表达EGFP标记的α-tubulin的 果蝇睾酸杆菌 的延时成像参数在以下步骤中显示。
   2. 对于超过 5 小时的延时成像，图像间隔为 10 分钟，激光功率为 1%，每次点最多可拍摄 30 z 片。
   3. 对于高度动态的细胞过程（如微管动力学），在时间点之间设置 2 分钟的间隔，在 1% 的激光功率下执行 1+2 小时延时成像，每次点最多拍摄 30 z 切片。
   4. 对于罕见的细胞事件，如相到早期特洛相色度色度动力学（2 3 分钟事件），设置实时细胞成像，在时间点之间间隔 1 分钟，以 1% 的激光功率执行 30 分钟的延时成像，并在每个时间点最多拍摄 30 z 切片。
      注:这些参数可能因不同样本而异，因此需要更改才能最优地用于特定样本。
5. 根据样品的灵敏度和实验设计执行延时成像或实时快照成像。
   注:短片为15-30分钟，长片超过5小时。
6. 如果样品非常敏感，无法像德罗索菲拉雄性GSC那样，通过超分辨率显微镜进行延时成像研究，则在不同的细胞周期阶段（如图2、图 3、图 4）执行样品的超分辨率实时快照 （SRLS）。
   1. 如果捕获了罕见的细胞生物事件或感兴趣的蛋白质表达水平较低，则执行 SRLS。
   2. 对于 SRLS，请在您感兴趣的特定细胞周期阶段找到一个单元格。例如，如果专注于微管-基内托乔雷结合，则使用假相或元相的细胞。
      注:这将有助于确保您在正确的时间获得感兴趣的细胞的高质量图像，而不会冒光毒性的风险，以样品或漂白荧光素，这可能发生在较长的电影。
   3. 如果使用 SRLS，则在多个单元中成像不同细胞周期阶段，并按时间顺序排列这些图像。
      注:这可用于构建事件的时间顺序，同时最大限度地提高信号和组织健康，为信号特别敏感的样品或样品获得出色的事件时间分辨率。

5. 艾利斯坎处理活细胞图像

1. 使用成像软件采集图像后，选择 处理，单击 批次，然后选择 Airyscan处理。
   1. 选择要处理的图像，然后单击 "运行/过程" 以获取超分辨率图像。
   2. 使用默认设置执行处理。
      注:只有在为 Airyscan 成像正确设置成像设置的情况下，空气扫描处理才能正常工作。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

超过果蝇组织衍射极限的活细胞成像，特别是GSC，为研究细胞周期进展背景下亚细胞事件的动态提供了机会。最近，利用这一协议的研究表明，在GSC¹⁰中，母亲中心体与女儿中心体的微管活动在时间上不对称。母亲中心体在子宫切入前约4小时发出微管，而女儿中心只在子宫增多时发出微管。来自母中心体的高度活跃的微管与核膜相互作用，并诱导两极分化的核包络分解（N...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

超分辨率显微镜方法提供高达10秒的纳米^4，5，6的空间分辨率。STORM 和 PALM 显微镜方法允许分辨率高达 20 到 50 nm（XY 分辨率），而 STED 显微镜的分辨率为 20 到 100 nm（XY 分辨率）。SIM显微镜的空间分辨率限制在100至130纳米^15。然而，由于其高光子密度和较长的采集时间，使用这些技术进行活细胞成像极具挑战性。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A