Imagerie de cellules vivantes à super-résolution de structures subcellulaires

Résumé

Présenté ici est un protocole pour l’imagerie de cellules vivantes de super-résolution dans le tissu intact. Nous avons normalisé les conditions d’imagerie d’une population de cellules souches adultes très sensibles dans son environnement tissulaire natif. Cette technique consiste à équilibrer la résolution temporelle et spatiale pour permettre l’observation directe des phénomènes biologiques dans les tissus vivants.

Résumé

Il y a longtemps eu un compromis crucial entre la résolution spatiale et temporelle en imagerie. L’imagerie au-delà de la limite de diffraction de la lumière a traditionnellement été limitée à être utilisée uniquement sur des échantillons fixes ou des cellules vivantes en dehors des tissus marqués avec un signal fluorescent fort. Les techniques actuelles d’imagerie de cellules vivantes à super-résolution nécessitent l’utilisation de sondes de fluorescence spéciales, un éclairage élevé, des acquisitions d’images multiples avec traitement post-acquisition, ou souvent une combinaison de ces processus. Ces conditions préalables limitent considérablement les échantillons biologiques et les contextes auxquels cette technique peut être appliquée.

Nous décrivons ici une méthode pour effectuer une super-résolution (~ 140 nm XY-résolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. Cette technique est également compatible avec une faible intensité fluorescente, par exemple, EGFP ou mCherry marqué de manière endogène à des gènes faiblement exprimés. Comme preuve de principe, nous avons utilisé cette méthode pour visualiser plusieurs structures subcellulaires chez le testicule de drosophile. Pendant la préparation de tissu, la structure cellulaire et la morphologie de tissu sont maintenues dans le testicule disséqué. Ici, nous utilisons cette technique pour imager la dynamique des microtubules, les interactions entre les microtubules et la membrane nucléaire, ainsi que la fixation des microtubules aux centromères.

Cette technique nécessite des procédures spéciales pour la préparation des échantillons, le montage des échantillons et l’immobilisation des échantillons. De plus, les échantillons doivent être conservés pendant plusieurs heures après la dissection sans compromettre la fonction et l’activité cellulaires. Bien que nous ayons optimisé les conditions d’imagerie en direct à super-résolution spécifiquement dans les cellules souches germinales mâles (GSC) de la drosophile et les cellules germinales progénitrices dans le tissu de testicule disséqué, cette technique est largement applicable à une variété de types de cellules différents. La capacité d’observer les cellules dans leurs conditions physiologiques sans sacrifier la résolution spatiale ou temporelle sera un outil précieux pour les chercheurs qui cherchent à aborder des questions cruciales en biologie cellulaire.

Introduction

La visualisation des structures subcellulaires et de la dynamique des protéines dans les cellules vivantes avec une résolution supérieure à la limite de diffraction de la lumière est généralement très difficile^1-3. Alors que plusieurs techniques de super-résolution telles que la microscopie stochastique-optique-reconstruction-microscopie (STORM), la photo-activité-localisation-microscopie (PALM) et la microscopie à émission stimulée (STED)^4,5,6 ont été développées, les complications dans la préparation des échantillons ainsi que la nécessité de maintenir la viabilité et l’activité ex vivo, limitent l’utilisation de la microscopie à super-résolution conventionnelle pour l’imagerie d’échantillons vivants. La microscopie confocale conventionnelle ne peut pas atteindre une résolution spatiale au-delà de ~230 nm XY-résolution et est souvent insuffisante pour observer des sous-structures cellulaires complexes^5,6. Cependant, un développement récent en microscopie confocale, l’imagerie à super-résolution Airyscan, est capable d’atteindre environ 140 nm (résolution XY)^7,8 et dispose d’une préparation d’échantillon relativement simple compatible avec l’imagerie en direct. Étant donné que ce système de détection d’imagerie nécessite un long temps d’acquisition, sa haute résolution spatiale se fait au détriment de la résolution temporelle^9. Par conséquent, une méthode est nécessaire pour s’assurer que l’imagerie des cellules vivantes est étendue avec une résolution spatiale élevée.

Ici, nous avons développé une méthode pour observer des cellules vivantes dans le tissu intact à sa résolution optimale pour déchiffrer des structures subcellulaires avec des informations spatiales détaillées. Cette méthode est conçue comme telle de manière à ce que les échantillons puissent être montés de manière stable pendant une longue période de temps (~ 10 h) sans bouger ni dégénérer. Les milieux cellulaires vivants utilisés dans cette technique peuvent prendre en charge la fonction cellulaire et éviter le photobleaching jusqu’à 10 heures sous un microscope à super-résolution. Enfin, ce protocole minimise la plupart des stress causés par l’éclairage constant des lasers sur de longues périodes de temps telles que l’hypoxie, les changements d’humidité et de température, ainsi que l’épuisement des nutriments.

En utilisant ce protocole pour imager les cellules souches germinales mâles (CSG) de la drosophile, nous avons pu observer comment l’activité asymétrique des microtubules permet une interaction préférentielle avec des chromatides sœurs épigénétiquement distinctes^10,11,12,13. Ces types d’événements cellulaires sont très dynamiques et sont très difficiles à visualiser dans les cellules vivantes à l’aide d’autres méthodes d’imagerie à super-résolution telles que STORM, PALM ou STED. Nous prévoyons que cette méthode deviendra très utile pour les biologistes cellulaires car ils visent à comprendre les structures subcellulaires dynamiques des cellules vivantes résidant dans les tissus. Il existe de nombreux domaines dans lesquels cette méthode peut être appliquée, tels que l’étude de la dynamique des protéines; comprendre le mouvement des cellules; et le traçage de lignée et les processus de différenciation cellulaire, entre autres applications possibles.

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Protocole

1. Préparation d’un cocktail d’imagerie cellulaire en direct (médias cellulaires en direct)

1. Compléter le milieu de la drosophile de Schneider avec 15% de sérum fœtal bovin (FBS) et 0,6x pénicilline / streptomycine. Ajuster le pH à environ 7,0.
2. Juste avant d’utiliser le milieu, ajouter l’insuline à une concentration finale de 200 μg/mL.
   REMARQUE: Ce milieu est essentiel pour maintenir la division cellulaire normale et le développement du testicule de drosophile pendant l’imagerie time-lapse^10,14.

2. Préparation d’un plat de culture de cellules à fond de verre

1. Utilisez un plat de culture cellulaire à fond de verre enduit de poly L-lysine d’un diamètre de 35 mm pour le testicule de drosophile. Le puits intérieur de la parabole a un fond en verre d’un diamètre de 23 mm et un côté d’une élévation de 1 mm(figure 1A-a).
   REMARQUE: Choisissez une parabole à fond de verre qui permet une distance de travail plus courte, une ouverture numérique plus grande et un objectif de grossissement plus élevé; ces caractéristiques sont cruciales pour obtenir une image de super-résolution.
2. Utilisez une membrane de dialyse (MWCO: 12–14kD) qui permet l’échange gazeux. Couper la membrane en petits morceaux.
   REMARQUE: Les morceaux de membrane doivent être plus petits que la surface vitrée de la parabole, mais assez grands pour couvrir l’échantillon.
3. Faites tremper la membrane avec 100 μL de milieux cellulaires vivants pendant environ 5 min. N’utilisez pas de membrane sèche sur l’échantillon, car cela pourrait l’endommager. La membrane aide à prévenir le stress hypoxique.
4. Préparez 2 à 3 morceaux de verre ou de plastique légers à mettre sur la membrane afin que le tissu ne flotte pas. Pour ce faire, prenez d’abord l’anneau extérieur du tube à centrifugeuse de 50 mL et coupez-le en petits morceaux. Ensuite, stérilisez les morceaux avec 70% d’éthanol avant utilisation.
   REMARQUE: Cette étape garantit que l’échantillon reste à la surface pendant l’imagerie et ne flotte pas, ce qui est crucial pour obtenir des résultats optimaux.
5. Préparez un anneau d’environ 25 mm de diamètre et placez-le sur le côté surélevé du plat. Mettez une lamelle de couverture dessus pour générer deux chambres. La chambre inférieure contiendra l’échantillon tandis que la chambre supérieure servira de chambre d’humidité pour empêcher l’échantillon de sécher.
   1. Pour fabriquer cet anneau, coupez l’anneau extérieur d’un tube à centrifuger de 50 mL, ce qui lui permettra de s’adapter solidement sur le côté surélevé de la parabole de 35 mm. Un anneau similaire peut être fabriqué d’autres manières, par exemple, en utilisant un élastique ou une attache torsadée en plastique pour s’adapter au côté surélevé de la boîte afin de maintenir correctement la lame de couverture sans interférer avec l’échantillon.
      REMARQUE: Cette étape est critique, en particulier pour les échantillons sensibles aux contraintes telles que les conditions hypoxiques et les changements de température et d’humidité.

3. Dissection des testicules des mouches mâles et montage

1. Prenez ~10 jeunes mouches mâles (âgées de 2 à 3 jours) et disséquez les testicules dans les milieux cellulaires vivants pour obtenir environ 10 paires de testicules adultes de drosophile.
   1. Disséquer les mouches sous un microscope de dissection dans une parabole de dissection à l’aide d’une pince fine.
      REMARQUE: La souche Drosophila melanogaster (mouche des fruits) est porteuse du transgène UAS-α-Tubulin-GFP entraîné par un pilote de cellule germinale précoce nanos-Gal4.
   2. Générez les souches knock-in suivantes de Drosophila melanogaster à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9 : Lamin-mCherry (étiquette C-terminale) et CENP-A-Dendra2-CENP-A [étiquette sur le site interne (entre le 118e et le 119e codon)].
      REMARQUE: Bien qu’un seul testicule d’excellente qualité soit nécessaire pour chaque expérience, le montage d’un nombre suffisant de tissus (15 à 20) ou de cellules garantira qu’il y aura au moins un échantillon sain avec d’excellents signaux de fluorescence pour l’imagerie time-lapse.
2. Lavez les testicules deux fois dans un média cellulaire vivant dans la vaisselle de dissection.
   1. Utilisez une pipette pour ajouter un support, puis retirez le support cellulaire en direct comme étape de lavage.
   2. Enlever l’excès de tissu à l’aide d’une pince. Tout tissu supplémentaire interférera avec l’imagerie.
      REMARQUE: N’utilisez pas de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour le lavage, car cela peut affecter la dynamique de certains composants cellulaires.
3. Ajouter 100 à 150 μL de milieux cellulaires vivants dans le plat (préparé à l’étape 2.1) et l’étaler sur la surface vitrée à l’aide d’une pointe de pipette. L’étalement du support sur la surface permettra au tissu de coller correctement au plat.
4. Transférer les testicules dans la parabole à l’aide d’une pince fine et les amener au centre de la parabole(figure 1A-b).
   REMARQUE : Évitez de transférer des débris, car cela interférera avec l’imagerie et pourrait réduire la qualité de l’image.
5. Enlevez l’excès de milieux cellulaires vivants (laissez environ 10 μL de milieux) pour permettre au tissu de s’aplatir et de coller correctement à la parabole. Effectuez cette étape rapidement pour éviter de sécher l’échantillon.
6. Placer la membrane pré-humide (préparée aux étapes 2.2 et 2.3) sur le dessus des testicules(figure 1A-c).
7. Mettez 2 à 3 petits poids plastiques (préparés à l’étape 2.4) sur la membrane afin que l’échantillon ne flotte pas et ajoutez rapidement 100 à 150 μL de milieux cellulaires vivants(Figure 1A-d).
   REMARQUE : L’ajout rapide et en douceur du support garantit que l’échantillon ne se dessèchera pas ou ne sera pas déplacé.
8. Placer l’anneau en plastique (préparé à l’étape 2.5) sur le côté surélevé de la parabole(figure 1B-a).
9. Placer une lamelle de couverture de 22 mm x 22 mm sur le dessus de l’anneau(Figure 1B-b). Cela génère deux chambres.
10. Prenez un morceau de papier de soie, humidifiez-le avec de l’eau, puis faites-le tourbillonner et mettez-le sur la lame de couverture, pour créer une chambre humide(Figure 1B-c). Fermez le couvercle de la parabole(figure 1B-d)et commencez l’imagerie des cellules vivantes.
    REMARQUE : Si l’échantillon est sensible à la lumière, effectuez la section 3 dans l’obscurité.

4. Imagerie par cellules vivantes de cellules souches germinales mâles (CGC) de drosophile in situ

1. Placez le plat sous le microscope à super-résolution et fixez-le avec les pinces de l’étage.
   1. Ouvrez le logiciel d’imagerie, allumez la lumière transmise et utilisez un objectif 63x pour vous concentrer sur le tissu du testicule avec le bouton de mise au point.
      Remarque : S’il existe une difficulté dans la localisation d’un échantillon avec l’objectif 63x, puis d’abord utiliser l’objectif 40x ou 20x avant de passer à la 63x.
   2. Allumez les lasers, cliquez sur Live, et trouvez le GSC avec la position et l’état optimaux. Évitez les testicules qui ont un signal de faible fluorescence ou qui ont le moyeu (niche) loin de la surface.
      REMARQUE : Chez les testicules de drosophile, les CSN sont fixés au moyeu.
2. Ajustez la mise au point pour les GSCs et identifiez les paramètres appropriés pour l’échantillon, y compris la puissance laser, le gain de multiplication d’électrons (EM), la moyenne et le zoom pour le mode Airyscan. Utilisez les paramètres suivants comme exemple pour les testicules de drosophile exprimant l’EGFP marqué α-tubuline dans les cellules germinales à un stade précoce.
   1. Définissez la taille d’image entre 512 x 512 pixels et 1024 x 1024 pixels en cliquant sur Taille d’image.
   2. Définissez la moyenne de l’image sur 1 ou 2 en cliquant sur Moyenne.
      Remarque : l’augmentation de la taille du cadre (>1024 x 1024 pixels) et l’exécution d’une plus grande moyenne (c’est-à-dire plus de 2) peuvent entraîner un photobleaching ou une phototoxicité.
   3. Réglez la puissance laser sur 1% –2% en cliquant sur Lasers.
      REMARQUE: L’augmentation de la puissance laser peut également conduire à un photobleaching ou à une phototoxicité.
   4. Réglez le gain EM en dessous du niveau recommandé (< 800) en cliquant sur Master Gain.
      Remarque : un gain em plus élevé peut générer des artefacts.
   5. Effectuez un zoom avant sur la région ou la cellule d’intérêt pour réduire le temps d’acquisition de l’image et le photobleaching. Cela permet également au spécimen de survivre plus longtemps.
3. Démarrez la capture d’image time-lapse à l’aide du mode Airyscan en cliquant sur Démarrer l’expérience.
   1. Avant de cliquer sur Démarrer l’expérience, assurez-vous que l’acquisition est configurée de manière optimale.
   2. S’il affiche un avertissement avec l’avis « L’acquisition Airyscan n’est pas configurée de manière optimale », cliquez sur Optimal dans la section taille de trame, cliquez sur Optimal dans la section z-stack et cliquez sur Optimal pour la section zone de balayage (un zoom minimum de 1,3 est requis pour l’imagerie super-résolution).
4. Optimiser l’intervalle de temps, le nombre de tranches z et la durée de l’imagerie time-lapse en fonction de la conception expérimentale et du type d’échantillon, afin que la qualité de l’image ne soit pas compromise et que les cellules ne soient pas arrêtées à des étapes particulières du cycle cellulaire.
   1. À titre d’exemple, les paramètres de l’imagerie en accéléré des testicules de drosophile exprimant la α-tubuline marqués par EGFP dans la lignée germinale précoce sont présentés dans les étapes suivantes.
   2. Pour plus de 5 h d’imagerie time-lapse, imagez à un intervalle de 10 minutes avec une puissance laser de 1% et prenez jusqu’à 30 tranches z à chaque point de temps.
   3. Pour les processus cellulaires hautement dynamiques, tels que la dynamique des microtubules, définissez un intervalle de 2 minutes entre les points de temps, effectuez une imagerie time-lapse de 1 à 2 h à 1% de puissance laser et prenez jusqu’à 30 tranches z à chaque point de temps.
   4. Pour les événements cellulaires rares, tels que la dynamique de la chromatine de l’anaphase au début de la télophase (événements de 2 à 3 minutes), définissez l’imagerie des cellules vivantes avec un intervalle de 1 min entre les points de temps, effectuez une imagerie time-lapse de 30 minutes à une puissance laser de 1% et prenez jusqu’à 30 tranches z à chaque point de temps.
      REMARQUE: Ces paramètres peuvent varier pour différents échantillons, donc une modification sera nécessaire pour une utilisation optimale de l’échantillon spécifique.
5. Effectuez une imagerie time-lapse ou une imagerie instantanée en direct, en fonction de la sensibilité de l’échantillon et du plan expérimental.
   REMARQUE: Un court métrage est de 15 à 30 minutes, et un long film dure plus de 5 h.
6. Si l’échantillon est très sensible et ne peut pas être étudié par imagerie time-lapse avec un microscope à super-résolution, comme c’est souvent le cas avec les CSL mâles drosophiles, effectuer un instantané en direct de super-résolution (SRLS) de l’échantillon à différents stades du cycle cellulaire (comme le montre la figure 2, figure 3, figure 4).
   1. Si un événement biologique de cellules rares est capturé ou si la protéine d’intérêt a un faible niveau d’expression, alors exécutez SRLS.
   2. Pour SRLS, recherchez une cellule à l’étape spécifique du cycle cellulaire qui vous intéresse. Par exemple, si vous vous concentrez sur la liaison microtubules-kinetochore, utilisez une cellule à la prométhaphase ou à la métaphase.
      REMARQUE: Cela vous aidera à obtenir une image de haute qualité de la cellule d’intérêt au bon moment sans risquer de phototoxicité pour l’échantillon ou le blanchiment des fluorophores, ce qui peut se produire pendant un film plus long.
   3. Si vous utilisez SRLS, imagez différentes étapes du cycle cellulaire d’intérêt sur plusieurs cellules et organisez ces images dans l’ordre chronologique.
      REMARQUE: Cela peut être utilisé pour construire un ordre temporel des événements tout en maximisant le signal et la santé des tissus, afin d’obtenir une excellente résolution temporelle de l’événement pour les échantillons particulièrement sensibles ou les échantillons avec un signal faible.

5. Traitement Airyscan des images de cellules vivantes

1. Après l’acquisition de l’image avec le logiciel d’imagerie, sélectionnez Traitement, cliquez sur Lot, puis sélectionnez Traitement Airyscan.
   1. Sélectionnez les images à traiter, puis cliquez sur Exécuter/Traiter pour obtenir les images de super résolution.
   2. Effectuez le traitement à l’aide du paramètre par défaut.
      REMARQUE : le traitement Airyscan ne fonctionnera que si les paramètres d’imagerie sont correctement établis pour l’imagerie Airyscan.

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Résultats

L’imagerie des cellules vivantes au-delà de la limite de diffraction dans le tissu drosophile, en particulier pour les GSC, offre l’occasion d’étudier la dynamique des événements subcellulaires dans le contexte de la progression du cycle cellulaire. Récemment, une étude utilisant ce protocole a prouvé que les activités de microtubule au centrosome mère contre le centrosome de fille sont temporellement asymétriques dans les GSCs^10. Le centrosome de mère émane des microtub...

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Discussion

Les méthodes de microscopie à super-résolution fournissent une résolution spatiale aussi élevée que 10s de nanomètres^4,5,6. Les méthodes de microscopie STORM et PALM permettent une résolution allant jusqu’à 20 à 50 nm (résolution XY), tandis que la microscopie STED offre une résolution de 20 à 100 nm (résolution XY). La résolution spatiale de la microscopie SIM est limitée à 100 à 130 nm^15. Cepend...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A