細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

要約

ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。

要約

イメージングにおける空間的解像度と時間的解像度の間には、長い間重要なトレードオフがありました。光の回折限界を超えるイメージングは、従来、強力な蛍光シグナルで標識された組織外の固定サンプルまたは生細胞にのみ使用することが制限されてきました。現在の超高解像度ライブセルイメージング技術では、特殊な蛍光プローブ、高い照明、取得後処理を伴う複数の画像取得、またはしばしばこれらのプロセスの組み合わせを使用する必要があります。これらの前提条件は、この技術を適用できる生物学的サンプルおよびコンテキストを大幅に制限します。

ここでは、超分解能(〜140nm XY分解能)の蛍光生細胞イメージングをその時点で行う方法について説明する。この技術はまた、低蛍光強度、例えば、低発現遺伝子で内因的にタグ付けされたEGFPまたはmCherryと互換性がある。原理実証として、ショ ウジョウバエ 精巣の複数の細胞下構造を可視化するためにこの方法を用いてきた。組織の準備中に、細胞構造と組織形態の両方が解剖された精巣内で維持される。ここでは、この技術を用いて、微小管ダイナミクス、微小管と核膜の相互作用、セントロメアへの微小管の付着を画像化します。

この技術は、試料の調製、サンプルの取り付けおよび固定化に特別な手順を必要とします。さらに、標本は、細胞機能および活動を損なうことなく解剖後数時間維持されなければならない。ショ ウジョウバエ の男性生殖細胞幹細胞(GSC)および解剖精巣組織の前駆細胞における生きた超解像イメージングの条件を最適化しましたが、この技術は様々な異なる細胞タイプに広く適用されます。空間的または時間的な解像度を犠牲にすることなく、生理学的条件下で細胞を観察する能力は、細胞生物学における重要な問題に取り組む研究者にとって非常に貴重なツールとして役立ちます。

概要

光の回折限界を超える分解能を持つ生細胞における細胞下構造およびタンパク質ダイナミクスの可視化は、典型的には^1-3という非常に困難である。確率的光学再構成顕微鏡(STORM)、光活性化局在化顕微鏡(PALM)、刺激放出破壊(STED)4、5、6顕微鏡検査などの複数の超解像技術が開発されている一方で、検体調製の合併症、および生きている生き物の生存率と活性を維持する必要性、ライブイメージング用の従来の超解像顕微鏡の使用が制限されています。従来の共焦点顕微鏡は、〜230 nmのXY解像度を超える空間解像度に達することができず、複雑な細胞下構造^5,6を観察するには不十分であることが多い。しかし、最近の共焦点顕微鏡法の開発では、Airyscan超解像イメージングは、約140nm(XY解像度^)7、8を達成することができ^、ライブイメージングと互換性のある比較的簡単なサンプル調製物を有する。この撮像検出システムは、長い取得時間を必要とするため、その高い空間分解能は、時間分解能⁹を犠牲にして来る。したがって、ライブセルイメージングを高い空間分解能で拡張するための方法が必要です。

ここでは、細胞内の細胞構造を詳細な空間情報で解読するための最適な分解能で、インタクト組織で生きた細胞を観察する方法を開発しました。この方法は、サンプルが移動または退行することなく長期間(〜10時間)安定して取り付けることができるように設計されています。この技術で使用される生細胞媒体は細胞機能を支え、超解像顕微鏡の下で10時間までの光の消光を避けることができる。最後に、このプロトコルは、低酸素症、湿度や温度の変化、ならびに栄養の枯渇などの長期間にわたってレーザーの一定の照明によって引き起こされるほとんどのストレスを最小限に抑えます。

このプロトコルを用いてショウジョウバエの生殖細胞幹細胞(GSC)をイメージし、微小管の非対称活性がエピジェネティックに異なる姉妹クロマチド^{10、11、12、13}との優向的相互作用を可能にする方法を観察することができた。これらのタイプの細胞イベントは非常に動的であり、STORM、PALM、STEDなどの他の超解像度イメージング法を使用して、生細胞で視覚化することは非常に困難です。この方法は、組織に存在する生細胞の動的な細胞下構造を理解することを目的として、細胞生物学者にとって非常に有用なものになると予想されます。タンパク質のダイナミクスの研究など、この方法を適用できる多くの分野があります。細胞の動きを理解する。他の可能なアプリケーションの中で、系統トレースと細胞分化プロセス。

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プロトコル

1. 生細胞イメージングカクテル(生細胞培地)の調製

1. 15%のウシ胎児血清(FBS)と0.6xペニシリン/ストレプトマイシンとシュナイダーの ショウジョウバエ 培地を補う。pH を約 7.0 に調整します。
2. 培地を使用する直前に、インスリンを200 μg/mLの最終濃度に加えます。
   注:この培地は、タイムラプスイメージング^10、14の間に正常な細胞分裂およびショウジョウバエ精巣の発達を維持するために重要です。

ガラス底細胞培養皿の調製

1. ショウジョウバエの精巣に直径35mmのポリL-リジンコーティングガラス底細胞培養皿を使用してください。皿の内側の井戸は直径23 mmのガラス底と1mmの高さの側面がある(図1A-a)。
   注:より短い作業距離、より大きな数値絞り、および高い倍率の目的を可能にするガラス底皿を選択してください。これらの機能は、超解像度のイメージを取得するために重要です。
2. ガス交換を可能にする透析膜(MWCO:12~14kD)を使用します。膜を小さく切ります。
   注:膜片は、皿のガラス部分よりも小さいが、標本をカバーするのに十分な大きさでなければなりません。
3. 膜に100μLの生細胞培地を5分間浸します。サンプルに乾燥した膜を使用しないでください, それは、それが損傷を受け、.膜は低酸素ストレスを防ぐのに役立ちます。
4. 2~3個の軽量ガラスまたはプラスチック片を準備して、組織が浮遊しないように膜に入れます。これを行うには、まず50 mL遠心分離管の外輪を取り、小片に切ります。その後、使用前に70%エタノールで切片を殺菌する。
   注: この手順により、イメージング中にサンプルが表面に残り、浮遊することがないようにします。
5. 直径25mmのリングを準備し、皿の高い側に置きます。2つの部屋を生成するために、その上にカバースリップを置きます。最下部のチャンバーは、上部のチャンバーは、乾燥からサンプルを防ぐために湿度チャンバーとして機能する間、サンプルが含まれます。
   1. このリングを作るためには、外側のリングを50 mL遠心管から切り落とし、35mm皿の高い側にしっかりと収まるようにします。同様のリングは、例えば、サンプルに干渉することなくカバースリップを適切に保持するために、皿の高い側に収まるようにゴムバンドまたはプラスチックのツイストタイを使用することによって、他の方法で作ることができます。
      注: この手順は、特に低酸素状態や温度や湿度の変化などのストレスに敏感なサンプルに対して重要です。

3. 雄のハエと取り付けからの精巣の解剖

1. ~10個の若い雄のハエ(生後2~3日)を服用し、生細胞培地で精巣を解剖して、ショ ウジョウバエ の成人精巣の約10組を得る。
   1. 細かい鉗子を使用して解剖皿の解剖顕微鏡の下でハエを解剖する。
      注: ショウジョウバエメラノガスター (フルーツフライ)株は、初期の胚芽細胞ドライバーnanos-Gal4によって駆動されるUAS-α-Tubulin-GFPトランスジーンを運びます。
   2. CRISPR-Cas9技術を使用して、次のノックイン ショウジョウバエメラノガスター 株を生成します: ラミン-mCherry (C末端タグ) と CENP-A-Dendra2-CENP-A [内部サイトでタグ (118th - 119 番目のコドンの間)].
      注:各実験に必要な優れた品質のテストは1つだけですが、十分な数の組織(15〜20)または細胞を取り付けることで、タイムラプスイメージングのための優れた蛍光信号を持つ少なくとも1つの健康なサンプルが存在することを保証します。
2. 解剖皿の生細胞媒体で精巣を2回洗う。
   1. ピペットを使用して、洗浄工程としてライブセルメディアを取り除いて、培地を追加します。
   2. 鉗子を使用して余分な組織を除去する。余分な組織はイメージングを妨げる。
      注:リン酸緩衝生理食塩水(PBS)は、特定の細胞成分のダイナミクスに影響を与える可能性があるため、洗浄に使用しないでください。
3. 100~150 μL のライブセルメディアを皿に加え(ステップ 2.1 で作成)、ピペットチップを使用してガラス表面に広げます。表面にメディアを広げると、組織が皿に適切に固執することができます。
4. 精巣を細かい鉗子で皿に移し、皿の中央に持って来なさい(図1A-b)。
   注: デブリの転送は、画像の妨げとなり、画像の品質が低下する可能性があるため、転送を避けてください。
5. 余分な生細胞培地(約10μLの培地を残す)を取り除き、組織が平らになり、皿に適切に付着できるようにします。サンプルの乾燥を避けるために、このステップを迅速に実行します。
6. プリウェット膜(ステップ2.2と2.3で準備)を精巣の上に置きます(図1A-c)。
7. サンプルが浮かばないように(ステップ2.4で準備された)2~3個の小さなプラスチック重量を膜に入れ、100~150μLの生細胞媒体を素早く加える(図1A-d)。
   注:メディアを素早く、穏やかに加えて、サンプルが乾燥したり、変位しないようにします。
8. プラスチックリング(ステップ2.5で用意)を皿の高い側に置きます(図1B-a)。
9. リングの上に22 mm x 22 mmのカバースリップを置きます(図1B-b)。これは2つの部屋を生成する。
10. ティッシュペーパーを取り、水で湿らせ、それを渦巻いてカバースリップに置き、湿気の多いチャンバーを作ります(図1B-c)。皿のふたを閉じて (図 1B-d) ライブセルイメージングを開始します。
    注: サンプルが光に敏感な場合は、暗い部分 3 を実行します。

4. ショ ウジョウバエ の生殖細胞幹細胞(GSC)の細胞を生画像化

1. 超分解能顕微鏡の下に皿を置き、ステージクランプで固定します。
   1. イメージングソフトウェアを開き、透過光をオンにし、63xの目的を使用して、フォーカスノブで精巣組織に焦点を当てます。
      注:63xの目的でサンプルを見つけるのが難しい場合は、最初に40xまたは20xの目的を使用してから63xに切り替えます。
   2. レーザーをオンにし、[ ライブ] をクリックして、最適な位置と条件を持つ GSC を見つけます。蛍光信号が低い場合や、表面から離れたハブ(ニッチ)を持つ精巣は避けてください。
      注: ショウジョウバエ のテストでは、GSCはハブに取り付けられています。
2. GSCの焦点を調整し、レーザーパワー、電子乗算(EM)ゲイン、平均化、Airyscanモードのズームなど、サンプルに適した設定を特定します。初期段階の生殖細胞にタグ付きαチューブリンを発現する ショウジョウバエ 精巣の例として、以下の設定を使用する。
   1. [フレーム サイズ] をクリックして、512 x 512 ピクセルから 1024 x 1024 ピクセルの 間でフレーム サイズを設定します。
   2. [ 平均化] をクリックして、フレーム平均を 1 または 2 に設定します。
      注:フレームサイズ(>1024 x 1024ピクセル)を大きくして、より多くの平均化(すなわち、2以上)を実行すると、光の漂白または光毒性が生じる可能性があります。
   3. [レーザー] をクリックして、 レーザーパワーを 1%~2% に設定します。
      注:レーザーパワーを高くすると、光の漂白や光毒性を引き起こし得る可能性があります。
   4. [マスターゲイン]をクリックして、EMゲインを推奨レベル(<800)以下に設定します。
      注: EM ゲインが高いほど、アーティファクトが生成される場合があります。
   5. 対象となる領域またはセルを拡大して、画像取得時間を短縮し、フォトブリーチを減らします。これにより、標本はより長い時間生き残ることができます。
3. [テストの開始] をクリックして、Airyscan モードを使用してタイムラプス イメージのキャプチャ を開始します。
   1. [ 実験の開始] をクリックする前に、取得が最適に構成されていることを確認します。
   2. 「Airyscan の取得が最適に構成されていません」という警告が表示された場合は、[フレーム サイズで 最適] をクリックし、[Z スタック] セクションの [最適] をクリックして、[スキャン領域に 最適 ] セクションをクリックします (超解像度イメージングには最低 1.3 ズームが必要です)。
4. 実験計画と標本の種類に応じて、時間間隔、zスライス数、タイムラプスイメージングの持続時間を最適化し、画像の品質が損なわれず、細胞周期の特定の段階で細胞が逮捕されないようにします。
   1. 一例として、初期生殖細胞系列におけるEGFPタグ付きαチューブリンを発現する ショウジョウバエ 精巣のタイムラプスイメージングのパラメータを以下の手順で示す。
   2. 5時間以上のタイムラプスイメージングでは、1%レーザーパワーで10分間隔で画像を撮影し、各時点で最大30 Zスライスを取ります。
   3. 微小管ダイナミクスなどの非常に動的な細胞プロセスでは、時間間隔を 2 分に設定し、1~ 2 時間のタイムラプスイメージングを 1% レーザーパワーで実行し、各タイム ポイントで最大 30 z スライスを取ります。
   4. アナフェーズから初期のテロ相クロマチンダイナミクス(2〜3分の事象)のようなまれな細胞事象の場合、タイムポイント間に1分間隔でライブセルイメージングを設定し、1%レーザーパワーで30分のタイムラプスイメージングを行い、各タイムポイントで最大30 zスライスを取ります。
      注: これらのパラメータはサンプルによって異なる場合があるため、特定のサンプルに最適な使用のために変更が必要になります。
5. サンプルの感度と実験計画に応じて、タイムラプスイメージングまたはライブスナップショットイメージングを実行します。
   注:短編映画は15〜30分で、長い映画は5時間以上です。
6. サンプルが非常に敏感で、超解像顕微鏡によるタイムラプスイメージングでは研究できない場合、ショウジョウバエオスGSCの場合が多い場合と同様に、異なる細胞周期段階でサンプルの超分解能ライブスナップショット(SRLS)を実行する(図2、図3、図4を参照)。
   1. 希少な細胞生物学的事象が捕捉されているか、または目的のタンパク質の発現レベルが低い場合は、SRLSを実行する。
   2. SRLS の場合、興味のある特定のセル・サイクル・ステージでセルを見つけます。例えば、微小管キネトコレ結合に焦点を当てる場合、前転移またはメタフェーズで細胞を使用する。
      注:これは、より長い映画の間に発生する可能性のある蛍光HORのサンプルや漂白に光毒性を危険にさらすことなく、適切なタイミングで関心のある細胞の高品質の画像を得るのに役立ちます。
   3. SRLSを使用する場合は、複数のセル間で目的の異なる細胞周期段階を画像化し、これらの画像を時系列に並べ替えます。
      注:これは、信号と組織の健康を最大化しながらイベントの時系列順序を構築するために使用することができ、特に低信号を有する特に敏感なサンプルまたはサンプルのイベントの優れた時間分解能を得るために使用することができる。

5. ライブセル画像のエアリスキャン処理

1. イメージング ソフトウェアでイメージを取得した後で、[ 処理]、[ バッチ] の順に選択し 、[Airyscan 処理] を選択します。
   1. 処理するイメージを選択し、[ 実行/処理 ] をクリックして、超解像度イメージを取得します。
   2. デフォルト設定を使用して処理を実行します。
      メモ:Airyscanの処理は、イメージング設定がAiryscanイメージング用に正しく設定されている場合にのみ機能します。

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結果

ショウジョウバエ組織の回折限界を超えた生細胞イメージングは、特にGSCの場合、細胞周期進行の文脈における細胞内事象のダイナミクスを調査する機会を提供する。最近、このプロトコルを利用した研究では、母中心と娘の中心点での微小管活動が^GSC10において時間的に非対称であることを示している。母心部は、有糸の開始の約4時間前に微小管を発するが、娘の?...

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ディスカッション

超解像顕微鏡法は、ナノメートル^4、5、6の10sの高い空間分解能^を提供する。STORMおよびPALM顕微鏡法では、最大20~50nm(XY解像度)の分解能が可能で、STED顕微鏡は20~100nm(XY解像度)の分解能を実現します。SIM顕微鏡の空間分解能は100〜130 nm¹⁵に制限されています。しかし、高光子密度と長い取得時間のため、これらの技術?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A