Исследование функции гена-мишени в модели индуцированного агонистическим антителом CD40 колита с использованием технологий на основе CRISPR/Cas9

Резюме

В данной статье мы описываем методологию нокаутирования интересующего гена в иммунной системе с использованием технологий на основе кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/CRISPR-ассоциированной эндонуклеазы (Cas9), а также оценку этих мышей в модели агонистического колита, индуцированного кластером дифференцировки 40 (CD40).

Аннотация

Иммунная система функционирует для защиты человека от чужеродных захватчиков, таких как бактерии и вирусы. Однако нарушения иммунной системы могут привести к аутоиммунным заболеваниям, воспалительным заболеваниям и раку. Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК) – болезнь Крона (БК) и язвенный колит (ЯК) – это хронические заболевания, характеризующиеся рецидивирующим воспалением кишечника. Хотя ВЗК наиболее распространена в западных странах (1 на 1000), уровень заболеваемости растет во всем мире. Благодаря исследованиям ассоциаций ученые связали сотни генов с патологией ВЗК. Тем не менее, сложная патология, лежащая в основе ВЗК, и большое количество потенциальных генов создают значительные проблемы в поиске наилучших терапевтических мишеней. Кроме того, инструменты, необходимые для функциональной характеристики каждой генетической ассоциации, вводят множество ограничивающих скорость факторов, таких как генерация генетически модифицированных мышей для каждого гена. Для исследования терапевтического потенциала генов-мишеней была разработана модельная система с использованием кластеризованных регулярно чередующихся коротких палиндромных повторов (CRISPR)/CRISPR-ассоциированной эндонуклеазы (Cas9) и кластерного агонистического антитела дифференцировки 40 (CD40). Настоящее исследование показывает, что CRISPR/Cas9-опосредованное редактирование в иммунной системе может быть использовано для изучения влияния генов in vivo. Ограниченный кроветворным компартментом, этот подход надежно редактирует полученную восстановленную иммунную систему. Мыши, отредактированные с помощью CRISPR/Cas9, генерируются быстрее и стоят гораздо дешевле, чем традиционные генетически модифицированные мыши. Кроме того, редактирование мышей с помощью CRISPR/Cas9 имеет значительные научные преимущества по сравнению с генерированием и разведением генетически модифицированных мышей, такие как способность оценивать мишени, которые являются эмбрионально летальными. Используя CD40 в качестве модельной мишени в модели колита, индуцированного агонистическими антителами CD40, данное исследование демонстрирует осуществимость этого подхода.

Введение

Аутоиммунные заболевания относятся к состояниям, при которых иммунная система пациента атакует собственные клетки и органы, что приводит к хроническому воспалению и повреждению тканей. На сегодняшний день описано около 100 различных типов аутоиммунных заболеваний, поражающих 3-5% человеческой популяции¹. Многие аутоиммунные заболевания, включая системную красную волчанку и ВЗК, не имеют эффективного лечения и представляют собой значительные неудовлетворенные медицинские потребности. В настоящее время ВЗК поражает около 1,5 миллиона человек только в США и является разрушительным заболеванием, характеризующимся прогрессирующим, стойким и рецидивирующим воспалением кишечника, которое не имеет доступного лечения. Разгадка основного патогенеза и патофизиологии необходима для разработки новых стратегий лечения и профилактики, которые требуются пациентам с ВЗК ^2,3.

Более 230 различных локусов ВЗК были идентифицированы с помощью полногеномного ассоциативного анализа (GWAS)⁴. Несмотря на то, что эти ассоциации позволили выявить новые гены, которые потенциально играют важную роль в ключевых механизмах и путях ВЗК, было изучено лишь несколько генов из этих локусов. Некоторые гены были вовлечены в определенные пути. Например, чувствительный к микробам путь был связан с нуклеотид-связывающим белком 2, содержащим домен олигомеризации 2 (NOD2); путь аутофагии был связан с аутофагией, связанным с 16 как 1 (ATG16L1), иммунитет-ассоциированным семейством GTPase M (IRGM) и членом семейства 9 домена рекрутирования каспазы (CARD9); и провоспалительный путь был связан с интерлейкиновыми (IL)-23-управляемыми Т-клеточными^{ответами 4}. Различные мышиные модели in vivo были использованы для функциональной характеристики генов, идентифицированных с помощью GWAS ^5,6.

Одной из ключевых моделей, используемых для изучения патогенеза ^7,8 ВЗК, является CD40-модель колита, которая индуцирует врожденное иммунное воспаление кишечника после инъекции агонистического антитела CD40 иммунодефицитным (Т- и В-клеточным) мышам. В первую очередь используется для изучения вклада врожденного иммунитета в развитие ВЗК, в основном макрофагов и дендритных клеток⁹, поэтому неясно, может ли заболевание быть индуцировано у полностью иммунокомпетентных мышей дикого типа (WT). В дополнение к животным моделям, для функциональной характеристики гена также требуются геноспецифические инструменты, включая химические соединения и биологические препараты. Что еще более важно, генетически модифицированные животные играют важную роль в раскрытии функции конкретного гена. Тем не менее, стратегии, обычно используемые для инъекции и разведения генетически модифицированных эмбрионов мышей, часто занимают более года и влекут за собой значительные финансовые затраты. Этот процесс ограничения скорости представляет собой значительную проблему в стремлении выяснить функции генов, связанных с ВЗК, идентифицированных GWAS.

Представленный здесь протокол представляет собой жизнеспособную альтернативу разведению генетически модифицированных мышей. Во-первых, как показано на рисунке 1 , из костного мозга мышей с нокином Cas9 (KI), несущих специфический аллель (CD45.2), выделяют линейно-отрицательные, положительные на антиген стволовых клеток, положительные на рецептор тирозинкиназы Kit (lineage-Sca1+c-Kit+ или LSK) из костного мозга мышей с нокином Cas9 (KI), чтобы обеспечить отслеживание иммунных клеток донора. Затем эти клетки подвергаются воздействию лентивирусов, несущих различные направляющие РНК (гРНК) и флуоресцентный маркер, фиолетово-возбуждаемый зеленый флуоресцентный белок (VexGFP), чтобы можно было отслеживать трансдуцированные клетки. Через два дня клетки VexGFP+ сортируют и вводят облученным мышам-реципиентам Ly5.1 Pep Boy, которые представляют собой мышей C57Bl/6, несущих аллель CD45.1, позволяющий отслеживать иммунные клетки реципиента. Двенадцать недель спустя иммунная система полностью восстанавливается, и мышей можно регистрировать в моделях in vivo.

В дополнение к экономии средств и более быстрому производству по сравнению с генерированием и разведением генетически модифицированных животных, эта методология идеально подходит для мишеней, которые являются эмбрионально летальными, поскольку она специально нацелена на гемопоэтический компартмент. Кроме того, для мишеней, для которых нет доступных инструментов, таких как антитела, эта система обеспечивает осуществимый подход. Таким образом, для решения описанных до сих пор проблем была разработана платформа для редактирования генома in vivo на основе CRISPR/Cas9 для быстрого создания генетически модифицированных моделей животных 10,11,12,13,14. Это исследование демонстрирует, что воспаление кишечника у мышей WT C57Bl/6 может быть вызвано агонистическим антителом CD40. CD40 является ключевым регулятором заболевания в этой модели и поэтому был использован в качестве модельной мишени для валидации нокаута и потери функции гена на основе CRISPR/Cas9.

протокол

Все эксперименты на животных, проводимые в соответствии с этим протоколом, должны быть одобрены соответствующим Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC). Все описанные здесь процедуры были одобрены IACUC компании AbbVie.

1. Получение необходимых лентивирусов и закупка животных-доноров и реципиентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Таблица материалов содержит информацию об источнике и номере заказа для всех животных, инструментов и реагентов, используемых в этом протоколе.

1. Сконструируйте плазмиды с помощью вектора lentiGuide-puro, модифицированного в VexGFP или mCherry.
   1. Клонируйте скремблированную нецелевую гРНК (SgNone) или гРНК, нацеленную на CD40, в модифицированный вектор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании последовательности для каждой гРНК были следующими: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTCTCTCCAC; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA; и SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
   2. Получить чечевичные вирусные частицы в соответствии с описанием ранее¹⁵.
      1. Котрансфектируйте гРНК-кодирующие плазмиды в клетки 293T с плазмидами упаковки VSV-G и pLEX.
      2. Питательную среду меняют через 18 ч после трансфекции, а надосадочную жидкость, содержащую вирус, собирают через 24-48 ч после смены среды.
      3. Чтобы оценить эффективность CD40 гРНК, сгенерируйте стабильную CD40-293T клеточную линию путем трансфекции плазмиды pcDNA3.1, кодирующей CD40.
   3. Трансфицируйте клетки с помощью описанных лентивирусов и оцените их с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресценцией (FACS) через две недели.
      Примечание: Мышей Cas9 KI использовали в качестве донорских мышей. Убедитесь, что мыши Cas9 KI находятся на фоне C57Bl/6 (и экспрессируют аллель CD45.2) при использовании мышей C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy (экспрессирующих аллель CD45.1) в качестве реципиентов, чтобы избежать РТПХ и отслеживать донорские и реципиентные клетки.
2. Спланируйте эксперимент. Для нокаута гена (KO) используйте 3-6 гРНК на ген. Для каждой гРНК подготовьте на 20% больше мышей-реципиентов, чтобы учесть потери животных во время и после трансплантации.
   Примечание: Модель колита, индуцированного агонистическими антителами CD40, требует минимум 8 мышей в группе для статистической мощности. Следовательно, в этом исследовании было получено 10 мышей на каждую гРНК. Количество мышей, необходимых для других моделей in vivo, будет варьироваться в зависимости от используемой модели.
3. Используйте однополых донорских и реципиентных мышей в возрасте 8-12 недель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышей усыпляли в соответствии с утвержденными IACUC рекомендациями с использованием минимум 5% изофлурана и подтверждали вывих шейки матки в качестве вторичного метода.

2. Забор костного мозга и подготовка к сортировке клеток

1. С помощью щипцов и ножниц соберите кости у каждой донорской мыши (бедренной кости, большеберцовой кости, плечевой и локтевой костей), осторожно удалив как можно больше мышц/тканей.
2. Проколите дно микроцентрифужной пробирки объемом 0,6 мл иглой 23 G и поместите пробирку внутрь центрифужной пробирки объемом 1,5 мл. Сделайте по 2 сета на одно животное.
3. Разрежьте один конец костей и поместите 4-8 костей внутрь микроцентрифужной пробирки открытыми концами к отверстию иглы 23 G.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Количество костей в трубке зависит от кости, например, подойдет 8 большеберцовых костей, плечевых и локтевых костей или 4 бедренных костей.
4. Центрифугируйте пробирки (с микроцентрифужной пробиркой объемом 0,6 мл, содержащей кости внутри центрифужной пробирки объемом 1,5 мл) при давлении 300 × г в течение 2 минут при комнатной температуре (RT).
5. Выбросьте микроцентрифужную пробирку объемом 0,6 мл, которая теперь содержит кости без костного мозга, оставив только центрифужную пробирку объемом 1,5 мл, теперь полную костного мозга. Добавьте 1 мл буфера для лизиса эритроцитов (содержащего хлорид аммония) в каждую центрифужную пробирку и повторно суспендируйте клеточную гранулу с помощью пипетирования. Инкубировать при RT в течение 1 мин. При необходимости повторите этап лизиса.
6. Перенесите клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и добавьте фосфатно-солевой буфер Дульбекко (DPBS) без кальция и магния (по крайней мере, в два раза больше объема клеточной суспензии) для нейтрализации буфера для лизиса. Пеллетные ячейки по 300 × г в течение 5 мин. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость.
7. Загрузите фильтр 70 μм в коническую трубку объемом 50 мл и отфильтруйте ячейки через них, используя DPBS для промывки трубки и фильтра. Выбросьте фильтр и посчитайте ячейки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 30 донорских мышей (в возрасте 12 недель) даст в среднем 200-300 × 10⁶ клеток.

3. Сортировка клеток для выделения клеток LSK для трансдукции

1. Повторно суспендируют клетки, подсчитанные на шаге 2.7, в буфере для магнитной сортировки клеток (MACS) (DPBS, 2 мМ этилендиамина тетрауксусной кислоты, 0,5% бычьего сывороточного альбумина, 10 мкг/мл пенициллин-стрептомицина) в желаемом объеме (90 мкл на 10⁷ клеток).
2. Добавьте 10 мкл гранул CD117+ на 10⁷ клеток. Хорошо перемешайте, защитите от света и выдерживайте при температуре 4 °C в течение 15 минут.
3. Подготовьте колонку MACS LS, поместив колонку в магнитное поле и промыв ее буфером MACS.
4. Промойте ячейки на шаге 3.2 подходящим объемом буфера MACS (как минимум в два раза больше вашего объема) и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 минут.
5. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте гранулу так, чтобы конечная концентрация составила 10⁸ клеток в 500 мкл буфера MACS.
6. Нанесите клеточную суспензию на колонку LS. Промойте 3 раза с 3 мл буфера MACS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Один столбец LS может занимать до 10⁸ помеченных ячеек и 2 × 10⁹ всего ячеек.
7. Снимите колонку с магнитного сепаратора и поместите ее в подходящую сборную трубку. Добавьте 5 мл буфера MACS и немедленно промойте ячейки с магнитной меткой, сильно вдавливая поршень в колонку.
8. Гранулируйте ячейки по 300 × г в течение 10 мин. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость.
9. Повторно суспендируйте клетки в 100 мкл буфера MACS на 10-7 клеток и добавьте окрашивающие антитела к линии (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) и Sca-1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Использование 30 донорских мышей (в возрасте 12 недель) даст в среднем 100-180 × 10-6 клеток.
10. Хорошо перемешайте, защитите от света и выдерживайте при температуре 4 °C в течение 20 минут.
11. Промойте ячейки, добавив 5-10 мл буфера MACS, и центрифугируйте при 300 × г в течение 10 минут. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость.
12. Повторная суспендия до 10⁸ ячеек в 500 мкл буфера MACS
13. Отфильтруйте клетки с помощью клеточного фильтра 70 мкм и выполните FACS для популяции lineage-Sca1+.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно 1,8-2,6% населения должны быть по линии Sca1+.
14. Соберите клетки в культуральную среду LSK (100 мкл на 10 000 клеток): бессывороточную расширяющую среду, тромбопоэтин 100 нг/мл, фактор стволовых клеток мыши, лиганд тирозинкиназы 3, связанный с Fms, и IL-7 с концентрацией 100 мкг/мл пенициллин-стрептомицина.
15. Пеллетные ячейки по 300 × г в течение 10 мин. Полностью аспирируйте надосадочную жидкость.

4. Трансдукция и культивирование LSK для получения контрольных и нокаутных клеток

1. Ресуспендируйте клетки в культуральную среду LSK.
2. Засейте 10 000 клеток в лунку в 96-луночные планшеты для культуры тканей с плоским дном (TC) в культуральную среду LSK.
3. Инкубировать в течение ночи при температуре 37 °C с 5%_CO2 и влажностью 95% в асептических условиях.
4. Приготовьте 50 г/мл раствора ретронектина в DPBS и добавьте по 300 мл в каждую лунку 24-луночного полистирольного планшета, не обработанного ТС. Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
5. На следующий день выбросьте раствор ретронектина, промойте покрытую пластину 300 мкл DPBS и повторите.
6. Перенесите 50 000 ячеек LSK в 500 мкл среды (5 лунок из 96-луночного планшета на шаге 4.2) в каждую покрытую ретронектином лунку 24-луночного полистирольного планшета, начиная с шага 4.4. Используйте дополнительные 100 мкл среды LSK на 5 лунок для промывки и сбора любых дополнительных элементов, оставшихся в 96-луночном планшете. Убедитесь, что объем на лунку в 24-луночном планшете составляет 600 мкл после этого шага (5 × 100 мкл лунок из 96-луночного планшета + 100 μл, использованных для промывки этих 5 лунок).
   ПРИМЕЧАНИЕ: После переноса посмотрите под микроскопом на пустую 24-луночную пластину, чтобы убедиться, что все клетки были собраны. Используйте среду LSK для сбора клеток, которые не были перенесены, чтобы свести к минимуму потерю клеток из этой небольшой популяции.
7. Добавьте по 300 мкл антивирусной надосадочной жидкости в каждую лунку и встряхивайте планшет при заданном значении 500 в течение 5 минут. Вращайте тарелку при температуре 600 × г и 37 °C в течение 20 минут. Используйте не менее 5 × 10-6 вирусных частиц на мл.
   Примечание: В данном исследовании использовался вектор, модифицированный из pLentiPuro, в котором элемент устойчивости к пуромицину был заменен на VexGFP. Вирус добавлялся при кратности заражения 50-100.
8. Инкубировать в течение 1 ч. Добавьте 500 μЛ предварительно подогретой среды LSK.
9. Выдерживать в течение 2 суток при температуре 37 °C с 5%_CO2 и влажностью 95% в асептических условиях.

5. Облучение животных для подготовки к приживлению донорских стволовых клеток

1. Через 2 дня инкубации облучают животных-реципиентов 475 сГр дважды с интервалом 4 ч. После второго раунда облучения поместите животных в автоклавные клетки и обращайтесь с ними как с животными с иммунодефицитом в течение 12 недель. Мыши получали обогащение, гидрогель и мониторинг у клетки для обеспечения поддерживающей терапии и вмешательства по мере необходимости. Мыши могут получать пищу или воду с антибиотиками в дополнение к поддерживающей терапии и методам вмешательства.
   ЗАМЕТКА. Дозы облучения могут отличаться при разных облучателях. Выполните титрование дозы облучателя, чтобы определить наилучшую дозировку. Дозы от 700 до 1300 сГр для мышей C57Bl/6 признаны эффективными в различных литературных^{примерах}. Выберите 3-4 дозы в этом диапазоне и оцените 5 мышей на каждую дозу на предмет выживаемости и приживления. Если приживление не увенчалось успехом или доза облучения слишком высока, мыши не проживут дольше 3 недель после приживления. Через 4 недели после приживления проведите обескровливание выживших мышей для оценки приживления с помощью FACS. Мы выполняем забор ретроорбитальной крови (RO) в объеме ~50-100 мкл на мышь для оценки приживления. Мыши находились под наркозом (2-3% изофлуран) во время сбора и получали глазную смазку и 1,0 мл подкожного раствора в качестве поддерживающей терапии после забора крови РО.

6. Подготовка клеток и инъекция облученным животным-реципиентам

1. Пипетируйте клетки из каждой лунки на шаге 4.9, сохраняя группы отдельно теперь, когда клетки были трансдуцированы различными гРНК, и гранулируйте их в дозе 300 × г в течение 10 минут.
2. Восстановите суспендию ячеек в буфере MACS, отфильтруйте с помощью сетчатого фильтра 70 мкм и отсортируйте популяцию VexGFP+.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Примерно 10-15% клеток должны быть VexGFP+.
3. Гранулируйте ячейки по 300 × г в течение 10 мин. Ресуспендируйте их в сбалансированном солевом растворе Хэнка: 5000 или более клеток на мышь в 200 мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS не относится к фармацевтическому классу. Вы также можете рассмотреть возможность использования стерильного физиологического раствора фармацевтического класса для инъекций.
4. Введите клетки внутривенно через 3 ч после последней дозы облучения.
   Примечание: Через двенадцать недель у мышей будет полностью привитая иммунная система, и их можно будет регистрировать в моделях in vivo.

7. Модель колита, индуцированного агонистическими антителами CD40, у мышей дикого типа

ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно взвешивайте и оценивайте животных. При необходимости обеспечьте поддерживающую терапию: 1,0 мл подкожного раствора натрия хлорида при 10% потере веса или при обезвоживании. Положительным контролем для этой модели является введение анти-p40 внутрибрюшинно в дозе 25 мг/кг два раза в неделю, начиная с -1 дня.

Примечание: В этом исследовании экспериментальные группы включали наивный контроль, контрольную группу с носителем (отрицательный) и контрольную группу против p40 (положительную). Вместе эти группы контролируют нормальное поведение модели колита, индуцированного агонистическими антителами CD40. Группы Vector, SgNone и SgRNA: Векторный контроль для общего лентивирусного вектора, SgNone представляет собой зашифрованный нецелевой контроль, а группы SgРНК являются «лечебными» группами с пониженной экспрессией целевой гРНК.

1. День 0: Введение агонистического антитела CD40 в дозе 10 мг/кг внутрибрюшинно в DPBS всем животным, за исключением неактивного контроля.
2. Дни 3 и 6: Проведите видеоэндоскопию для оценки прогрессирования заболевания, как описано ранее¹⁶.
   1. Обезболите мышей 2-3% изофлураном. Обеспечьте тепловую поддержку с помощью механизма аппарата внутренней анестезии и/или внешней грелки во время восстановления.
   2. После того, как мыши будут под наркозом, введите клизму DPBS (без кальция и магния), чтобы подготовить толстую кишку к эндоскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения клизмы требуется примерно 1-2 мл.
   3. После клизмы и находясь под наркозом, переместите мышь к носовому конусу наркозного аппарата.
   4. Осторожно введите эндоскоп в толстую кишку, медленно продвигайтесь к проксимальному отделу ободочной кишки, удерживая камеру в центре и накачивая толстую кишку воздухом (используя либо прилагаемый воздушный насос, либо прикрепляя трубку/шприц для ручного надувания), затем медленно извлеките эндоскоп и соберите видео и изображения на расстоянии 3 см, 2 см и 1 см от анального отверстия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму раздражение толстой кишки, на кончик эндоскопа можно добавить стерильную смазку.
   5. Оценивайте каждое изображение индивидуально в зависимости от сосудистого рисунка и утолщения слизистой оболочки, как описано в таблице 1. Объедините баллы с 3 изображений для каждой мыши, чтобы присвоить суммарный балл каждому животному.
3. День 7: Усыпьте всех мышей путем передозировки изофлурана или камеры с_CO2 и соберите как можно больше крови с помощью пункции сердца для сыворотки. Взвесьте селезенку для измерения спленомегалии и соберите для проточной цитометрии, а также соберите толстую кишку для гистопатологии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированные формалином и залитые парафином срезы тканей толстой кишки мыши были подготовлены и использованы для иммуногистохимии (ИГХ), как описано ранее в Wang et al¹⁹.

Результаты

После описанной выше процедуры были получены мыши, экспрессирующие CD40-таргетную гРНК. Ко 2-й неделе были привиты В-клетки, макрофаги CD11b+ и дендритные клетки (ДК) CD11c+ (рис. 2). Однако, как и ожидалось на основе предыдущей литературы

Обсуждение

Показанные здесь результаты представляют собой новую платформу для редактирования генома на основе CRISPR/Cas9, способную исследовать функцию генов в этой модели колита, индуцированного агонистическими антителами CD40. Сортировка клеток обогатила пул генетически модифиц...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture plates	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µm filter unit	Millipore	#SLHV013SL
0.6 mL microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-060-C-S
1.5 mL Eppendorf Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15mL Conical	VWR	21008-918
23 G Needle	VWR	#305145
24 Well Non-TC Plates	Falcon	#351147
24-Well TC Plates	Falcon	#353047
50 mL Conical tube	VWR	21008-951
5 mL Syringe	BD Biosciences	#309647
70 µm Filter	Miltenyi	#130-098-462
96-Well Flat Bottom Plates	Corning	#3599
96-Well U-Bottom Plates	Corning/Costar	#3365
Anesthesia Machine	VetEquip - COMPAC5	#901812
Anti-CD40 Agonist monoclonal antibody	BioXcell	BE-0016
Anti-p40 monoclonal antibody	BioXcell	BE-0051
B220 PE Antibody	BioLegend	#103208
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Mice	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 background
CD117+ Beads	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE Antibody	BioLegend	#101208
CD3 PE Antibody	BD Biosciences	#553240
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrifuge
Countertop Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
Endoscope	Karl Storz	N/A	Custom Coloview Tower
Flow cytometer	BD Biosciences	FACS Aria II
Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE Antibody	BD Biosciences	#553128
Hank's balanced salt solution (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Incubator	Binder	#9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	#6679401710
LS Column	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy Mice	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6 background
mouse stem cell factor (mSCF)	PeproTech	#250-03
Sodium chloride (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM serum-free media	Invitrogen	#31985-070
Penicillin-streptomycin (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Plate Shaker	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene (10 µg/µL)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	#00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Antibody	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE Antibody	eBioscience	#12-5921
Thrombopoietin (TPO)	PeproTech	#315-14
X-ray Irradiator	Precision X-Ray	X-Rad 320