Studio della funzione del gene bersaglio in un modello di colite indotta da anticorpi agonistici CD40 utilizzando tecnologie basate su CRISPR/Cas9

Riepilogo

Qui, descriviamo la metodologia per eliminare un gene di interesse nel sistema immunitario utilizzando tecnologie basate su brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR)/endonucleasi associate a CRISPR (Cas9) e la valutazione di questi topi in un modello di colite indotta da anticorpi agonisti cluster di differenziazione 40 (CD40).

Abstract

Il sistema immunitario funziona per difendere gli esseri umani dagli invasori estranei come batteri e virus. Tuttavia, i disturbi del sistema immunitario possono portare ad autoimmunità, malattie infiammatorie e cancro. Le malattie infiammatorie intestinali (IBD) - morbo di Crohn (CD) e colite ulcerosa (UC) - sono malattie croniche caratterizzate da infiammazione intestinale recidivante. Sebbene l'IBD sia più diffusa nei paesi occidentali (1 su 1.000), i tassi di incidenza sono in aumento in tutto il mondo. Attraverso studi di associazione, i ricercatori hanno collegato centinaia di geni alla patologia dell'IBD. Tuttavia, l'elaborata patologia alla base dell'IBD e l'elevato numero di potenziali geni pongono sfide significative nella ricerca dei migliori bersagli terapeutici. Inoltre, gli strumenti necessari per caratterizzare funzionalmente ogni associazione genetica introducono molti fattori limitanti la velocità come la generazione di topi geneticamente modificati per ogni gene. Per studiare il potenziale terapeutico dei geni bersaglio, è stato sviluppato un sistema modello utilizzando tecnologie basate su brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR)/endonucleasi associate a CRISPR (Cas9) e un anticorpo agonista cluster di differenziazione 40 (CD40). Il presente studio mostra che l'editing mediato da CRISPR/Cas9 nel sistema immunitario può essere utilizzato per studiare l'impatto dei geni in vivo. Limitato al compartimento ematopoietico, questo approccio modifica in modo affidabile il sistema immunitario ricostituito risultante. I topi modificati con CRISPR/Cas9 vengono generati più velocemente e sono molto meno costosi dei tradizionali topi geneticamente modificati. Inoltre, l'editing CRISPR/Cas9 dei topi presenta significativi vantaggi scientifici rispetto alla generazione e all'allevamento di topi geneticamente modificati, come la capacità di valutare bersagli che sono letali embrionali. Utilizzando il CD40 come bersaglio del modello di colite indotta da anticorpi agonisti CD40, questo studio dimostra la fattibilità di questo approccio.

Introduzione

Le malattie autoimmuni si riferiscono a condizioni in cui il sistema immunitario di un paziente attacca le proprie cellule e organi, provocando infiammazione cronica e danni ai tessuti. Ad oggi sono stati descritti quasi 100 diversi tipi di condizioni autoimmuni, che colpiscono il 3-5% della popolazione^umana1. Molte delle condizioni autoimmuni, tra cui il lupus eritematoso sistemico e l'IBD, mancano di trattamenti efficaci e presentano significative esigenze mediche insoddisfatte. Attualmente colpisce circa 1,5 milioni di persone solo negli Stati Uniti, l'IBD è una malattia devastante caratterizzata da un'infiammazione intestinale progressiva, persistente e recidivante senza cura disponibile. Svelare la patogenesi e la fisiopatologia sottostanti è necessario per fornire le nuove strategie di trattamento e prevenzione che i pazienti con IBD richiedono ^2,3.

Oltre 230 diversi loci di IBD sono stati identificati attraverso analisi di associazione genome-wide (GWAS)⁴. Sebbene queste associazioni abbiano chiarito nuovi geni che sono potenzialmente attori importanti nei meccanismi e nei percorsi chiave dell'IBD, sono stati studiati solo pochi geni di questi loci. Alcuni geni sono stati implicati in percorsi specifici. Ad esempio, la via di rilevamento dei microbi è stata collegata alla proteina 2 (NOD2) contenente il dominio di oligomerizzazione legante i nucleotidi; la via dell'autofagia è stata collegata all'autofagia 16 like 1 (ATG16L1), alla famiglia GTPasi M correlata all'immunità (IRGM) e al membro della famiglia 9 del dominio di reclutamento delle caspasi (CARD9); e la via pro-infiammatoria è stata collegata alle risposte delle cellule T guidate dall'interleuchina (IL)-23⁴. Vari modelli murini in vivo sono stati utilizzati per caratterizzare funzionalmente i geni identificati attraverso GWAS ^5,6.

Uno dei modelli chiave utilizzati per studiare la patogenesi ^7,8 dell'IBD è il modello CD40 della colite, che induce un'infiammazione intestinale immunitaria innata in seguito all'iniezione di un anticorpo agonista CD40 in topi immunodeficienti (cellule T e B). Utilizzato principalmente per esaminare il contributo dell'immunità innata allo sviluppo di IBD, principalmente macrofagi e cellule dendritiche⁹, non è chiaro se la malattia possa essere indotta in topi wild-type (WT) completamente immunocompetenti. Oltre ai modelli animali, sono necessari anche strumenti specifici per i geni per la caratterizzazione funzionale di un gene, compresi i composti chimici e i farmaci biologici. Ancora più importante, gli animali geneticamente modificati sono essenziali per rivelare la funzione di un gene specifico. Tuttavia, le strategie tipicamente utilizzate per realizzare topi geneticamente modificati – l'iniezione e l'allevamento di embrioni – spesso richiedono più di un anno e comportano un costo finanziario significativo. Questo processo di limitazione della velocità rappresenta una sfida significativa nella ricerca per chiarire le funzioni dei geni correlati alle IBD identificati da GWAS.

Il protocollo qui presentato fornisce una valida alternativa all'allevamento di topi geneticamente modificati. In primo luogo, come mostrato nella Figura 1 , le cellule schematiche, lignaggio-negative, antigene1-positivo, recettore tirosin-chinasi Kit-positive (lineage-Sca1+c-Kit+ o LSK) vengono isolate dal midollo osseo di topi Cas9 knockin (KI) portatori di un allele specifico (CD45.2) per consentire il tracciamento delle cellule immunitarie del donatore. Successivamente, queste cellule sono esposte a lentivirus che portano diversi RNA guida (gRNA) e un marcatore fluorescente, la proteina fluorescente verde eccitata al viola (VexGFP), per consentire il tracciamento delle cellule trasdotte. Due giorni dopo, le cellule VexGFP+ vengono selezionate e iniettate in topi Ly5.1 Pep Boy riceventi irradiati letalmente, che sono topi C57Bl/6 portatori dell'allele CD45.1 per consentire il tracciamento delle cellule immunitarie riceventi. Dodici settimane dopo, il sistema immunitario è completamente ricostituito e i topi possono essere arruolati in modelli in vivo.

Oltre al vantaggio di risparmiare sui costi e di accelerare i tempi di generazione rispetto alla generazione e all'allevamento di animali geneticamente modificati, questa metodologia è ideale per bersagli che sono letali embrionali, in quanto si rivolge specificamente al compartimento ematopoietico. Inoltre, per i bersagli in cui non sono disponibili strumenti, come un anticorpo, questo sistema fornisce un approccio fattibile. In sintesi, per affrontare le sfide descritte finora, è stata sviluppata una piattaforma di editing genomico in vivo basata su CRISPR/Cas9 per generare rapidamente modelli animali geneticamente modificati 10,11,12,13,14. Questo studio dimostra che l'infiammazione intestinale nei topi WT C57Bl/6 può essere indotta da un anticorpo agonista CD40. CD40 è un regolatore chiave della malattia in questo modello ed è stato quindi utilizzato come bersaglio del modello per convalidare il knockout basato su CRISPR/Cas9 e la perdita della funzione genica.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali eseguiti seguendo questo protocollo devono essere approvati dal rispettivo Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC). Tutte le procedure qui descritte sono state approvate da AbbVie IACUC.

1. Generazione dei lentivirus necessari e approvvigionamento di animali donatori e riceventi

NOTA: La tabella dei materiali include i dettagli della fonte e del numero d'ordine per tutti gli animali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo.

1. Costruire i plasmidi utilizzando un vettore lentiGuide-puro modificato in VexGFP o mCherry.
   1. Clona il gRNA non mirato criptato (SgNone) o il gRNA mirato al CD40 nel vettore modificato.
      NOTA: In questo studio, le sequenze per ciascun gRNA erano le seguenti: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTGTTCCAC; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA; e SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
   2. Produrre le particelle lentivirali come descritto in precedenza¹⁵.
      1. Co-trasfettare i plasmidi codificanti il gRNA in cellule 293T con plasmidi di imballaggio VSV-G e pLEX.
      2. Cambiare il terreno di coltura dopo 18 ore di trasfezione e raccogliere i surnatanti contenenti il virus dopo 24-48 ore dal cambio del terreno.
      3. Per valutare l'efficienza del gRNA CD40, generare una linea cellulare 293T stabile CD40 mediante trasfezione di un plasmide pcDNA3.1 che codifica per CD40.
   3. Trasfettare le cellule utilizzando i lentivirus descritti e valutarle mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS) due settimane dopo.
      NOTA: I topi Cas9 KI sono stati utilizzati come topi donatori. Assicurarsi che i topi Cas9 KI si trovino su uno sfondo C57Bl/6 (ed esprimano l'allele CD45.2) quando utilizzano topi C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy (che esprimono l'allele CD45.1) come riceventi, in modo da evitare la GvHD e per tracciare le cellule del donatore e del ricevente.
2. Progetta l'esperimento. Per il knockout genico (KO), utilizzare 3-6 gRNA per gene. Per ogni gRNA, preparare il 20% in più di topi riceventi per tenere conto della perdita animale durante e dopo il trapianto.
   NOTA: Il modello di colite indotta da anticorpi agonisti CD40 richiede un minimo di 8 topi per gruppo per il potenziamento statistico. Quindi, in questo studio sono stati preparati 10 topi per gRNA. Il numero di mouse necessari per altri modelli in vivo varierà in base al modello utilizzato.
3. Usa topi donatori e riceventi dello stesso sesso di età compresa tra 8 e 12 settimane.
   NOTA: I topi sono stati soppressi secondo le linee guida approvate dall'IACUC utilizzando un isoflurano minimo del 5% e confermati con lussazione cervicale come metodo secondario.

2. Raccolta del midollo osseo e preparazione per la selezione cellulare

1. Usando pinze e forbici, prelevare le ossa da ciascun topo donatore (femore, tibia, omero e ulna), rimuovendo con cura quanto più muscolo/tessuto possibile.
2. Forare il fondo di una provetta da microcentrifuga da 0,6 ml con un ago da 23 G e posizionare la provetta all'interno di una provetta da centrifuga da 1,5 ml. Fai 2 set per animale.
3. Tagliare un'estremità delle ossa e posizionare 4-8 ossa all'interno della provetta da microcentrifuga con le estremità aperte rivolte verso il foro dell'ago da 23 G.
   NOTA: Il numero di ossa per provetta dipende dall'osso, ad esempio, 8 tibie, omeri e ulne o 4 femori si adattano.
4. Centrifugare le provette (con la provetta da microcentrifuga da 0,6 mL contenente le ossa all'interno della provetta da centrifuga da 1,5 mL) a 300 × g per 2 minuti a temperatura ambiente (RT).
5. Scartare la provetta da microcentrifuga da 0,6 mL, che ora contiene ossa senza midollo, lasciando solo la provetta da centrifuga da 1,5 mL ora piena di midollo. Aggiungere 1 mL di tampone per lisi dei globuli rossi (contenente cloruro di ammonio) a ciascuna provetta da centrifuga e risospendere il pellet cellulare mediante pipettaggio. Incubare a RT per 1 min. Ripetere la fase di lisi, se necessario.
6. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 mL e aggiungere la soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di Dulbco senza calcio e magnesio (almeno il doppio del volume della sospensione cellulare) per neutralizzare il tampone di lisi. Celle a pellet a 300 × g per 5 min. Aspirare completamente il surnatante.
7. Caricare un filtro da 70 μm su una provetta conica da 50 mL e filtrare le cellule, utilizzando DPBS per lavare la provetta e il filtro. Eliminare il filtro e contare le celle.
   NOTA: L'utilizzo di 30 topi donatori (di 12 settimane) produrrà in media 200-300 × 10⁶ cellule.

3. Smistamento cellulare per isolare le cellule LSK per la trasduzione

1. Risospendere le cellule contate nella fase 2.7 nel tampone di selezione cellulare magnetica (MACS) (DPBS, 2 mM di acido etilendiammina tetraacetico, 0,5% di albumina sierica bovina, 10 μg/mL di penicillina-streptomicina) nel volume desiderato (90 μL per 10-7 cellule).
2. Aggiungere 10 μl di microsfere CD117+ per 10⁷ cellule. Mescolare bene, proteggere dalla luce e incubare a 4 °C per 15 minuti.
3. Preparare la colonna MACS LS posizionando la colonna nel campo magnetico e risciacquandola con tampone MACS.
4. Lavare le cellule del passaggio 3.2 con un volume appropriato di tampone MACS (almeno il doppio del volume) e centrifugare a 300 × g per 10 minuti.
5. Aspirare completamente il surnatante. Risospendere il pellet in modo che la concentrazione finale sia di 10-8 celle in 500 μL di tampone MACS.
6. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna LS. Lavare con 3 volte con 3 ml di tampone MACS.
   NOTA: Una colonna LS può contenere fino a 10⁸ celle marcate e 2 × 10⁹ celle totali.
7. Rimuovere la colonna dal separatore magnetico e posizionarla in una provetta di raccolta adatta. Aggiungere 5 mL di tampone MACS e sciacquare immediatamente le cellule marcate magneticamente spingendo con decisione lo stantuffo nella colonna.
8. Pellettare le celle a 300 × g per 10 min. Aspirare completamente il surnatante.
9. Risospendere le cellule in 100 μL di tampone MACS per 10-7 cellule e aggiungere gli anticorpi coloranti per il lignaggio (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) e Sca-1.
   NOTA: L'utilizzo di 30 topi donatori (di 12 settimane) produrrà in media 100-180 × 10⁶ cellule.
10. Mescolare bene, proteggere dalla luce e incubare a 4 °C per 20 minuti.
11. Lavare le cellule aggiungendo 5-10 mL di tampone MACS e centrifugare a 300 × g per 10 minuti. Aspirare completamente il surnatante.
12. Risospensione fino a 10⁸ cellule in 500 μL di tampone MACS
13. Filtrare le cellule con un filtro cellulare da 70 μm ed eseguire il FACS per la popolazione Sca1+ di lignaggio.
    NOTA: Circa l'1,8-2,6% della popolazione dovrebbe essere di lignaggio-Sca1+.
14. Raccogliere le cellule nel terreno di coltura LSK (100 μl per 10.000 cellule): terreno di espansione privo di siero, 100 ng/mL di trombopoietina, fattore di cellule staminali di topo, ligando tirosin-chinasi 3 correlato a Fms e IL-7 con 100 μg/mL di penicillina-streptomicina.
15. Celle a pellet a 300 × g per 10 min. Aspirare completamente il surnatante.

4. Trasduzione e coltura di LSK per generare cellule di controllo e knockout

1. Risospendere le cellule nel terreno di coltura LSK.
2. Semina di 10.000 cellule per pozzetto in piastre di coltura tissutale (TC) a fondo piatto da 96 pozzetti in terreno di coltura LSK.
3. Incubare per una notte a 37 °C con il 5% di CO₂ e il 95% di umidità in condizioni asettiche.
4. Preparare 50 μg/mL di soluzione di retronectina in DPBS e aggiungere 300 μL a ciascun pozzetto di una piastra di polistirene a 24 pozzetti non trattata con TC. Incubare per una notte a 4 °C.
5. Il giorno successivo, scartare la soluzione di retronectina, sciacquare la piastra rivestita con 300 μL di DPBS e ripetere.
6. Trasferire 50.000 cellule LSK in 500 μL di terreno (5 pozzetti dalla piastra da 96 pozzetti al passaggio 4.2) in ciascun pozzetto rivestito di retronectina della piastra di polistirene a 24 pozzetti dal passaggio 4.4.Utilizzare altri 100 μL di terreno LSK per 5 pozzetti per risciacquare e raccogliere le cellule in eccesso rimaste nella piastra a 96 pozzetti. Assicurarsi che 600 μl sia il volume per pozzetto nella piastra a 24 pozzetti dopo questo passaggio (5 × pozzetti da 100 μl dalla piastra a 96 pozzetti + 100 μl utilizzati per lavare quei 5 pozzetti).
   NOTA: Dopo il trasferimento, guardare al microscopio la piastra a 24 pozzetti ora vuota per confermare che tutte le cellule sono state raccolte. Utilizzare il terreno LSK per raccogliere le cellule che non sono state trasferite per ridurre al minimo la perdita di cellule da questa piccola popolazione.
7. Aggiungere 300 μl di surnatante virale a ciascun pozzetto e agitare la piastra a un valore di impostazione di 500 per 5 minuti. Centrifugare il piatto a 600 × g e 37 °C per 20 min. Utilizzare almeno 5 × 10⁶ particelle virali per ml.
   NOTA: In questo studio è stato utilizzato un vettore modificato da pLentiPuro, in cui l'elemento di resistenza alla puromicina è stato scambiato con VexGFP. Il virus è stato aggiunto con una molteplicità di infezioni di 50-100.
8. Incubare per 1 ora. Aggiungere 500 μl di terreno LSK preriscaldato.
9. Incubare per 2 giorni a 37 °C con il 5% di CO₂ e il 95% di umidità in condizioni asettiche.

5. Irradiazione animale per prepararsi all'attecchimento delle cellule staminali del donatore

1. Dopo 2 giorni di incubazione, irradiare gli animali riceventi con 475 cGy due volte a intervalli di 4 ore. Dopo il secondo ciclo di irradiazione, mettere gli animali in gabbie autoclavate e trattarli come animali immunodeficienti per 12 settimane. I topi hanno ricevuto arricchimento, idrogel e monitoraggio a bordo gabbia per fornire cure di supporto e interventi secondo necessità. I topi possono ricevere cibo o acqua antibiotici oltre a cure di supporto e metodi di intervento.
   NOTA. I dosaggi di irradiazione possono differire a seconda degli irradiatori. Eseguire una titolazione della dose dell'irradiatore per identificare il dosaggio migliore. Dosi comprese tra 700 e 1300 cGy per i topi C57Bl/6 si sono dimostrate efficaci in vari esempi di letteratura¹⁷. Selezionare 3-4 dosi in questo intervallo e valutare 5 topi per dose per la sopravvivenza e l'attecchimento. Se l'attecchimento non ha successo o la dose di radiazioni è troppo alta, i topi non vivranno oltre le 3 settimane dopo l'attecchimento. A 4 settimane dall'attecchimento, dissanguare i topi sopravvissuti per valutare l'attecchimento mediante FACS. Eseguiamo prelievi di sangue retro-orbitale (RO) di ~50-100 μL per topo per valutare l'attecchimento. I topi erano sotto anestesia (isoflurano al 2-3%) durante la raccolta e hanno ricevuto lubrificante oculare e 1,0 ml di soluzione fisiologica sottocutanea come terapia di supporto dopo la raccolta del sangue RO.

6. Preparazione e iniezione delle cellule in animali riceventi irradiati

1. Estrarre le cellule da ciascun pozzetto dal passaggio 4.9, mantenendo i gruppi separati ora che le cellule sono state trasdotte con gRNA diversi, e pellettare a 300 × g per 10 minuti.
2. Risospendere le cellule nel tampone MACS, filtrare con un colino da 70 μm e ordinare la popolazione VexGFP+.
   NOTA: Circa il 10-15% delle celle dovrebbe essere VexGFP+.
3. Pellettare le celle a 300 × g per 10 min. Risospenderli nella soluzione salina bilanciata di Hank: 5.000 o più cellule per topo in 200 μL.
   NOTA: HBSS è di grado non farmaceutico. Si può anche prendere in considerazione l'utilizzo di una soluzione salina sterile di grado farmaceutico per iniezione.
4. Iniettare le cellule per via endovenosa 3 ore dopo l'ultima dose di irradiazione.
   NOTA: Dodici settimane dopo, i topi avranno un sistema immunitario completamente impiantato e potranno essere arruolati in modelli in vivo.

7. Modello di colite indotta da anticorpi agonisti CD40 in topi wild-type

NOTA: Pesare e valutare gli animali ogni giorno. Fornire cure di supporto secondo necessità: 1,0 ml di soluzione sottocutanea di cloruro di sodio con una perdita di peso del 10% o se sono disidratati. Il controllo positivo per questo modello è l'anti-p40 dosato per via intraperitoneale a 25 mg/kg due volte alla settimana a partire dal giorno -1.

NOTA: In questo studio, i gruppi sperimentali includevano il controllo naïve, il controllo del veicolo (negativo) e i gruppi di controllo anti-p40 (positivi). Insieme, questi gruppi controllano il normale comportamento del modello di colite indotta da anticorpi agonisti CD40. Gruppi vettore, SgNone e SgRNA: i controlli vettoriali per il vettore lentivirale comune, SgNone è un controllo guida non mirato criptato e i gruppi SgRNA sono i gruppi di "trattamento" che presentano una ridotta espressione del gRNA bersaglio.

1. Giorno 0: Iniettare l'anticorpo agonista CD40 a 10 mg/kg per via intraperitoneale in DPBS in tutti gli animali, ad eccezione del controllo naïve.
2. Giorni 3 e 6: Eseguire la videoendoscopia per valutare la progressione della malattia come descritto in precedenza¹⁶.
   1. Anestetizzare i topi con isoflurano al 2-3%. Fornire supporto termico tramite il meccanismo interno della macchina per anestesia e/o il cuscinetto termico esterno durante il recupero.
   2. Una volta che i topi sono sotto anestesia, somministrare un clistere DPBS (senza calcio e magnesio) per preparare il colon per l'endoscopia.
      NOTA: Per eseguire un clistere sono necessari circa 1-2 ml.
   3. Dopo un clistere e durante l'anestesia, spostare il mouse sul cono del naso della macchina per anestesia.
   4. Inserire delicatamente l'endoscopio nel colon, avanzare lentamente verso il colon prossimale mantenendo la telecamera centrata e il colon gonfiato d'aria (utilizzando la pompa dell'aria inclusa o collegando un tubo/siringa per gonfiare manualmente), quindi estrarre lentamente l'endoscopio e raccogliere un video e immagini a 3 cm, 2 cm e 1 cm dall'ano.
      NOTA: Per ridurre al minimo l'irritazione del colon, è possibile aggiungere lubrificante sterile alla punta dell'endoscopio.
   5. Assegna un punteggio a ciascuna immagine individualmente in base al pattern vascolare e all'ispessimento della mucosa come descritto nella Tabella 1. Combina i punteggi delle 3 immagini per mouse per assegnare un punteggio di somma a ciascun animale.
3. Giorno 7: Eutanasia di tutti i topi per sovradosaggio di isoflurano o camera di CO₂ e raccogliere quanto più sangue possibile mediante puntura cardiaca per il siero. Pesare la milza per misurare la splenomegalia e raccogliere per la citometria a flusso e raccogliere il colon per l'istopatologia.
   NOTA: Sezioni di tessuto del colon di topo fissate in formalina e incluse in paraffina sono state preparate e utilizzate per l'immunoistochimica (IHC) come precedentemente descritto da Wang et al¹⁹.

Risultati

Seguendo la procedura sopra descritta, sono stati generati topi che esprimono gRNA mirato a CD40. Entro la settimana 2, le cellule B, i macrofagi CD11b+ e le cellule dendritiche CD11c+ (DC) sono state innestate (Figura 2). Le cellule T tuttavia, come previsto in base alla letteratura precedente¹⁸, hanno impiegato più tempo per l'attianto completo e hanno richiesto 12 settimane dopo l'attecchimento per...

Discussione

I risultati qui mostrati introducono una nuova piattaforma di editing genomico basata su CRISPR/Cas9 in grado di studiare la funzione genica in questo modello di colite indotta da anticorpi agonisti CD40. Lo smistamento cellulare ha arricchito il pool di cellule LSK geneticamente modificate, con conseguente riduzione di oltre il 90% dell'espressione di CD40 negli animali ricostituiti in soli 4 mesi. Inoltre, la ridotta espressione di CD40 all'interno del sistema immunitario ha avuto un p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture plates	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µm filter unit	Millipore	#SLHV013SL
0.6 mL microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-060-C-S
1.5 mL Eppendorf Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15mL Conical	VWR	21008-918
23 G Needle	VWR	#305145
24 Well Non-TC Plates	Falcon	#351147
24-Well TC Plates	Falcon	#353047
50 mL Conical tube	VWR	21008-951
5 mL Syringe	BD Biosciences	#309647
70 µm Filter	Miltenyi	#130-098-462
96-Well Flat Bottom Plates	Corning	#3599
96-Well U-Bottom Plates	Corning/Costar	#3365
Anesthesia Machine	VetEquip - COMPAC5	#901812
Anti-CD40 Agonist monoclonal antibody	BioXcell	BE-0016
Anti-p40 monoclonal antibody	BioXcell	BE-0051
B220 PE Antibody	BioLegend	#103208
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Mice	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 background
CD117+ Beads	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE Antibody	BioLegend	#101208
CD3 PE Antibody	BD Biosciences	#553240
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrifuge
Countertop Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
Endoscope	Karl Storz	N/A	Custom Coloview Tower
Flow cytometer	BD Biosciences	FACS Aria II
Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE Antibody	BD Biosciences	#553128
Hank's balanced salt solution (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Incubator	Binder	#9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	#6679401710
LS Column	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy Mice	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6 background
mouse stem cell factor (mSCF)	PeproTech	#250-03
Sodium chloride (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM serum-free media	Invitrogen	#31985-070
Penicillin-streptomycin (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Plate Shaker	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene (10 µg/µL)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	#00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Antibody	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE Antibody	eBioscience	#12-5921
Thrombopoietin (TPO)	PeproTech	#315-14
X-ray Irradiator	Precision X-Ray	X-Rad 320