使用基于 CRISPR/Cas9 的技术研究 CD40 激动抗体诱导的结肠炎模型中的靶基因功能

摘要

在这里，我们描述了使用基于成簇规则间隔短回文重复序列 （CRISPR）/CRISPR 相关核酸内切酶 （Cas9） 的技术敲除免疫系统中感兴趣基因的方法，以及在分化簇 40 （CD40） 激动性抗体诱导的结肠炎模型中对这些小鼠的评估。

摘要

免疫系统的功能是保护人类免受细菌和病毒等外来入侵者的侵害。然而，免疫系统疾病可能导致自身免疫、炎症性疾病和癌症。炎症性肠病 （IBD）——克罗恩病 （CD） 和溃疡性结肠炎 （UC）——是以复发性肠道炎症为特征的慢性疾病。尽管 IBD 在西方国家最为普遍（每 1,000 人中就有 1 人），但世界各地的发病率正在上升。通过关联研究，研究人员已将数百个基因与 IBD 的病理学联系起来。然而，IBD 背后复杂的病理学和大量潜在基因对寻找最佳治疗靶点构成了重大挑战。此外，从功能上表征每个遗传关联所需的工具引入了许多限速因素，例如每个基因的转基因小鼠的产生。为了研究靶基因的治疗潜力，已经使用基于成簇规则间隔短回文重复序列 （CRISPR）/CRISPR 相关核酸内切酶 （Cas9） 的技术和分化 40 （CD40） 激动抗体簇开发了一种模型系统。本研究表明，CRISPR/Cas9 介导的免疫系统编辑可用于研究基因在体内的影响。仅限于造血隔室，这种方法可靠地编辑产生的重组免疫系统。CRISPR/Cas9 编辑的小鼠生成速度更快，并且比传统的转基因小鼠便宜得多。此外，与生成和培育转基因小鼠相比，小鼠的 CRISPR/Cas9 编辑具有显着的科学优势，例如能够评估胚胎致死靶标。在 CD40 激动性抗体诱导的结肠炎模型中使用 CD40 作为模型靶点，本研究证明了这种方法的可行性。

引言

自身免疫性疾病是指患者的免疫系统攻击自身细胞和器官，导致慢性炎症和组织损伤的情况。迄今为止，已描述了近 100 种不同类型的自身免疫性疾病，影响了 3-5% 的人类¹。许多自身免疫性疾病，包括系统性红斑狼疮和 IBD，缺乏有效的治疗方法，并且存在重大未满足的医疗需求。目前，仅在美国就有大约 150 万人患有 IBD，IBD 是一种毁灭性的疾病，其特征是进行性、持续性和复发性的肠道炎症，没有可用的治愈方法。需要解开潜在的发病机制和病理生理学，以提供 IBD 患者所需的新型治疗和预防策略 ^2,3。

通过全基因组关联分析 （GWAS） 已鉴定出 230 多个不同的 IBD 位点⁴。尽管这些关联阐明了在 IBD 关键机制和途径中可能发挥重要作用的新基因，但仅研究了来自这些基因座的少数基因。一些基因与特定途径有关。例如，微生物感应途径与包含核苷酸结合的寡聚化结构域蛋白 2 （NOD2） 有关;自噬途径与自噬相关 16 like 1 （ATG16L1）、免疫相关 GTP 酶家族 M （IRGM） 和 caspase 募集结构域家族成员 9 （CARD9） 有关;促炎途径与白细胞介素 （IL）-23 驱动的 T 细胞反应有关⁴。各种体内小鼠模型已被用于对通过 GWAS 鉴定的基因进行功能表征 ^5,6。

用于研究 IBD 发病机制 ^7,8 的关键模型之一是结肠炎的 CD40 模型，该模型在将 CD40 激动抗体注射到免疫缺陷（T 细胞和 B 细胞）小鼠中后诱导先天免疫性肠道炎症。主要用于检查先天免疫对 IBD 发展的贡献，主要是巨噬细胞和树突状细胞⁹，目前尚不清楚是否可以在完全免疫能力的野生型 （WT） 小鼠中诱导疾病。除了动物模型外，基因的功能表征也需要基因特异性工具，包括化合物和生物制剂。更重要的是，转基因动物对于揭示特定基因的功能至关重要。然而，通常用于进行转基因小鼠胚胎注射和繁殖的策略通常需要一年多的时间，并产生巨大的财务成本。这种限速过程在阐明 GWAS 鉴定的 IBD 相关基因的功能方面提出了重大挑战。

这里介绍的方案为培育转基因小鼠提供了一种可行的替代方案。首先，如图 1 所示，从携带特定等位基因 （CD45.2） 的 Cas9 敲除蛋白 （KI） 小鼠的骨髓中分离出谱系阴性、干细胞抗原 1 阳性、受体酪氨酸激酶 Kit 阳性（谱系-Sca1+c-Kit+ 或 LSK）细胞，以允许供体免疫细胞追踪。接下来，将这些细胞暴露于携带不同向导 RNA （gRNA） 和荧光标记物紫色激发绿色荧光蛋白 （VexGFP） 的慢病毒中，以追踪转导的细胞。两天后，将 VexGFP + 细胞分选并注射到致命照射的受体 Ly5.1 Pep Boy 小鼠中，这些小鼠是带有 CD45.1 等位基因的 C57Bl/6 小鼠，以允许受体免疫细胞追踪。12 周后，免疫系统完全重建，小鼠可以被纳入体内模型。

与转基因动物的生成和繁殖相比，除了节省成本和更快的生成时间外，该方法还非常适合胚胎致死的靶标，因为它专门针对造血区室。此外，对于没有可用工具的靶标，例如抗体，该系统提供了一种可行的方法。总之，为了解决迄今为止描述的挑战，开发了一种基于 CRISPR/Cas9 的体内基因组编辑平台，以快速生成转基因动物模型 10,11,12,13,14。本研究表明，WT C57Bl/6 小鼠的肠道炎症可由 CD40 激动性抗体诱导。CD40 是该模型中疾病的关键调节因子，因此被用作验证基于 CRISPR/Cas9 的敲除和基因功能丧失的模型靶标。

研究方案

按照本协议进行的所有动物实验必须得到相应机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 的批准。此处描述的所有程序均已获得 AbbVie IACUC 的批准。

1. 生成所需的慢病毒并采购供体和受体动物

注： 材料表 包括本协议中使用的所有动物、仪器和试剂的来源和订单号详细信息。

1. 使用修饰为 VexGFP 或 mCherry 的 lentiGuide-puro 载体构建质粒。
   1. 将加扰的非靶向 gRNA （SgNone） 或 CD40 靶向 gRNA 克隆到修饰的载体中。
      注：在本研究中，每个 gRNA 的序列如下：SgNone，CTATGATTGCAACTGTGCAG;SgCD40.1，AGCGAATCTCCCTGTTCCAC;SgCD40.2，GACAAACAGTACCTCCACGA;和 SgCD40.3，ACGTAACACACTGCCCTAGA。
   2. 如前所述产生慢病毒颗粒¹⁵.
      1. 使用 VSV-G 和 pLEX 包装质粒将编码 gRNA 的质粒共转染到 293T 细胞中。
      2. 转染 18 小时后更换培养基，并在更换培养基后 24-48 小时后收集含有病毒的上清液。
      3. 为了评估 CD40 gRNA 效率，通过转染编码 CD40 的 pcDNA3.1 质粒来生成 CD40 稳定的 293T 细胞系。
   3. 使用所述慢病毒转染细胞，并在两周后通过荧光激活细胞分选 （FACS） 对其进行评估。
      注：Cas9 KI 小鼠用作供体小鼠。当使用 C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy 小鼠（表达 CD45.1 等位基因）作为受体时，确保 Cas9 KI 小鼠处于 C57Bl/6 背景上（并且表达 CD45.2 等位基因），从而避免 GvHD 并追踪供体和受体细胞。
2. 设计实验。对于基因敲除 （KO），每个基因使用 3-6 个 gRNA。对于每种 gRNA，准备 20% 的额外受体小鼠，以解决移植期间和移植后的动物损失。
   注：CD40 激动性抗体诱导的结肠炎模型每组至少需要 8 只小鼠进行统计把握。因此，在本研究中，每个 gRNA 制备了 10 只小鼠。其他体内模型所需的小鼠数量将根据所使用的模型而有所不同。
3. 使用 8-12 周龄的同性供体和受体小鼠。
   注意：根据 IACUC 批准的指南，使用至少 5% 的异氟醚对小鼠实施安乐死，并以颈椎脱位作为辅助方法确认。

2. 骨髓采集和细胞分选准备

1. 使用镊子和剪刀，从每只供体小鼠（股骨、胫骨、肱骨和尺骨）上收获骨骼，小心地去除尽可能多的肌肉/组织。
2. 用 23 G 针刺穿 0.6 mL 微量离心管的底部，然后将管放入 1.5 mL 离心管中。每只动物制作 2 套。
3. 切开骨头的一端，将 4-8 根骨头放入微量离心管内，开口端朝向 23 G 针孔。
   注意：每根管子的骨骼数量取决于骨骼，例如，8 个胫骨、肱骨和尺骨或 4 个股骨将适合。
4. 在室温 （RT） 下以 300 × g 离心管（使用 0.6 mL 微量离心管，其中包含 1.5 mL 离心管内的骨骼）离心 2 分钟。
5. 丢弃 0.6 mL 微量离心管，现在包含没有骨髓的骨骼，只留下 1.5 mL 离心管，现在充满了骨髓。向每个离心管中加入 1 mL 红细胞裂解缓冲液（含氯化铵），并通过移液重悬细胞沉淀。在 RT 孵育 1 分钟。如果需要，重复裂解步骤。
6. 将细胞悬液转移到 50 mL 锥形管中，并加入不含钙和镁的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS）（至少是细胞悬液体积的两倍）以中和裂解缓冲液。以 300 × g 沉淀细胞 5 分钟。完全吸出上清液。
7. 在 50 mL 锥形管上加载 70 μm 过滤器，并使用 DPBS 清洗试管和过滤器，过滤细胞。丢弃过滤器，并对单元格进行计数。
   注意：使用 30 只供体小鼠（12 周龄）平均可产生 200-300 × 10⁶ 个细胞。

3. 细胞分选分离 LSK 细胞进行转导

1. 将步骤 2.7 中计数的细胞重悬于所需体积（每 10⁷ 个细胞 90 μL）的磁性细胞分选 （MACS） 缓冲液（DPBS、2 mM 乙二胺四乙酸、0.5% 牛血清白蛋白、10 μg/mL 青霉素-链霉素）中。
2. 每 10⁷ 个细胞添加 10 μL CD117 + 珠子。充分混合，避光，并在 4 °C 下孵育 15 分钟。
3. 通过将色谱柱置于磁场中并用 MACS 缓冲液冲洗来制备 MACS LS 色谱柱。
4. 用适当体积的 MACS 缓冲液（至少是体积的两倍）洗涤步骤 3.2 中的细胞，并以 300 × g 离心 10 分钟。
5. 完全吸出上清液。重新悬浮沉淀，使最终浓度为 10⁸ 个细胞，溶于 500 μL MACS 缓冲液中。
6. 将细胞悬液涂在 LS 柱上。用 3 mL MACS 缓冲液洗涤 3 次。
   注：一根 LS 柱最多可吸收 10 个⁸ 个标记细胞和 2 × 10^{个 9} 个细胞。
7. 从磁选机中取出色谱柱，并将其放入合适的收集管中。加入 5 mL MACS 缓冲液，立即将柱塞用力推入柱中，冲洗出磁性标记的细胞。
8. 以 300 × g 的浓度沉淀细胞 10 分钟。完全吸出上清液。
9. 将细胞重悬于每 10⁷ 个细胞 100 μL MACS 缓冲液中，并添加谱系（CD3、B220、Ter119、Gr-1、CD11b）和 Sca-1 的染色抗体。
   注意：使用 30 只供体小鼠（12 周龄）平均会产生 100-180 × 10⁶ 个细胞。
10. 充分混合，避光，并在 4 °C 下孵育 20 分钟。
11. 加入 5-10 mL MACS 缓冲液洗涤细胞，并以 300 × g 离心 10 分钟。完全吸出上清液。
12. 在 500 μL MACS 缓冲液中重悬多达 10^{个 8} 个细胞
13. 用 70 μm 细胞过滤器过滤细胞，并对谱系-Sca1 + 群体进行 FACS。
    注：大约 1.8-2.6% 的种群应该是 secage-Sca1+。
14. 在 LSK 培养基中收集细胞（每 10,000 个细胞 100 μL）：无血清扩增培养基、100 ng/mL 血小板生成素、小鼠干细胞因子、Fms 相关酪氨酸激酶 3 配体和 IL-7 与 100 μg/mL 青霉素-链霉素。
15. 以 300 × g 沉淀细胞 10 分钟。完全吸出上清液。

4. LSK 转导和培养以生成对照细胞和敲除细胞

1. 将细胞重悬于 LSK 培养基中。
2. 在 LSK 培养基中，将 10,000 个细胞/孔接种在 96 孔平底组织培养 （TC） 板中。
3. 在无菌条件下，在 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度下孵育过夜。
4. 在 DPBS 中制备 50 μg/mL retronectin 溶液，并向未经 TC 处理的 24 孔聚苯乙烯板的每个孔中加入 300 μL。在 4 °C 下孵育过夜。
5. 第二天，弃去 retronectin 溶液，用 300 μL DPBS 冲洗包被板，然后重复。
6. 从步骤 4.4 中将 50,000 个 LSK 细胞转移到 500 μL 培养基（步骤 4.2 中 96 孔板中的 5 个孔）中，到 24 孔聚苯乙烯板的每个 retronectin 包被孔中。确保此步骤后 24 孔板中每孔的体积为 600 μL（96 孔板的 5 × 100 μL 孔 + 100 μL 用于清洗这 5 个孔）。
   注：转移后，在显微镜下观察现在空的 24 孔板，以确认已收集所有细胞。使用 LSK 培养基收集未转移的细胞，以最大限度地减少该小群体的细胞损失。
7. 向每个孔中加入 300 μL 病毒上清液，并以 500 的设定值摇动板 5 分钟。将板在 600 × g 和 37 °C 下旋转 20 分钟。每毫升至少使用 5 × 10⁶ 个病毒颗粒。
   注：在本研究中，使用了从 pLentiPuro 修饰的载体，其中嘌呤霉素抗性元件被交换为 VexGFP。病毒的感染倍数为 50-100。
8. 孵育 1 小时。加入 500 μL 预热的 LSK 培养基。
9. 在无菌条件下，在 37 °C、5% CO₂ 和 95% 湿度下孵育 2 天。

5. 动物辐照为供体干细胞植入做准备

1. 孵育 2 天后，间隔 4 小时用 475 cGy 照射受体动物两次。第二轮照射后，将动物置于高压灭菌的笼子中，并将它们作为免疫缺陷动物处理 12 周。小鼠接受富集、水凝胶和笼侧监测，以根据需要提供支持性护理和干预。除了支持性护理和干预方法外，小鼠还可以接受抗生素食物或水。
   注意。照射剂量可能因不同的照射器而异。对辐照器进行剂量滴定以确定最佳剂量。在各种文献实例中发现 C57Bl / 6 小鼠的 700 至 1300 cGy 剂量有效¹⁷。在此范围内选择 3-4 个剂量，并评估每个剂量 5 只小鼠的存活和植入情况。如果植入不成功或辐射剂量过高，小鼠在植入后将无法存活超过 3 周。植入后 4 周，对存活的小鼠放血以评估 FACS 的植入。我们进行每只小鼠 ~50-100 μL 的眶后 （RO） 血液采集以评估植入。小鼠在采集过程中处于麻醉状态 （2-3% 异氟醚），并在 RO 采血后接受眼润滑剂和 1.0 mL 皮下盐水作为支持性护理。

6. 细胞制备和注射到辐照受体动物中

1. 从步骤 4.9 中将细胞从每个孔中吸出，保持组分开，因为细胞已经用不同的 gRNA 转导，并以 300 × g 沉淀 10 分钟。
2. 将细胞重悬于 MACS 缓冲液中，用 70 μm 过滤器过滤，并对 VexGFP+ 群体进行分类。
   注：大约 10-15% 的细胞应为 VexGFP+。
3. 将细胞以 300 × g 沉淀 10 分钟。将它们重悬于 Hank 平衡盐溶液中：每只小鼠在 200 μL 中 5,000 个或更多细胞。
   注：HBSS 是非药物级的。您也可以考虑使用药用无菌注射盐水。
4. 在最后一次照射后 3 小时静脉注射细胞。
   注意：十二周后，小鼠将具有完全植入的免疫系统，并且可以纳入体内模型。

7. 野生型小鼠 CD40 激动抗体诱导的结肠炎模型

注意：每天称重和评估动物。根据需要提供支持性护理：1.0 mL 皮下注射氯化钠溶液，体重减轻 10% 或脱水。该模型的阳性对照是抗 p40，从第 -1 天开始，以 25 mg/kg 腹膜内给药，每周两次。

注：在本研究中，实验组包括初始对照组、载体（阴性）对照和抗 p40（阳性）对照组。这些组共同控制 CD40 激动性抗体诱导的结肠炎模型的正常行为。载体、SgNone 和 SgRNA 组：常见慢病毒载体的载体对照，SgNone 是加扰的非靶向向导对照，而 SgRNA 组是靶标 gRNA 表达降低的“处理”组。

1. 第 0 天：在 DPBS 中以 10 mg/kg 的腹膜内注射 CD40 激动抗体到除初始对照外的所有动物中。
2. 第 3 天和第 6 天：如前所述进行视频内窥镜检查以评估疾病进展¹⁶.
   1. 用 2-3% 异氟醚麻醉小鼠。在恢复期间通过内部麻醉机机构和/或外部加热垫提供热支持。
   2. 一旦小鼠处于麻醉状态，就进行 DPBS（不含钙和镁）灌肠以准备结肠进行内窥镜检查。
      注：进行灌肠大约需要 1-2 mL。
   3. 灌肠后，在麻醉下，将鼠标移动到麻醉机的鼻锥上。
   4. 将内窥镜轻轻插入结肠，缓慢推进到近端结肠，同时保持摄像头居中并用空气给结肠充气（使用随附的气泵或连接管/注射器手动充气），然后慢慢抽出内窥镜并在距离肛门 3 厘米、2 厘米和 1 厘米处收集视频和图像。
      注意： 为了尽量减少对结肠的刺激，可以在内窥镜的尖端添加无菌润滑剂。
   5. 如 表 1 所述，根据粘膜的血管模式和增厚对每个图像单独评分。将每只小鼠 3 张图像的分数组合起来，为每只动物分配一个总分。
3. 第 7 天：通过异氟醚过量或 CO₂ 室对所有小鼠实施安乐死，并通过心脏穿刺收集尽可能多的血液以获取血清。称量脾脏以测量脾肿大并收集用于流式细胞术，并收集结肠用于组织病理学。
   注：制备小鼠结肠的福尔马林固定和石蜡包埋的组织切片，并用于免疫组织化学 （IHC），如 Wang 等人¹⁹ 之前所述。

结果

按照上述程序，产生表达 CD40 靶向 gRNA 的小鼠。到第 2 周，B 细胞、CD11b + 巨噬细胞和 CD11c + 树突状细胞 （DC） 被植入（图 2）。然而，正如根据以前的文献¹⁸ 预期的那样，T 细胞需要更长的时间才能完全植入，并且需要植入后 12 周才能达到 ~90%（图 2）。免疫器官，如脾脏和淋巴结，?...

讨论

这里显示的结果介绍了一种基于 CRISPR/Cas9 的新型基因组编辑平台，该平台能够研究这种 CD40 激动性抗体诱导的结肠炎模型中的基因功能。细胞分选富集了转基因 LSK 细胞库，在短短 4 个月内，重组动物体内的 CD40 表达降低了 90% 以上。此外，免疫系统中 CD40 表达的降低在 CD40 激动性抗体诱导的结肠炎模型中具有深远的影响，显着降低了疾病终点。基于这些结果，建立了一?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture plates	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µm filter unit	Millipore	#SLHV013SL
0.6 mL microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-060-C-S
1.5 mL Eppendorf Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15mL Conical	VWR	21008-918
23 G Needle	VWR	#305145
24 Well Non-TC Plates	Falcon	#351147
24-Well TC Plates	Falcon	#353047
50 mL Conical tube	VWR	21008-951
5 mL Syringe	BD Biosciences	#309647
70 µm Filter	Miltenyi	#130-098-462
96-Well Flat Bottom Plates	Corning	#3599
96-Well U-Bottom Plates	Corning/Costar	#3365
Anesthesia Machine	VetEquip - COMPAC5	#901812
Anti-CD40 Agonist monoclonal antibody	BioXcell	BE-0016
Anti-p40 monoclonal antibody	BioXcell	BE-0051
B220 PE Antibody	BioLegend	#103208
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Mice	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 background
CD117+ Beads	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE Antibody	BioLegend	#101208
CD3 PE Antibody	BD Biosciences	#553240
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrifuge
Countertop Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
Endoscope	Karl Storz	N/A	Custom Coloview Tower
Flow cytometer	BD Biosciences	FACS Aria II
Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE Antibody	BD Biosciences	#553128
Hank's balanced salt solution (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Incubator	Binder	#9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	#6679401710
LS Column	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy Mice	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6 background
mouse stem cell factor (mSCF)	PeproTech	#250-03
Sodium chloride (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM serum-free media	Invitrogen	#31985-070
Penicillin-streptomycin (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Plate Shaker	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene (10 µg/µL)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	#00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Antibody	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE Antibody	eBioscience	#12-5921
Thrombopoietin (TPO)	PeproTech	#315-14
X-ray Irradiator	Precision X-Ray	X-Rad 320