Imaging di cellule vive super-risoluzione di strutture subcellulari

Riepilogo

Presentato qui è un protocollo per l'imaging a cellule vive a super-risoluzione nel tessuto intatto. Abbiamo standardizzato le condizioni per l'imaging di una popolazione di cellule staminali adulte altamente sensibile nel suo ambiente di tessuti nativi. Questa tecnica prevede il bilanciamento della risoluzione temporale e spaziale per consentire l'osservazione diretta dei fenomeni biologici nei tessuti vivi.

Abstract

Da tempo c'è stato un compromesso cruciale tra risoluzione spaziale e temporale nell'imaging. L'imaging oltre il limite di diffrazione della luce è stato tradizionalmente limitato per essere utilizzato solo su campioni fissi o cellule vive al di fuori del tessuto etichettate con un forte segnale fluorescente. Le attuali tecniche di imaging a celle vive a super-risoluzione richiedono l'uso di speciali sonde a fluorescenza, alta illuminazione, acquisizioni di immagini multiple con elaborazione post-acquisizione o spesso una combinazione di questi processi. Questi prerequisiti limitano significativamente i campioni biologici e i contesti a cui questa tecnica può essere applicata.

Qui descriviamo un metodo per eseguire l'imaging a celle vive a fluorescenza a super risoluzione (~140 nm XY-resolution) in situ. Questa tecnica è anche compatibile con la bassa intensità fluorescente, ad esempio, EGFP o mCherry etichettati endogenamente con geni a bassa espressa. Come prova di principio, abbiamo usato questo metodo per visualizzare più strutture subcellulari nel testicolo drosofila. Durante la preparazione dei tessuti, sia la struttura cellulare che la morfologia dei tessuti vengono mantenute all'interno del testicolo sezionato. Qui, usiamo questa tecnica per immaginiamo la dinamica dei microtubuli, le interazioni tra i microtubuli e la membrana nucleare, così come l'attacco dei microtubuli ai centromeri.

Questa tecnica richiede procedure speciali nella preparazione del campione, nel montaggio del campione e nell'immobilizzazione dei campioni. Inoltre, i campioni devono essere mantenuti per diverse ore dopo la dissezione senza compromettere la funzione e l'attività cellulare. Mentre abbiamo ottimizzato le condizioni per l'imaging vivo a super risoluzione specificamente nelle cellule staminali germinali maschili drosophila (GSC) e nelle cellule germinali progenitrici nel tessuto testicolo sezionato, questa tecnica è ampiamente applicabile a una varietà di diversi tipi di cellule. La capacità di osservare le cellule nelle loro condizioni fisiologiche senza sacrificare la risoluzione spaziale o temporale servirà come strumento inestimabile per i ricercatori che cercano di affrontare questioni cruciali nella biologia cellulare.

Introduzione

Visualizzare le strutture subcellulari e la dinamica proteica nelle cellule vive con risoluzione oltre il limite di diffrazione della luce è in genere molto^{impegnativo 1-3}. Mentre sono state sviluppate molteplici tecniche di super-risoluzione come Stochastic-Optical-Reconstruction-Microscopy (STORM), Photo-Activated-Localization-Microscopy (PALM) e Stimulated-Emission-Depletion (STED)^4,5,6 microscopia, complicazioni nella preparazione del campione e la necessità di mantenere la vitalità e l'attività ex vivo, limitare l'uso della microscopia a super-risoluzione convenzionale per l'imaging di campioni vivi. La microscopia confocale convenzionale non può raggiungere una risoluzione spaziale oltre ~ 230 nm di risoluzione XY ed è spesso insufficiente per osservare intricate sottostrutture cellulari^5,6. Tuttavia, un recente sviluppo nella microscopia confocale, airyscan super-resolution imaging, è in grado di raggiungere circa 140 nm (risoluzione XY)^{7,8 e} ha una preparazione del campione relativamente semplice compatibile con l'imaging dal vivo. Poiché questo sistema di rilevamento delle immagini richiede un lungo tempo di acquisizione, la sua elevata risoluzione spaziale ha un costo di risoluzione^{temporale 9}. Pertanto, è necessario un metodo per garantire che l'imaging delle cellule vive sia esteso con un'alta risoluzione spaziale.

Qui, abbiamo sviluppato un metodo per osservare le cellule vive nel tessuto intatto alla sua risoluzione ottimale per decifrare le strutture subcellulari con informazioni spaziali dettagliate. Questo metodo è progettato come tale in modo che i campioni possano essere montati stabilmente per un lungo periodo di tempo (~ 10 h) senza muoversi o degenerare. Il supporto cellulare vivo utilizzato in questa tecnica può supportare la funzione cellulare ed evitare il fotobleaching per un massimo di 10 ore sotto un microscopio a super risoluzione. Infine, questo protocollo riduce al minimo la maggior parte delle sollecitazioni causate dalla costante illuminazione dei laser per lunghi periodi di tempo come ipossia, cambiamenti di umidità e temperatura, nonché esaurimento dei nutrienti.

Utilizzando questo protocollo per l'immagine delle cellule staminali germinali maschili Drosophila (GSC), siamo stati in grado di osservare come l'attività asimmetrica dei microtubuli consenta un'interazione preferenziale con cromatidi sorelle epigeneticamente^{distinte 10,11,12,13}. Questi tipi di eventi cellulari sono altamente dinamici e sono molto difficili da visualizzare nelle cellule vive utilizzando altri metodi di imaging a super risoluzione come STORM, PALM o STED. Prevediamo che questo metodo diventerà molto utile per i biologi cellulari in quanto mirano a comprendere le strutture subcellulari dinamiche delle cellule vive residenti nei tessuti. Ci sono molte aree in cui questo metodo può essere applicato, come lo studio della dinamica delle proteine; comprendere il movimento delle cellule; e processi di tracciamento del lignaggio e differenziazione cellulare, tra le altre possibili applicazioni.

Protocollo

1. Preparazione di cocktail di imaging cellulare vivo (media cellulari vivi)

1. Integrare il mezzo Drosophila di Schneider con il 15% di siero bovino fetale (FBS) e 0,6x penicillina/streptomicina. Regolare il pH a circa 7,0.
2. Poco prima di utilizzare il mezzo, aggiungere insulina a una concentrazione finale di 200 μg/mL.
   NOTA: Questo supporto è fondamentale per mantenere la normale divisione cellulare e lo sviluppo del testicolo drosophila durante l'imaging time-lapse^10,14.

2. Preparazione del piatto di coltura della cella inferiore in vetro

1. Utilizzare un piatto di coltura cellulare con fondo di vetro rivestito in poli L-lisina con un diametro di 35 mm per il testicolo Drosophila. Il pozzo interno del piatto ha un fondo di vetro con un diametro di 23 mm e un lato con un'elevazione di 1 mm(Figura 1A-a).
   NOTA: scegli un piatto con fondo di vetro che consenta una distanza di lavoro più breve, un'apertura numerica più ampia e un obiettivo di ingrandimento più elevato; queste funzionalità sono fondamentali per ottenere un'immagine a super risoluzione.
2. Utilizzare una membrana di dialisi (MWCO: 12-14kD) che consenta lo scambio gassoso. Tagliare la membrana a piccoli pezzi.
   NOTA: I pezzi di membrana devono essere più piccoli dell'area di vetro del piatto ma abbastanza grandi da coprire l'esemplare.
3. Immergere la membrana con 100 μL di supporti cellulari vivi per ~ 5 minuti. Non utilizzare una membrana secca sul campione, in quanto potrebbe danneggiarlo. La membrana aiuta a prevenire lo stress ipossia.
4. Preparare 2-3 pezzi leggeri di vetro o plastica da mettere sulla membrana in modo che il tessuto non galleggi. Per fare questo, prima prendi l'anello esterno del tubo di centrifuga da 50 ml e taglialo a piccoli pezzi. Quindi, sterilizzare i pezzi con il 70% di etanolo prima dell'uso.
   NOTA: Questo passaggio assicura che il campione rimanga sulla superficie durante l'imaging e non galleggi, il che è fondamentale per ottenere risultati ottimali.
5. Preparare un anello di ~ 25 mm di diametro e posizionarlo sul lato elevato del piatto. Mettici un copripata per generare due camere. La camera inferiore conterrà il campione mentre la camera superiore fungerà da camera di umidità per impedire l'essiccazione del campione.
   1. Per realizzare questo anello, tagliare l'anello esterno da un tubo di centrifuga da 50 ml, che gli permetterà di adattarsi saldamente sul lato sopraelevato del piatto da 35 mm. Un anello simile può essere realizzato in altri modi, ad esempio utilizzando un elastico o una cravatta di torsione in plastica per adattarsi al lato elevato del piatto per tenere correttamente il copripata senza interferire con il campione.
      NOTA: Questo passaggio è fondamentale, specialmente per campioni sensibili a sollecitazioni come condizioni ipossiche e variazioni di temperatura e umidità.

3. Dissezione dei tester dalle mosche maschili e montaggio

1. Prendi ~10 giovani mosche maschili (2-3 giorni) e seziona i teste nel supporto cellulare vivo per ottenere ~ 10 paia di teste adulte Drosophila.
   1. Sezionare le mosche al microscopio a dissezione in un piatto di dissezione usando forcep fini.
      NOTA: Il ceppo Drosophila melanogaster (mosca della frutta) trasporta il transgene UAS-α-Tubulin-GFP guidato da un nanos-Gal4, primo driver di cellule germinali.
   2. Genera i seguenti ceppi di drosophila melanogaster knock-in utilizzando la tecnologia CRISPR-Cas9: Lamin-mCherry (tag C-terminale) e CENP-A-Dendra2-CENP-A [tag nel sito interno (tra il 118 ° - 119 ° codone)].
      NOTA: Mentre per ogni esperimento è necessario un solo testicolo di eccellente qualità, il montaggio di un numero sufficiente di tessuti (15-20) o cellule garantirà che ci sia almeno un campione sano con eccellenti segnali di fluorescenza per l'imaging time-lapse.
2. Lavare i tester due volte in mezzi cellulari vivi nella piastra di dissezione.
   1. Utilizzare una pipetta per aggiungere un supporto seguito rimuovendo il supporto della cella viva come passaggio di lavaggio.
   2. Rimuovere il tessuto in eccesso usando le forcelle. Qualsiasi tessuto extra interferirà con l'imaging.
      NOTA: Non utilizzare salina tamponata da fosfati (PBS) per il lavaggio, perché può influenzare la dinamica di alcuni componenti cellulari.
3. Aggiungere 100-150 μL di supporti cellulari vivi nel piatto (preparato nel passaggio 2.1) e stenderlo sulla superficie del vetro usando una punta di pipetta. La diffusione del supporto sulla superficie consentirà al tessuto di attaccarsi correttamente al piatto.
4. Trasferire i tester sul piatto utilizzando forcep fini e portarli al centro del piatto(Figura 1A-b).
   NOTA: Evitare il trasferimento dei detriti perché interferisce con l'imaging e potrebbe ridurre la qualità dell'immagine.
5. Rimuovere i mezzi cellulari vivi in eccesso (lasciare circa 10 μL di supporto) per consentire al tessuto di appiattirsi e attaccarsi correttamente al piatto. Eseguire rapidamente questo passaggio per evitare di asciugare il campione.
6. Posizionare la membrana pre-bagnata (preparata nei primi step 2.2 e 2.3) sopra i tester(figura 1A-c).
7. Mettere 2-3 piccoli pesi plastici (preparati nel passaggio 2.4) sulla membrana in modo che il campione non galleggi e aggiungere rapidamente 100-150 μL di supporti cellulari vivi (Figura 1A-d).
   NOTA: L'aggiunta rapida e delicata di supporti garantisce che il campione non si asciughi o si sposti.
8. Posizionare l'anello di plastica (preparato al punto 2.5) sul lato sopraelevato del piatto(Figura 1B-a).
9. Posizionare un coverslip da 22 mm x 22 mm sopra l'anello (Figura 1B-b). Questo genera due camere.
10. Prendi un pezzo di carta velina, inumidilo con acqua, quindi giralo e mettilo sul copriletto, per creare una camera umida(Figura 1B-c). Chiudere il coperchio del piatto ( Figura1B-d) e iniziare l'imaging delle cellule vive.
    NOTA: Se il campione è sensibile alla luce, eseguire la sezione 3 al buio.

4. Imaging a cellule vive delle cellule staminali germinali maschili drosophila (SGC) in situ

1. Posizionare il piatto al microscopio a super risoluzione e fissarlo con i morsetti del palco.
   1. Aprire il software di imaging, accendere la luce trasmessa e utilizzare l'obiettivo 63x per concentrarsi sul tessuto testicolo con la manopola di messa a fuoco.
      NOTA: Se c'è una difficoltà nell'individuare un campione con l'obiettivo 63x, utilizzare prima l'obiettivo 40x o 20x prima di passare al 63x.
   2. Accendere i laser, fare clic su Livee trovare l'SGC con la posizione e le condizioni ottimali. Evitare teste che hanno un segnale a bassa fluorescenza o hanno il mozzo (nicchia) lontano dalla superficie.
      NOTA: Nei tester Drosophila, i GSC sono collegati all'hub.
2. Regola lo stato attivo per i GSC e identifica le impostazioni giuste per il campione, tra cui potenza laser, guadagno di moltiplicazione elettronica (EM), media e zoom per la modalità Airyscan. Utilizzare le seguenti impostazioni come esempio per i tester Drosophila che esprimono EGFP taggato α-tubulina nelle cellule germinali in fase iniziale.
   1. Impostare la dimensione del fotogramma tra 512 x 512 pixel e 1024 x 1024 pixel facendo clic su Dimensioni fotogramma.
   2. Impostare la media fotogramma su 1 o 2 facendo clic su Media.
      NOTA: L'aumento delle dimensioni del fotogramma (>1024 x 1024 pixel) e l'esecuzione di una media maggiore (ad esempio, più di 2) potrebbero causare fotobleaching o fototossicità.
   3. Impostare la potenza del laser sull'1%-2% facendo clic su Laser .
      NOTA: L'aumento della potenza del laser può anche portare al fotoligione o alla fototossicità.
   4. Impostare il guadagno em al di sotto del livello consigliato (< 800) facendo clic su Guadagno master.
      NOTA: un guadagno EM più elevato può generare artefatti.
   5. Ingrandisci l'area o la cella di interesse per ridurre i tempi di acquisizione dell'immagine e ridurre il fotobleaching. Questo permette anche all'esemplare di sopravvivere più a lungo.
3. Avviare l'acquisizione dell'immagine time-lapse utilizzando la modalità Airyscan facendo clic su Avvia esperimento.
   1. Prima di fare clic su Avviaesperimento , assicurarsi che l'acquisizione sia configurata in modo ottimale.
   2. Se viene visualizzato un avviso con l'avviso "L'acquisizione di Airyscan non è configurata in modo ottimale", fare clic su Ottimale nella sezione dimensioni fotogramma, su Ottimale nella sezione z-stack e quindi su Ottimale per la sezione area di scansione (è necessario un minimo di zoom 1.3 per l'imaging a super risoluzione).
4. Ottimizzare l'intervallo di tempo, il numero di z-slice e la durata dell'imaging time-lapse in base al progetto sperimentale e al tipo di campione, in modo che la qualità dell'immagine non venga compromessa e le celle non verranno arrestate in particolari fasi del ciclo cellulare.
   1. Ad esempio, i parametri per l'imaging time-lapse dei tester Drosophila che esprimono α-tubulina taggata da EGFP nella linea germinale precoce sono mostrati nei seguenti passaggi.
   2. Per più di 5 ore di imaging time-lapse, immagine a un intervallo di 10 minuti con 1% di potenza laser e prendere fino a 30 z-slice in ogni punto di tempo.
   3. Per processi cellulari altamente dinamici, come la dinamica dei microtubuli, impostare un intervallo di 2 minuti tra i punti di tempo, eseguire l'imaging time-lapse di 1-2 ore con una potenza laser dell'1% e assumere fino a 30 z-slice in ogni punto di tempo.
   4. Per eventi cellulari rari, come l'anafase alla dinamica della cromatina telofane precoce (eventi da 2 a 3 minuti), impostare l'imaging delle cellule vive con un intervallo di 1 minuto tra i punti di tempo, eseguire immagini time-lapse di 30 minuti con una potenza laser dell'1% e prendere fino a 30 z-slice in ogni momento.
      NOTA: Questi parametri possono variare per diversi campioni, quindi sarà necessaria un'alterazione per un uso ottimale per il campione specifico.
5. Eseguire immagini time-lapse o immagini snapshot dal vivo, a seconda della sensibilità del campione e del progetto sperimentale.
   NOTA: un cortometraggio è di 15-30 minuti e un lungo film è più di 5 ore.
6. Se il campione è molto sensibile e non può essere studiato mediante imaging time-lapse con un microscopio a super risoluzione, come spesso accade con i GSC maschi Drosophila, eseguire un'istantanea dal vivo a super risoluzione (SRLS) del campione in diverse fasi del ciclo cellulare (come mostrato nella figura 2, Figura 3, Figura 4).
   1. Se viene catturato un evento biologico cellulare raro o la proteina di interesse ha un basso livello di espressione, eseguire SRLS.
   2. Per SRLS, trova una cella nella specifica fase del ciclo cellulare che ti interessa. Ad esempio, se ci si concentra sul legame microtubuli-cinetocore, utilizzare una cellula in prometafase o metafase.
      NOTA: Questo ti aiuterà a ottenere un'immagine di alta qualità della cella di interesse al momento giusto senza rischiare la fototossicità del campione o lo sbiancamento dei fluorofori, che può verificarsi durante un film più lungo.
   3. Se si utilizza SRLS, immagini diverse fasi del ciclo cellulare di interesse su più celle e disporre queste immagini in ordine cronologico.
      NOTA: Questo può essere utilizzato per costruire un ordine temporale di eventi massimizzando al contempo la salute del segnale e dei tessuti, per ottenere un'eccellente risoluzione temporale dell'evento per campioni particolarmente sensibili o campioni con segnale basso.

5. Elaborazione Airyscan delle immagini delle celle live

1. Dopo l'acquisizione dell'immagine con il software di imaging, selezionare Elaborazione, Batche quindi Elaborazione Airyscan.
   1. Selezionare le immagini da elaborare e quindi fare clic su Esegui/Elabora per ottenere le immagini a super risoluzione.
   2. Eseguire l'elaborazione utilizzando l'impostazione predefinita.
      NOTA: l'elaborazione Airyscan funzionerà solo se le impostazioni di imaging sono correttamente stabilite per l'imaging Airyscan.

Risultati

L'imaging cellulare vivo oltre il limite di diffrazione nel tessuto Drosophila, specialmente per i GSC, offre l'opportunità di indagare la dinamica degli eventi subcellulari nel contesto della progressione del ciclo cellulare. Recentemente, uno studio che utilizza questo protocollo ha dimostrato che le attività dei microtubuli al centrosoma madre rispetto al centrosoma della figlia sono temporaneamente asimmetriche nei GSC¹⁰. Il centrosoma madre emana microtubuli circa 4 ore prima dell'...

Discussione

I metodi di microscopia a super risoluzione forniscono una risoluzione spaziale fino a 10 di nanometri^4,5,6. I metodi di microscopia STORM e PALM consentono una risoluzione fino a 20-50 nm (risoluzione XY), mentre la microscopia STED offre una risoluzione da 20 a 100 nm (risoluzione XY). La risoluzione spaziale della microscopia SIM è limitata a 100-130 nm¹⁵. Tuttavia, a causa della sua alta densità di fotoni e del ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A