Hochauflösende Live-Cell-Bildgebung subzellulärer Strukturen

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll für die hochauflösende Bildgebung von Lebendzellen in intaktem Gewebe vorgestellt. Wir haben die Bedingungen für die Abbildung einer hochempfindlichen adulten Stammzellpopulation in ihrer nativen Gewebeumgebung standardisiert. Diese Technik beinhaltet das Ausbalancieren der zeitlichen und räumlichen Auflösung, um die direkte Beobachtung biologischer Phänomene in lebendem Gewebe zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Es gibt seit langem einen entscheidenden Kompromiss zwischen räumlicher und zeitlicher Auflösung in der Bildgebung. Die Bildgebung über die Beugungsgrenze des Lichts hinaus wurde traditionell nur an festen Proben oder lebenden Zellen außerhalb von Geweben verwendet, die mit einem starken fluoreszierenden Signal markiert sind. Aktuelle hochauflösende Live-Cell-Imaging-Verfahren erfordern den Einsatz spezieller Fluoreszenzsonden, eine hohe Beleuchtung, mehrere Bildaufnahmen mit Nachbearbeitung oder oft eine Kombination dieser Prozesse. Diese Voraussetzungen schränken die biologischen Proben und Kontexte, auf die diese Technik angewendet werden kann, erheblich ein.

Hier beschreiben wir eine Methode, um superauflösende (~140 nm XY-Auflösung) Zeitraffer-Fluoreszenz-Live-Cell-Bildgebung in situ durchzuführen. Diese Technik ist auch mit niedriger Fluoreszenzintensität kompatibel, z. B. EGFP oder mCherry endogen markiert an niedrig exprimierten Genen. Als Proof-of-Principle haben wir diese Methode verwendet, um mehrere subzelluläre Strukturen im Drosophila-Hoden zu visualisieren. Während der Gewebevorbereitung bleiben sowohl die Zellstruktur als auch die Gewebemorphologie innerhalb des sezierten Hodens erhalten. Hier verwenden wir diese Technik, um die Dynamik von Mikrotubuli, die Wechselwirkungen zwischen Mikrotubuli und der Kernmembran sowie die Befestigung von Mikrotubuli an Zentromeren abbilden.

Diese Technik erfordert spezielle Verfahren bei der Probenvorbereitung, Probenmontage und Immobilisierung von Proben. Darüber hinaus müssen die Proben nach der Dissektion mehrere Stunden lang gehalten werden, ohne die Zellfunktion und -aktivität zu beeinträchtigen. Während wir die Bedingungen für die hochauflösende Live-Bildgebung speziell in Drosophila männlichen Keimbahnstammzellen (GSCs) und Vorläuferkeimzellen in seziertem Hodengewebe optimiert haben, ist diese Technik auf eine Vielzahl verschiedener Zelltypen anwendbar. Die Fähigkeit, Zellen unter ihren physiologischen Bedingungen zu beobachten, ohne die räumliche oder zeitliche Auflösung zu beeinträchtigen, wird als unschätzbares Werkzeug für Forscher dienen, die entscheidende Fragen der Zellbiologie angehen wollen.

Einleitung

Die Visualisierung subzellulärer Strukturen und Proteindynamiken in lebenden Zellen mit einer Auflösung jenseits der Beugungsgrenze des Lichts ist typischerweise sehr herausfordernd^1-3. Während mehrere superauflösende Techniken wie Stochastic-Optical-Reconstruction-Microscopy (STORM), Photo-Activated-Localization-Microscopy (PALM) und Stimulated-Emission-Depletion (STED)^4,5^{,6Mikroskopie} entwickelt wurden, schränken Komplikationen bei der Probenvorbereitung sowie die Notwendigkeit, die Lebensfähigkeit und Aktivität ex vivo aufrechtzuerhalten, die Verwendung herkömmlicher hochauflösender Mikroskopie für die Bildgebung lebender Proben ein. Die konventionelle konfokale Mikroskopie kann keine räumliche Auflösung über ~230 nm XY-Auflösung hinaus erreichen und reicht oft nicht aus, um komplizierte zelluläre Unterstrukturen zu beobachten^5,6. Eine neuere Entwicklung in der konfokalen Mikroskopie, die hochauflösende Airyscan-Bildgebung, ist jedoch in der Lage, etwa 140 nm (XY-Auflösung)^7,8 zu erreichen und verfügt über eine relativ einfache Probenvorbereitung, die mit live-Bildgebung kompatibel ist. Da dieses bildgebende Detektionssystem eine lange Erfassungszeit benötigt, geht seine hohe räumliche Auflösung auf Kosten der zeitlichen Auflösung^9. Daher wird eine Methode benötigt, um sicherzustellen, dass die Bildgebung lebender Zellen mit hoher räumlicher Auflösung erweitert wird.

Hier haben wir eine Methode entwickelt, um lebende Zellen in intaktem Gewebe in ihrer optimalen Auflösung zu beobachten, um subzelluläre Strukturen mit detaillierten räumlichen Informationen zu entschlüsseln. Dieses Verfahren ist so konzipiert, dass Proben über einen langen Zeitraum (~ 10 h) stabil montiert werden können, ohne sich zu bewegen oder zu degenerieren. Die bei dieser Technik verwendeten lebenden Zellmedien können die Zellfunktion unterstützen und Photobleaching für bis zu 10 Stunden unter einem hochauflösenden Mikroskop vermeiden. Schließlich minimiert dieses Protokoll die meisten Belastungen, die durch die ständige Beleuchtung von Lasern über längere Zeiträume verursacht werden, wie Hypoxie, Feuchtigkeits- und Temperaturänderungen sowie Nährstofferschöpfung.

Mit diesem Protokoll zur Abbildung von Drosophila männlichen Keimbahnstammzellen (GSCs) konnten wir beobachten, wie die asymmetrische Aktivität von Mikrotubuli eine bevorzugte Interaktion mit epigenetisch unterschiedlichen Schwesterchromatiden ermöglicht^10,11,12,13. Diese Art von zellulären Ereignissen sind hochdynamisch und in lebenden Zellen mit anderen hochauflösenden Bildgebungsmethoden wie STORM, PALM oder STED sehr schwer zu visualisieren. Wir gehen davon aus, dass diese Methode für Zellbiologen sehr nützlich sein wird, da sie darauf abzielen, die dynamischen subzellulären Strukturen lebender Zellen in Geweben zu verstehen. Es gibt viele Bereiche, in denen diese Methode angewendet werden kann, wie z.B. die Untersuchung der Dynamik von Proteinen; Verständnis der Bewegung von Zellen; und Lineage Tracing und zelluläre Differenzierungsprozesse, unter anderen möglichen Anwendungen.

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Protokoll

1. Herstellung eines Lebendzell-Bildgebungscocktails (Lebende Zellmedien)

1. Ergänzen Sie Schneiders Drosophila Medium mit 15% fetalem Rinderserum (FBS) und 0,6x Penicillin / Streptomycin. Stellen Sie den pH-Wert auf ca. 7,0 ein.
2. Kurz vor der Verwendung des Mediums Insulin zu einer Endkonzentration von 200 μg/ml hinzufügen.
   HINWEIS: Dieses Medium ist entscheidend für die Aufrechterhaltung der normalen Zellteilung und Entwicklung des Drosophila-Hodens während der Zeitrafferbildgebung^10,14.

2. Zubereitung der Glasbodenzellkulturschale

1. Verwenden Sie eine poly-L-Lysin-beschichtete Glasboden-Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 35 mm für den Drosophila-Hoden. Der innere Brunnen der Schüssel hat einen Glasboden mit einem Durchmesser von 23 mm und eine Seite mit einer Höhe von 1 mm (Abbildung 1A-a).
   HINWEIS: Wählen Sie eine Glasbodenschale, die einen kürzeren Arbeitsabstand, eine größere numerische Apertur und ein höheres Vergrößerungsobjektiv ermöglicht. Diese Eigenschaften sind entscheidend, um ein Bild mit superauflöserer Auflösung zu erhalten.
2. Verwenden Sie eine Dialysemembran (MWCO: 12–14kD), die den Gasaustausch ermöglicht. Schneiden Sie die Membran in kleine Stücke.
   HINWEIS: Die Membranstücke sollten kleiner als die Glasfläche der Schüssel sein, aber groß genug, um die Probe zu bedecken.
3. Die Membran mit 100 μL Lebendzellmedien für ~5 min einweichen. Verwenden Sie keine trockene Membran auf der Probe, da sie dadurch beschädigt werden kann. Membran hilft, hypoxischen Stress zu verhindern.
4. Bereiten Sie 2-3 leichte Glas- oder Kunststoffstücke vor, die auf die Membran gelegt werden, damit das Gewebe nicht schwimmt. Nehmen Sie dazu zuerst den Außenring des 50 mL Zentrifugenrohrs und schneiden Sie ihn in kleine Stücke. Dann sterilisieren Sie die Stücke vor dem Gebrauch mit 70% Ethanol.
   HINWEIS: Dieser Schritt stellt sicher, dass die Probe während der Bildgebung auf der Oberfläche bleibt und nicht schwimmt, was für optimale Ergebnisse entscheidend ist.
5. Bereiten Sie einen Ring mit einem Durchmesser von ~ 25 mm vor und legen Sie ihn an die erhöhte Seite der Schüssel. Legen Sie einen Coverlip darauf, um zwei Kammern zu erzeugen. Die untere Kammer enthält die Probe, während die obere Kammer als Feuchtigkeitskammer dient, um das Austrocknen der Probe zu verhindern.
   1. Um diesen Ring herzustellen, schneiden Sie den äußeren Ring von einem 50-ml-Zentrifugenrohr ab, damit er sicher auf der erhöhten Seite der 35-mm-Schüssel platzen kann. Ein ähnlicher Ring kann auf andere Weise hergestellt werden, z. B. durch Verwendung eines Gummibands oder einer Kunststoff-Drehbinderung, die auf die erhöhte Seite der Schüssel passt, um den Abdeckrutsch richtig zu halten, ohne die Probe zu stören.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist besonders für Proben von entscheidender Bedeutung, die empfindlich auf Belastungen wie hypoxische Bedingungen und Temperatur- und Feuchtigkeitsänderungen reagieren.

3. Sezieren von Hoden von männlichen Fliegen und Montieren

1. Nehmen Sie ~ 10 junge männliche Fliegen (2-3 Tage alt) und sezieren Sie die Hoden in den lebenden Zellmedien, um ~ 10 Paare von Drosophila-Hoden für Erwachsene zu erhalten.
   1. Sezieren Sie die Fliegen unter einem Präpariermikroskop in einer Sezierschale mit einer feinen Handzette.
      HINWEIS: Der Stamm Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) trägt UAS-α-Tubulin-GFP-Transgen, das von einem frühen Keimzelltreiber nanos-Gal4 angetrieben wird.
   2. Generieren Sie die folgenden Drosophila melanogaster Stämme mit der CRISPR-Cas9-Technologie: Lamin-mCherry (C-terminales Tag) und CENP-A-Dendra2-CENP-A [Tag an der internen Stelle (zwischen 118. - 119. Codon)].
      HINWEIS: Während für jedes Experiment nur ein Hoden von ausgezeichneter Qualität benötigt wird, stellt die Montage einer ausreichenden Anzahl von Geweben (15-20) oder Zellen sicher, dass es mindestens eine gesunde Probe mit hervorragenden Fluoreszenzsignalen für die Zeitrafferbildgebung gibt.
2. Waschen Sie die Hoden zweimal in lebenden Zellmedien in der Sezierschale.
   1. Verwenden Sie eine Pipette, um Medien hinzuzufügen, gefolgt von dem Entfernen der lebenden Zellmedien als Waschschritt.
   2. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe mit einer Zette. Jedes zusätzliche Gewebe stört die Bildgebung.
      HINWEIS: Verwenden Sie keine phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) zum Waschen, da dies die Dynamik bestimmter zellulärer Komponenten beeinflussen kann.
3. 100–150 μL Lebendzellmedien in die Schale geben (vorbereitet in Schritt 2.1) und mit einer Pipettenspitze auf der Glasoberfläche verteilen. Das Verteilen der Medien auf der Oberfläche ermöglicht es dem Gewebe, richtig an der Schüssel zu haften.
4. Die Hoden mit einer feinen Zette in die Schüssel geben und in die Mitte der Schüssel bringen (Abbildung 1A-b).
   HINWEIS: Vermeiden Sie die Übertragung von Trümmern, da dies die Bildgebung beeinträchtigt und die Qualität des Bildes beeinträchtigen könnte.
5. Entfernen Sie überschüssige lebende Zellmedien (lassen Sie etwa 10 μL Medien), damit das Gewebe abflachen und richtig an der Schüssel haften kann. Führen Sie diesen Schritt schnell durch, um ein Trocknen der Probe zu vermeiden.
6. Die vorbenetzte Membran (vorbereitet in den Schritten 2.2 und 2.3) wird auf die Hoden aufgelegt (Abbildung 1A-c).
7. Legen Sie 2–3 kleine Kunststoffgewichte (vorbereitet in Schritt 2.4) auf die Membran, damit die Probe nicht schwimmt, und fügen Sie schnell 100–150 μL lebende Zellmedien hinzu (Abbildung 1A-d).
   HINWEIS: Das schnelle und schonende Hinzufügen von Medien stellt sicher, dass die Probe nicht austrocknet oder verdrängt wird.
8. Legen Sie den Kunststoffring (vorbereitet in Schritt 2.5) auf die erhöhte Seite der Schüssel (Abbildung 1B-a).
9. Legen Sie einen 22 mm x 22 mm großen Abdeckdeckel auf die Oberseite des Rings (Abbildung 1B-b). Dadurch entstehen zwei Kammern.
10. Nehmen Sie ein Stück Seidenpapier, befeuchten Sie es mit Wasser, schwenken Sie es dann und legen Sie es auf den Abdecklip, um eine feuchte Kammer zu erzeugen (Abbildung 1B-c). Schließen Sie den Deckel der Schüssel (Abbildung 1B-d) und beginnen Sie mit der Bildgebung lebender Zellen.
    HINWEIS: Wenn die Probe lichtempfindlich ist, führen Sie Abschnitt 3 im Dunkeln aus.

4. Lebendzellbildgebung von Drosophila männlichen Keimbahnstammzellen (GSC) in situ

1. Legen Sie die Schüssel unter das hochauflösende Mikroskop und befestigen Sie sie mit den Bühnenklemmen.
   1. Öffnen Sie die Bildgebungssoftware, schalten Sie das durchgelassene Licht ein und verwenden Sie das 63-fache Objektiv, um sich mit dem Fokusknopf auf das Hodengewebe zu konzentrieren.
      HINWEIS: Wenn es Schwierigkeiten gibt, eine Probe mit dem 63x-Objektiv zu finden, verwenden Sie zuerst das 40x- oder 20x-Objektiv, bevor Sie zum 63x-Objektiv wechseln.
   2. Schalten Sie die Laser ein, klicken Sie auf Live, und suchen Sie den GSC mit der optimalen Position und dem optimalen Zustand. Vermeiden Sie Hoden, die ein niedriges Fluoreszenzsignal haben oder den Hub (Nische) von der Oberfläche entfernt haben.
      HINWEIS: Bei Drosophila-Hoden sind die GSCs am Hub befestigt.
2. Passen Sie den Fokus für die GSCs an und identifizieren Sie die richtigen Einstellungen für die Probe, einschließlich Laserleistung, Elektronenmultiplikationsverstärkung (EM), Mittelung und Zoom für den Airyscan-Modus. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen als Beispiel für Drosophila-Hoden, die EGFP-markiertes α-Tubulin in Keimzellen im Frühstadium exprimieren.
   1. Legen Sie die Rahmengröße zwischen 512 x 512 Pixel und 1024 x 1024 Pixel fest, indem Sie auf FrameGrößeklicken.
   2. Legen Sie den Framedurchschnitt auf 1 oder 2 fest, indem Sie auf Mittelwertbildungklicken.
      HINWEIS: Eine Erhöhung der Bildgröße (>1024 x 1024 Pixel) und eine höhere Mittelwertbildung (d. h. mehr als 2) kann zu Photobleaching oder Phototoxizität führen.
   3. Stellen Sie die Laserleistung auf 1%–2% ein, indem Sie auf Laser klicken.
      HINWEIS: Die Erhöhung der Laserleistung kann auch zu Photobleaching oder Phototoxizität führen.
   4. Setzen Sie die EM-Verstärkung unter das empfohlene Niveau (< 800), indem Sie auf Master Gainklicken.
      HINWEIS: Eine höhere EM-Verstärkung kann Artefakte erzeugen.
   5. Vergrößern Sie den interessierenden Bereich oder die Zelle, um die Bildaufnahmezeit zu verkürzen und das Photobleaching zu reduzieren. Dadurch kann das Exemplar auch länger überleben.
3. Starten Sie die Zeitrafferbildaufnahme im Airyscan-Modus, indem Sie auf Experiment startenklicken.
   1. Bevor Sie auf Experiment startenklicken, stellen Sie sicher, dass die Erfassung optimal konfiguriert ist.
   2. Wenn eine Warnung mit dem Hinweis "Airyscan-Erfassung ist nicht optimal konfiguriert" angezeigt wird, klicken Sie auf Optimal im Abschnitt "Bildgröße", klicken Sie auf "Optimal im Z-Stapel"-Abschnitt und klicken Sie auf "Optimal für den Scanbereich" (für hochauflösende Bilder ist ein Minimum von 1,3 Zoom erforderlich).
4. Optimieren Sie das Zeitintervall, die Anzahl der Z-Slices und die Dauer der Zeitrafferbildgebung entsprechend dem experimentellen Design und der Art der Probe, damit die Qualität des Bildes nicht beeinträchtigt wird und die Zellen in bestimmten Stadien des Zellzyklus nicht gestoppt werden.
   1. Als Beispiel werden die Parameter für die Zeitrafferbildgebung von Drosophila-Hoden, die EGFP-markiertes α-Tubulin in der frühen Keimbahn exprimieren, in den folgenden Schritten gezeigt.
   2. Für mehr als 5 h Zeitraffer-Bildgebung, bilden Sie in einem 10-minütigen Intervall mit 1% Laserleistung und nehmen Sie bis zu 30 Z-Slices zu jedem Zeitpunkt auf.
   3. Für hochdynamische zelluläre Prozesse, wie die Mikrotubulidynamik, stellen Sie ein Intervall von 2 Minuten zwischen den Zeitpunkten ein, führen Sie 1-2 h Zeitrafferaufnahmen mit 1% Laserleistung durch und nehmen Sie bis zu 30 z-Slices zu jedem Zeitpunkt auf.
   4. Für seltene zelluläre Ereignisse, wie anaphase bis frühe Telophase Chromatindynamik (2-3 min Ereignisse), stellen Sie die Lebendzellbildgebung mit einem 1-min-Intervall zwischen den Zeitpunkten ein, führen Sie 30-minütige Zeitraffer-Bildgebung bei 1% Laserleistung durch und nehmen Sie bis zu 30 z-Slices zu jedem Zeitpunkt auf.
      HINWEIS: Diese Parameter können für verschiedene Proben variieren, so dass eine Änderung erforderlich ist, um die spezifische Probe optimal zu verwenden.
5. Führen Sie je nach Empfindlichkeit der Probe und dem experimentellen Design entweder Zeitraffer- oder Live-Schnappschuss-Bildgebung durch.
   HINWEIS: Ein kurzfilm dauert 15–30 minuten und ein langer Film länger als 5 h.
6. Wenn die Probe sehr empfindlich ist und nicht durch Zeitrafferbildgebung mit einem hochauflösenden Mikroskop untersucht werden kann, wie es häufig bei Drosophila männlichen GSCs der Fall ist, führen Sie einen superauflösenden Live-Schnappschuss (SRLS) der Probe in verschiedenen Zellzyklusstadien durch (wie in Abbildung 2, Abbildung 3, Abbildung 4gezeigt ).
   1. Wenn ein seltenes zellbiologisches Ereignis erfasst wird oder das interessierende Protein ein niedriges Expressionsniveau aufbringt, führen Sie SRLS durch.
   2. Suchen Sie für SRLS eine Zelle in der spezifischen Zellzyklusphase, an der Sie interessiert sind. Wenn Sie sich beispielsweise auf die Mikrotubuli-Kinetochor-Bindung konzentrieren, verwenden Sie eine Zelle in der Prometaphase oder Metaphase.
      HINWEIS: Dies wird dazu beitragen, dass Sie zum richtigen Zeitpunkt ein qualitativ hochwertiges Bild der interessierenden Zelle erhalten, ohne eine Phototoxizität für die Probe oder das Bleichen der Fluorophore zu riskieren, was während eines längeren Films auftreten kann.
   3. Wenn Sie SRLS verwenden, bilden Sie verschiedene Zellzyklusstadien von Interesse über mehrere Zellen hinweg ab und ordnen Sie diese Bilder in chronologischer Reihenfolge an.
      HINWEIS: Dies kann verwendet werden, um eine zeitliche Reihenfolge der Ereignisse zu konstruieren und gleichzeitig die Signal- und Gewebegesundheit zu maximieren, um eine hervorragende zeitliche Auflösung des Ereignisses für besonders empfindliche Proben oder Proben mit niedrigem Signal zu erhalten.

5. Airyscan-Verarbeitung der lebenden Zellbilder

1. Wählen Sie nach der Bildaufnahme mit der Imaging-Software Verarbeitung, klicken Sie auf Stapel, und wählen Sie dann Airyscan Processingaus.
   1. Wählen Sie die zu verarbeitenden Bilder aus und klicken Sie dann auf Ausführen/Verarbeiten, um die Bilder mit superauflöserer Auflösung zu erhalten.
   2. Führen Sie die Verarbeitung mit der Standardeinstellung aus.
      HINWEIS: Die Airyscan-Verarbeitung funktioniert nur, wenn die Bildeinstellungen für die Airyscan-Bildgebung ordnungsgemäß eingerichtet sind.

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Ergebnisse

Die Bildgebung von Lebendzellen jenseits der Beugungsgrenze im Drosophila-Gewebe, insbesondere für GSCs, bietet die Möglichkeit, die Dynamik subzellulärer Ereignisse im Kontext der Zellzyklusprogression zu untersuchen. Kürzlich hat eine Studie, die dieses Protokoll verwendet, gezeigt, dass Mikrotubuli-Aktivitäten am Mutterzentrosom gegenüber dem Tochterzentrosom in GSCs¹⁰zeitlich asymmetrisch sind. Das Mutterzentrosom strahlt Mikrotubuli etwa 4 Stunden vor dem mitotischen Eintritt a...

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Diskussion

Hochauflösende Mikroskopiemethoden bieten eine räumliche Auflösung von bis zu 10 Nanometern^4,5,6. Die STORM- und PALM-Mikroskopiemethoden ermöglichen eine Auflösung von bis zu 20 bis 50 nm (XY-Auflösung), während die STED-Mikroskopie eine Auflösung von 20 bis 100 nm (XY-Auflösung) bietet. Die räumliche Auflösung der SIM-Mikroskopie ist auf 100 bis 130 nm¹⁵begrenzt. Aufgrund der hohen Photonendichte und der ...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adobe Illustrator CS6 (figure making software)	Adobe	N/A
Dialysis membrane	Spectra/Por 1-4 Standard RC Dialysis Membrane	Cat No. 08-67121
FBS	Thermo Fisher Scientific	Cat. no. 26140079	15% (V/V)
Fiji (analysis software)	NIH	N/A	Image fluorescence intensity quantification
Glass bottom cell culture dishes (FluroDish)	World Precision Instrument, Inc.	FD35PDL-100
Imaris (image reconstruction software)	Bitplane	N/A	3D image reconstruction
Imerssion oil	Zeiss	Immersol 518F/30 °C
Insulin	Sigma	Cat. No. 15550	200 µg/ml
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	Cat No. - 15140-122	0.6x
Schneider Drosophila media	Invitrogen	Cat No. - 11720-034
Spinning disc confocal microscope	Zeiss	N/A	equipped with an evolve camera (Photometrics), using a 63x Zeiss objective (1.4 NA).
Tissue paper	Kimwipe	N/A	Wet to form humid chamber
LSM 800 confocal microscope with AiryScan super-resolution module	Zeiss	N/A	equipped with highly sensitive GaAsP (Gallium Arsenide Phosphide) detectors using a 63x Zeiss objective (1.4 NA)
ZEN (imaging software)	Zeiss	N/A