Hücre Altı Yapıların Süper Çözünürlüklü Canlı Hücre Görüntülemesi

Özet

Burada, bozulmamış dokuda süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme için bir protokol sunulmaktadır. Son derece hassas bir erişkin kök hücre popülasyonunu doğal doku ortamında görüntüleme koşullarını standartlaştırdık. Bu teknik, biyolojik olayların canlı dokuda doğrudan gözlemlenmesine izin vermek için zamansal ve mekansal çözünürlüğü dengelemeyi içerir.

Özet

Görüntülemede mekansal ve zamansal çözünürlük arasında uzun zamandır önemli bir denge vardır. Işığın kırınım sınırının ötesinde görüntüleme, geleneksel olarak sadece sabit numunelerde veya güçlü floresan sinyalle etiketlenmiş doku dışındaki canlı hücrelerde kullanılmak üzere kısıtlanmıştır. Mevcut süper çözünürlüklü canlı hücre görüntüleme teknikleri, özel floresan problarının, yüksek aydınlatmanın, alım sonrası işlemle birden fazla görüntü alımının veya genellikle bu süreçlerin bir kombinasyonunun kullanılmasını gerektirir. Bu önkoşullar, bu tekniğin uygulanabileceği biyolojik örnekleri ve bağlamları önemli ölçüde sınırlar.

Burada süper çözünürlüklü (~140 nm XY çözünürlüklü) zaman atlamalı floresan canlı hücre görüntüleme in situ gerçekleştirmek için bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik aynı zamanda düşük floresan yoğunluğu ile de uyumludur, örneğin EGFP veya mCherry düşük eksprese genlerde endojen olarak etiketlenmiştir. İlke kanıtı olarak, Drosophila testislerindeki birden fazla hücre altı yapıyı görselleştirmek için bu yöntemi kullandık. Doku hazırlama sırasında, incelenmiş testisler içinde hem hücresel yapı hem de doku morfolojisi korunur. Burada, mikrotübül dinamiklerini, mikrotübüller ve nükleer membran arasındaki etkileşimleri ve mikrotübüllerin merkezkantlara bağlanmasını görüntülemek için bu tekniği kullanıyoruz.

Bu teknik, numune hazırlama, numune montajı ve numunelerin hareketsiz hale alınmasında özel prosedürler gerektirir. Ek olarak, numuneler diseksiyondan sonra hücresel işlevden ve aktiviteden ödün vermeden birkaç saat boyunca tutulmalıdır. Özellikle Drosophila erkek germline kök hücrelerinde (GSC' ler) ve diseksiyonlu testis dokusundaki progenitor mikrop hücrelerinde canlı süper çözünürlüklü görüntüleme koşullarını optimize etmiş olsak da, bu teknik çeşitli hücre tipleri için yaygın olarak geçerlidir. Hücreleri mekansal veya zamansal çözünürlüklerden ödün vermeden fizyolojik koşulları altında gözlemleyebilmeleri, hücre biyolojisinde önemli soruları ele almak isteyen araştırmacılar için paha biçilmez bir araç olarak hizmet edecektir.

Giriş

Canlı hücrelerdeki hücre altı yapıları ve protein dinamiklerini ışığın kırınım sınırının ötesinde çözünürlükle görselleştirmek genellikle çok zordur^1-3. Stokastik-Optik Rekonstrüksiyon-Mikroskopi (STORM), Foto-Aktif-Lokalizasyon-Mikroskopi (PALM) ve Uyarılmış Emisyon-Tükenme (STED)^{4, 5,6}mikroskopisi gibi birden fazla süper çözünürlüklü teknik geliştirilirken, numune hazırlamada komplikasyonların yanı sıra canlılık ve aktivite ex vivo'nun korunması ihtiyacı, canlı örneklerin görüntülenmesi için geleneksel süper çözünürlüklü mikroskopi kullanımını sınırlar. Konvansiyonel konfokal mikroskopi ~ 230 nm XY çözünürlüğünün ötesinde uzamsal çözünürlüğe ulaşamaz ve genellikle karmaşık hücresel alt yapıları gözlemlemek için yetersizdir^5,6. Bununla birlikte, konfokal mikroskopide yeni bir gelişme olan Airyscan süper çözünürlüklü görüntüleme, yaklaşık 140 nm (XY çözünürlüklü)^7,8 elde edebilir ve canlı görüntüleme ile uyumlu nispeten basit bir örnek preparata sahiptir. Bu görüntüleme algılama sistemi uzun bir alım süresi gerektirdiğinden, yüksek uzamsal çözünürlüğü zamansal çözünürlük⁹maliyetine gelir. Bu nedenle, canlı hücre görüntülemenin yüksek uzamsal çözünürlükle genişletilmesini sağlamak için bir yönteme ihtiyaç vardır.

Burada, ayrıntılı mekansal bilgilerle hücre altı yapıları deşifre etmek için canlı hücreleri sağlam dokuda en uygun çözünürlükte gözlemlemek için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, numunelerin hareket etmeden veya dejenere olmadan uzun bir süre (~ 10 saat) bıçaklanabilmesi için tasarlanmıştır. Bu teknikte kullanılan canlı hücre ortamı hücresel işlevi destekleyebilir ve süper çözünürlüklü bir mikroskop altında 10 saate kadar fotobleachingden kaçınabilir. Son olarak, bu protokol, lazerlerin hipoksi, nem ve sıcaklıktaki değişiklikler ve besin tükenmesi gibi uzun süre boyunca sürekli aydınlatılmasından kaynaklanan çoğu stresi en aza indirir.

Drosophila erkek germline kök hücrelerini (GSC) görüntülemek için bu protokolü kullanarak, mikrotübüllerin asimetrik aktivitesinin epigenetik olarak farklı kardeş kromatizatörleri^{10 , 11,12,13}ile tercihli etkileşime nasıl izin verdiğini gözlemleyebildik. Bu tür hücresel olaylar son derece dinamiktir ve STORM, PALM veya STED gibi diğer süper çözünürlüklü görüntüleme yöntemlerini kullanarak canlı hücrelerde görselleştirmek çok zordur. Dokularda bulunan canlı hücrelerin dinamik hücre altı yapılarını anlamayı amaçlayan bu yöntemin hücre biyologları için oldukça yararlı hale geleceğini öngörüyoruz. Proteinlerin dinamiklerini incelemek gibi bu yöntemin uygulanabileceği birçok alan vardır; hücrelerin hareketini anlamak; ve diğer olası uygulamaların yanı sıra soy izleme ve hücresel farklılaşma süreçleri.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. Canlı hücre görüntüleme kokteylinin hazırlanması (canlı hücre ortamı)

1. Schneider'ın Drosophila ortamını %15 fetal sığır serumu (FBS) ve 0.6x penisilin/streptomisin ile destekleyin. pH'ı yaklaşık 7,0 olarak ayarlayın.
2. Ortamı kullanmadan hemen önce, 200 μg / mL'lik son konsantrasyona insülin ekleyin.
   NOT: Bu ortam, zaman atlamalı görüntüleme sırasında Drosophila testislerinin normal hücre bölünmesini ve gelişimini korumak için kritik öneme sahiptir^10,14.

2. Cam alt hücre kültür çanağının hazırlanması

1. Drosophila testisleri için 35 mm çapında bir poli L-lizin kaplı cam-alt hücre kültürü çanağı kullanın. Kabın iç kuyusu 23 mm çapında bir cam tabana ve 1 mm yüksekliğinde bir tarafa sahiptir(Şekil 1A-a).
   NOT: Daha kısa çalışma mesafesi, daha büyük sayısal diyafram ve daha yüksek büyütme hedefi sağlayan bir cam tabanlı tabak seçin; bu özellikler süper çözünürlüklü bir görüntü elde etmek için çok önemlidir.
2. Gaz değişimine izin veren bir diyaliz zarı (MWCO: 12–14kD) kullanın. Zarı küçük parçalar halinde kesin.
   NOT: Membran parçaları kabın cam alanından daha küçük ancak numuneyi kaplayacak kadar büyük olmalıdır.
3. Membranı ~ 5 dakika boyunca 100 μL canlı hücre ortamı ile ıslatın. Numuneye zarar verebileceği için kuru bir zar kullanmayın. Membran hipoksik stresi önlemeye yardımcı olur.
4. Dokunun yüzmemesi için zara koymak için 2-3 hafif cam veya plastik parça hazırlayın. Bunu yapmak için, önce 50 mL santrifüj tüpünün dış halkasını alın ve küçük parçalar halinde kesin. Daha sonra, kullanmadan önce parçaları% 70 etanol ile sterilize edin.
   NOT: Bu adım, numunenin görüntüleme sırasında yüzeyde kalmasını ve yüzmemesini sağlar, bu da en iyi sonuçları elde etmek için çok önemlidir.
5. Yaklaşık 25 mm çapında bir halka hazırlayın ve kabın yükseltilmiş tarafına yerleştirin. İki odacık oluşturmak için üzerine bir kapak kılıfı koyun. Alt oda numuneyi içerirken, üst oda numunenin kurumasını önlemek için bir nem odası görevi görecektir.
   1. Bu halkayı yapmak için, dış halkayı 35 mm'lik kabın yükseltilmiş tarafına güvenli bir şekilde oturmasını sağlayacak 50 mL santrifüj tüpünden kesin. Benzer bir halka, örneğin, numuneye müdahale etmeden kapak sapını düzgün bir şekilde tutmak için kabın yükseltilmiş tarafına sığacak bir lastik bant veya plastik büküm bağı kullanılarak başka şekillerde de yapılabilir.
      NOT: Bu adım, özellikle hipoksik koşullar ve sıcaklık ve nem değişiklikleri gibi gerilmelere duyarlı numuneler için kritik öneme sahiptir.

3. Testislerin erkek sineklerden ve montajdan diseksiyonu

1. ~10 genç erkek sinek alın (2-3 günlük) ve ~10 çift Drosophila yetişkin testisi elde etmek için canlı hücre medyasında testisleri inceleyin.
   1. Sinekleri ince emişler kullanarak bir diseksiyon kabında diseksiyon mikroskobu altında parçalara ayrıştırın.
      NOT: Drosophila melanogaster (meyve sineği) suşu, erken mikrop hücresi sürücüsü nanos-Gal4 tarafından tahrik edilen UAS-α-Tubulin-GFP transgene taşır.
   2. CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak aşağıdaki darbe drosophila melanogaster suşlarını oluşturun: Lamin-mCherry (C-terminal etiketi) ve CENP-A-Dendra2-CENP-A [iç sahadaki etiket (118- 119. kodon arasında)].
      NOT: Her deney için mükemmel kalitede sadece bir testis gerekirken, yeterli sayıda doku (15-20) veya hücre monte etmek, zaman atlamalı görüntüleme için mükemmel floresan sinyallerine sahip en az bir sağlıklı örnek olmasını sağlayacaktır.
2. Testisleri diseksiyon kabında canlı hücre medyasında iki kez yıkayın.
   1. Canlı hücre medyasını yıkama adımı olarak kaldırarak ardından medya eklemek için bir pipet kullanın.
   2. Asalet kullanarak fazla dokuyu çıkarın. Herhangi bir ekstra doku görüntülemeyi bozacaktır.
      NOT: Yıkama için fosfat tamponlu salin (PBS) kullanmayın, çünkü bazı hücresel bileşenlerin dinamiklerini etkileyebilir.
3. Çanağa 100-150 μL canlı hücre ortamı ekleyin (adım 2.1'de hazırlanır) ve pipet ucu kullanarak cam yüzeye yayın. Ortamı yüzeye yaymak, dokunun çanağa düzgün bir şekilde yapışmasını sağlayacaktır.
4. Testisleri ince tokmaklar kullanarak çanağa aktarın ve yemeğin ortasına getirin(Şekil 1A-b).
   NOT: Görüntülemeyi engelleyeceğinden ve görüntünün kalitesini düşürebileceğinden enkaz aktarmaktan kaçının.
5. Dokunun düzleşmesine ve yemeğe düzgün yapışmasına izin vermek için fazla canlı hücre medyasını (yaklaşık 10 μL ortam bırakın) çıkarın. Numunenin kurumasını önlemek için bu adımı hızlı bir şekilde gerçekleştirin.
6. Ön ıslatma zarını (adım 2.2 ve 2.3'te hazırlanmış) testislerin üzerine yerleştirin (Şekil 1A-c).
7. Membranın üzerine 2-3 küçük plastik ağırlık (Adım 2.4'te hazırlanmıştır) koyun, böylece numune yüzmez ve hızlı bir şekilde 100-150 μL canlı hücre ortamı ekler (Şekil 1A-d).
   NOT: Ortamın hızlı ve nazikçe eklenmesi, numunenin kurumasını veya yer değiştirmemesini sağlar.
8. Plastik halkayı (adım 2,5'te hazırlanmış) kabın yükseltilmiş tarafına yerleştirin(Şekil 1B-a).
9. Halkanın üzerine 22 mm x 22 mm kapak kılıfı yerleştirin(Şekil 1B-b). Bu iki odacık oluşturur.
10. Nemli bir oda oluşturmak için bir parça kağıt mendil alın, suyla nemlendirin, sonra döndürün ve kapakçığa koyun (Şekil 1B-c). Kabın kapağını kapatın (Şekil 1B-d) ve canlı hücre görüntülemeye başlayın.
    NOT: Örnek ışığa duyarlıysa, bölüm 3'ü karanlıkta gerçekleştirin.

4. Drosophila erkek germline kök hücrelerinin (GSC) yerinde canlı hücre görüntülemesi

1. Kabı süper çözünürlüklü mikroskobun altına yerleştirin ve sahne kelepçeleriyle sabitleyin.
   1. Görüntüleme yazılımını açın, iletilen ışığı açın ve odak düğmesiyle testis dokusuna odaklanmak için 63x hedefi kullanın.
      NOT: 63x hedefine sahip bir örneği bulmakta zorluk çekiyorsanız, 63x'e geçmeden önce 40x veya 20x hedefini kullanın.
   2. Lazerleri açın, Canlı'yı tıklatın ve GSC'yi en uygun konum ve koşulla bulun. Düşük floresan sinyaline sahip veya hub'ı (niş) yüzeyden uzakta olan testlerden kaçının.
      NOT: Drosophila testlerinde GSC'ler hub'a bağlanır.
2. GSC'ler için odağı ayarlayın ve Lazer gücü, elektron çarpma (EM) kazancı, ortalama alma ve Airyscan modu için yakınlaştırma dahil olmak üzere örnek için doğru ayarları tanımlayın. Erken evre mikrop hücrelerinde EGFP etiketli α-tübulin ifade eden Drosophila testisleri için aşağıdaki ayarları örnek olarak kullanın.
   1. Çerçeve Boyutu 'nu tıklatarak çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel ile 1024 x 1024 piksel arasında ayarlayın.
   2. Ortalama 'yı tıklatarak çerçeve ortalamasını 1 veya 2 olarak ayarlayın.
      NOT: Çerçeve boyutunu artırmak (>1024 x 1024 piksel) ve daha fazla ortalama (yani 2'den fazla) yapmak fotobleaching veya fototoksikliğe neden olabilir.
   3. Lazerler 'i tıklatarak lazer gücünü %1–%2 olarak ayarlayın.
      NOT: Lazer gücünün artırılması fotobleaching veya fototoksikiteye de yol açabilir.
   4. Ana Kazanç 'ı tıklatarak EM kazancını önerilen düzeyin (< 800) altına ayarlayın.
      NOT: Daha yüksek bir EM kazancı yapıtlar oluşturabilir.
   5. Görüntü alma süresini azaltmak ve fotobleaching'i azaltmak için ilgi çekici bölgeye veya hücreye yakınlaştırın. Bu aynı zamanda numunenin daha uzun süre hayatta kalmasına izin verir.
3. Denemeyi Başlat 'ı tıklatarak Airyscan modunu kullanarak zaman atlamalı görüntü yakalamayı başlatın.
   1. Denemeyi Başlat'ı tıklatmadan önce, edinmenin en iyi şekilde yapılandırıldığından emin olun.
   2. "Airyscan alma en iyi şekilde yapılandırılmamıştır" uyarısıyla bir uyarı görüntülerse, çerçeve boyutu bölümünde En İyi'yi tıklatın, z yığını bölümünde En İyi'yi tıklatın ve tarama alanı bölümü için En İyi'yi tıklatın (süper çözünürlüklü görüntüleme için en az 1,3 yakınlaştırma gereklidir).
4. Zaman aralığını, z-dilim sayısını ve zaman atlamalı görüntüleme süresini deneysel tasarıma ve numune türüne göre optimize edin, böylece görüntünün kalitesinden ödün verilmez ve hücreler hücre döngüsünün belirli aşamalarında tutuklanmaz.
   1. Örnek olarak, erken mikroplarda EGFP etiketli α-tubulin ifade eden Drosophila testislerinin zaman atlamalı görüntülenmesi için parametreler aşağıdaki adımlarda gösterilmiştir.
   2. 5 saatten fazla zaman atlamalı görüntüleme için, %1 lazer gücüyle 10 dakika aralıklarla görüntü alın ve her zaman noktasında 30 z dilime kadar alın.
   3. Mikrotübül dinamikleri gibi son derece dinamik hücresel işlemler için zaman noktaları arasında 2 dakika aralığı ayarlayın, %1 lazer gücünde 1-2 saat hızlandırılmış görüntüleme gerçekleştirin ve her zaman noktasında 30 z dilime kadar alın.
   4. Anafazdan erken telofaz kromatin dinamiklerine (2-3 dakikalık olaylar) gibi nadir hücresel olaylar için, zaman noktaları arasında 1 dakika aralıkla canlı hücre görüntüleme ayarlayın, %1 lazer gücünde 30 dakika zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirin ve her zaman noktasında 30 z dilime kadar alın.
      NOT: Bu parametreler farklı numuneler için farklılık gösterebilir, bu nedenle belirli bir numune için en iyi kullanım için değişiklik yapılması gerekir.
5. Numunenin hassasiyetine ve deneysel tasarıma bağlı olarak zaman atlamalı görüntüleme veya canlı anlık görüntü görüntüleme gerçekleştirin.
   NOT: Kısa bir film 15-30 dakikadır ve uzun bir film 5 saatten fazladır.
6. Örnek çok hassassa ve drosophila erkek GSC'lerde olduğu gibi süper çözünürlüklü bir mikroskopla zaman atlamalı görüntüleme ile çalışılamazsa, farklı hücre döngüsü aşamalarında numunenin süper çözünürlüklü canlı anlık görüntüsünü (SRLS) gerçekleştirin (Şekil 2, Şekil 3, Şekil 4'tegösterildiği gibi).
   1. Nadir bir hücre biyolojik olayı yakalanıyorsa veya ilgi çekici protein düşük ifade düzeyine sahipse, SRLS gerçekleştirin.
   2. SRLS için, ilgilendiğiniz belirli hücre döngüsü aşamasında bir hücre bulun. Örneğin, mikrotübüller-kinetochore bağlamasına odaklanıyorsanız, prometaphaz veya metafazda bir hücre kullanın.
      NOT: Bu, daha uzun bir film sırasında ortaya çıkabilecek floroforların örneğine veya ağartılmasına fototoksiklik riski olmadan, ilgi çekici hücrenin yüksek kaliteli bir görüntüsünü doğru zamanda elde etmenize yardımcı olacaktır.
   3. SRLS kullanıyorsanız, birden çok hücrede farklı hücre döngüsü aşamalarını görüntüleyin ve bu görüntüleri kronolojik sırada düzenleyin.
      NOT: Bu, sinyal ve doku sağlığını en üst düzeye çıkarırken zamansal bir olay sırası oluşturmak, özellikle hassas numuneler veya düşük sinyalli numuneler için olayın mükemmel zamansal çözünürlüğünü elde etmek için kullanılabilir.

5. Canlı hücre görüntülerinin airyscan işlenmesi

1. Görüntüleme yazılımıyla görüntü edindikten sonra, İşleme 'yiseçin, Toplu İş'i tıklatın ve sonra Airyscan İşleme 'yiseçin.
   1. İşlenecek görüntüleri seçin ve ardından süper çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için Çalıştır/İşle'yi tıklatın.
   2. Varsayılan ayarı kullanarak işlemi gerçekleştirin.
      NOT: Airyscan işleme, yalnızca görüntüleme ayarları Airyscan görüntüleme için uygun şekilde kurulduğunda çalışır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Drosophila dokusunda, özellikle GSC'ler için kırınım sınırının ötesinde canlı hücre görüntüleme, hücre döngüsünün ilerlemesi bağlamında hücre altı olayların dinamiklerini araştırma fırsatı sağlar. Son zamanlarda, bu protokolü kullanan bir çalışma, anne centrozomunda ve kız centrozomunda mikrotübül faaliyetlerinin GSCs^10'dazamansal asimetrik olduğunu göstermiştir. Anne merkezkantları mitotik girişe yaklaşık 4 saat kala mikrotübüller yaydırır,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Süper çözünürlüklü mikroskopi yöntemleri 10s nanometre^{4, 5,6}kadar yüksek uzamsal çözünürlük sağlar. STORM ve PALM mikroskopi yöntemleri 20 ila 50 nm (XY çözünürlüğü) çözünürlüğe izin verirken, STED mikroskopisi 20 ila 100 nm (XY çözünürlüğü) çözünürlük sunar. SIM mikroskopinin mekansal çözünürlüğü 100 ila 130 nm¹⁵ile sınırlıdır. Ancak yüksek foton yoğunluğu ve uzu...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A