Untersuchung der Funktion des Zielgens in einem CD40-agonistischen Antikörper-induzierten Colitis-Modell unter Verwendung von CRISPR/Cas9-basierten Technologien

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir die Methodik zur Ausschaltung eines Gens, das für das Immunsystem von Interesse ist, unter Verwendung von Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated endonuclease (Cas9)-basierten Technologien und die Bewertung dieser Mäuse in einem Cluster von Differenzierungs-40 (CD40) agonistischen Antikörper-induzierten Colitis-Modellen.

Zusammenfassung

Das Immunsystem hat die Aufgabe, den Menschen gegen fremde Eindringlinge wie Bakterien und Viren zu verteidigen. Störungen des Immunsystems können jedoch zu Autoimmunität, Entzündungskrankheiten und Krebs führen. Die chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) – Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) – sind chronische Erkrankungen, die durch schubförmige Darmentzündungen gekennzeichnet sind. Obwohl IBD in westlichen Ländern am weitesten verbreitet ist (1 von 1.000), steigen die Inzidenzraten weltweit. Durch Assoziationsstudien haben Forscher Hunderte von Genen mit der Pathologie der CED in Verbindung gebracht. Die aufwendige Pathologie hinter der CED und die hohe Anzahl potenzieller Gene stellen jedoch eine große Herausforderung dar, um die besten therapeutischen Ziele zu finden. Darüber hinaus führen die Werkzeuge, die zur funktionellen Charakterisierung jeder genetischen Assoziation erforderlich sind, viele geschwindigkeitsbegrenzende Faktoren ein, wie z. B. die Erzeugung genetisch veränderter Mäuse für jedes Gen. Um das therapeutische Potenzial von Zielgenen zu untersuchen, wurde ein Modellsystem entwickelt, das auf Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/CRISPR-associated endonuclease (Cas9) basierenden Technologien und einen Cluster von Differenzierungs-40 (CD40) agonistischen Antikörpern verwendet. Die vorliegende Studie zeigt, dass die CRISPR/Cas9-vermittelte Editierung im Immunsystem genutzt werden kann, um den Einfluss von Genen in vivo zu untersuchen. Beschränkt auf das hämatopoetische Kompartiment wird bei diesem Ansatz das resultierende rekonstituierte Immunsystem zuverlässig bearbeitet. CRISPR/Cas9-editierte Mäuse werden schneller erzeugt und sind weitaus kostengünstiger als herkömmliche gentechnisch veränderte Mäuse. Darüber hinaus hat die CRISPR/Cas9-Editierung von Mäusen erhebliche wissenschaftliche Vorteile im Vergleich zur Erzeugung und Zucht genetisch veränderter Mäuse, wie z. B. die Möglichkeit, Ziele zu bewerten, die embryonal letal sind. Unter Verwendung von CD40 als Modellziel im CD40-agonistischen Antikörper-induzierten Colitis-Modell zeigt diese Studie die Machbarkeit dieses Ansatzes.

Einleitung

Autoimmunerkrankungen beziehen sich auf Erkrankungen, bei denen das Immunsystem eines Patienten seine eigenen Zellen und Organe angreift, was zu chronischen Entzündungen und Gewebeschäden führt. Bisher wurden fast 100 verschiedene Arten von Autoimmunerkrankungen beschrieben, von denen 3-5 % der menschlichen Bevölkerung betroffen^{sind 1}. Viele der Autoimmunerkrankungen, einschließlich systemischem Lupus erythematodes und CED, haben keine wirksamen Behandlungen und stellen einen erheblichen ungedeckten medizinischen Bedarf dar. CED, von der derzeit allein in den USA rund 1,5 Millionen Menschen betroffen sind, ist eine verheerende Krankheit, die durch eine fortschreitende, anhaltende und schubförmige Darmentzündung gekennzeichnet ist, für die es keine Heilung gibt. Die Entschlüsselung der zugrunde liegenden Pathogenese und Pathophysiologie ist erforderlich, um die neuartigen Behandlungs- und Präventionsstrategien zu entwickeln, die CED-Patienten benötigen ^2,3.

Über 230 verschiedene IBD-Loci wurden durch genomweite Assoziationsanalysen (GWAS)⁴ identifiziert. Obwohl diese Assoziationen neue Gene aufgeklärt haben, die potenziell wichtige Akteure in den Schlüsselmechanismen und -wegen der CED sind, wurden nur wenige Gene aus diesen Loci untersucht. Einige Gene sind an bestimmten Signalwegen beteiligt. Zum Beispiel wurde der Mikroben-Sensing-Weg mit dem Nukleotid-bindenden Oligomerisierungsdomänen-haltigen Protein 2 (NOD2) in Verbindung gebracht; Der Autophagie-Signalweg wurde mit der Autophagie-bezogenen 16 wie 1 (ATG16L1), der immunitätsbezogenen GTPase-Familie M (IRGM) und dem Caspase-Rekrutierungsdomänen-Familienmitglied 9 (CARD9) in Verbindung gebracht; und der entzündungsfördernde Signalweg wurde mit Interleukin (IL)-23-gesteuerten T-Zell-Antworten in Verbindung gebracht⁴. Verschiedene in vivo Mausmodelle wurden verwendet, um Gene, die durch GWAS^{identifiziert} wurden, funktionell zu charakterisieren ^5,6.

Eines der Schlüsselmodelle zur Untersuchung der IBD-Pathogenese ^7,8 ist das CD40-Modell der Kolitis, das nach der Injektion eines CD40-agonistischen Antikörpers in immundefiziente (T- und B-Zell-) Mäuse eine angeborene Immun-Darmentzündung induziert. Es ist unklar, ob die Krankheit bei vollständig immunkompetenten Wildtyp-Mäusen (WT) induziert werden kann, um den Beitrag der angeborenen Immunität zur Entwicklung von IBD zu untersuchen, hauptsächlich in Makrophagen und dendritischen Zellen⁹. Neben Tiermodellen werden auch genspezifische Werkzeuge für die funktionelle Charakterisierung eines Gens benötigt, darunter chemische Verbindungen und Biologika. Noch wichtiger ist, dass genetisch veränderte Tiere für die Aufdeckung der Funktion eines bestimmten Gens unerlässlich sind. Die Strategien, die typischerweise zur Herstellung genetisch veränderter Mäuse - die Injektion und Zucht von Embryonen - verwendet werden, dauern jedoch oft über ein Jahr und verursachen erhebliche finanzielle Kosten. Dieser geschwindigkeitsbegrenzende Prozess stellt eine große Herausforderung dar, um die Funktionen der von GWAS identifizierten IBD-verwandten Gene aufzuklären.

Das hier vorgestellte Protokoll stellt eine praktikable Alternative zur Zucht gentechnisch veränderter Mäuse dar. Zunächst werden, wie in Abbildung 1 gezeigt, Abstammungs-negative, Stammzellantigen1-positive Rezeptor-Tyrosinkinase-Kit-positive (Lineage-Sca1+c-Kit+ oder LSK) Zellen aus dem Knochenmark von Cas9-Knockin (KI)-Mäusen isoliert, die ein spezifisches Allel (CD45.2) tragen, um die Verfolgung von Immunzellen der Spender zu ermöglichen. Als nächstes werden diese Zellen Lentiviren ausgesetzt, die unterschiedliche Guide-RNAs (gRNAs) und einen fluoreszierenden Marker, das violett-angeregte grün fluoreszierende Protein (VexGFP), tragen, um die Verfolgung von transduzierten Zellen zu ermöglichen. Zwei Tage später werden VexGFP+-Zellen sortiert und in letal bestrahlte Ly5.1 Pep Boy-Empfängermäuse injiziert, bei denen es sich um C57Bl/6-Mäuse handelt, die das CD45.1-Allel tragen, um die Verfolgung der Immunzellen des Empfängers zu ermöglichen. Zwölf Wochen später ist das Immunsystem vollständig rekonstituiert, und die Mäuse können in In-vivo-Modelle aufgenommen werden.

Neben dem Vorteil von Kosteneinsparungen und einer schnelleren Zeit bis zur Erzeugung im Vergleich zur Erzeugung und Zucht genetisch veränderter Tiere ist diese Methode ideal für Ziele, die embryonal letal sind, da sie speziell auf das hämatopoetische Kompartiment abzielt. Darüber hinaus bietet dieses System für Ziele, für die keine Werkzeuge wie ein Antikörper zur Verfügung stehen, einen praktikablen Ansatz. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass zur Bewältigung der bisher beschriebenen Herausforderungen eine in vivo CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editing-Plattform entwickelt wurde, um schnell genetisch veränderte Tiermodelle zu generieren 10,11,12,13,14. Diese Studie zeigt, dass Darmentzündungen bei WT C57Bl/6 Mäusen durch einen CD40 agonistischen Antikörper induziert werden können. CD40 ist ein Schlüsselregulator der Krankheit in diesem Modell und wurde daher als Modellziel verwendet, um den CRISPR/Cas9-basierten Knockout und den Verlust der Genfunktion zu validieren.

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Protokoll

Alle Tierversuche, die nach diesem Protokoll durchgeführt werden, müssen vom jeweiligen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt werden. Alle hier beschriebenen Verfahren wurden von der AbbVie IACUC genehmigt.

1. Erzeugung der benötigten Lentiviren und Beschaffung von Spender- und Empfängertieren

HINWEIS: Die Materialtabelle enthält Angaben zur Quelle und Bestellnummer für alle Tiere, Instrumente und Reagenzien, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Konstruieren Sie die Plasmide mit einem lentiGuide-puro-Vektor, der auf VexGFP oder mCherry modifiziert ist.
   1. Klonieren Sie die verschlüsselte nicht zielgerichtete gRNA (SgNone) oder CD40-gerichtete gRNA in den modifizierten Vektor.
      HINWEIS: In dieser Studie waren die Sequenzen für jede gRNA wie folgt: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTGTTCCAC; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA; und SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
   2. Produzieren Sie die lentiviralen Partikel wie zuvor beschrieben¹⁵.
      1. Co-transfizieren Sie die gRNA-kodierenden Plasmide in 293T-Zellen mit VSV-G- und pLEX-Verpackungsplasmiden.
      2. Wechseln Sie das Kulturmedium nach 18 Stunden Transfektion und sammeln Sie die Überstände, die das Virus enthalten, nach 24-48 Stunden nach dem Mediumwechsel.
      3. Um die Effizienz der CD40-gRNA zu bewerten, erzeugen Sie eine CD40-stabile 293T-Zelllinie durch Transfektion eines pcDNA3.1-Plasmids, das für CD40 kodiert.
   3. Transfizieren Sie die Zellen mit den beschriebenen Lentiviren und werten Sie sie zwei Wochen später durch Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) aus.
      HINWEIS: Cas9 KI-Mäuse wurden als Spendermäuse verwendet. Stellen Sie sicher, dass sich die Cas9 KI-Mäuse auf einem C57Bl/6-Hintergrund befinden (und das CD45.2-Allel exprimieren), wenn Sie C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy-Mäuse (die das CD45.1-Allel exprimieren) als Empfänger verwenden, damit GvHD vermieden wird und um Spender- und Empfängerzellen zu verfolgen.
2. Entwerfen Sie das Experiment. Für den Gen-Knockout (KO) verwenden Sie 3-6 gRNAs pro Gen. Bereiten Sie für jede gRNA 20 % zusätzliche Empfängermäuse vor, um den Verlust von Tieren während und nach der Transplantation zu berücksichtigen.
   HINWEIS: Das CD40-agonistische Antikörper-induzierte Kolitis-Modell erfordert mindestens 8 Mäuse pro Gruppe für die statistische Aussagekraft. Daher wurden in dieser Studie 10 Mäuse pro gRNA präpariert. Die Anzahl der Mäuse, die für andere In-vivo-Modelle benötigt werden, variiert je nach verwendetem Modell.
3. Verwenden Sie gleichgeschlechtliche Spender- und Empfängermäuse, die 8-12 Wochen alt sind.
   HINWEIS: Die Mäuse wurden gemäß den von der IACUC genehmigten Richtlinien mit einem Minimum von 5 % Isofluran euthanasiert und mit einer Gebärmutterhalsdislokation als sekundäre Methode bestätigt.

2. Knochenmarkentnahme und Vorbereitung für die Zellsortierung

1. Entnehmen Sie mit einer Pinzette und einer Schere Knochen von jeder Spendermaus (Femur, Tibia, Humerus und Ulna) und entfernen Sie vorsichtig so viel Muskeln/Gewebe wie möglich.
2. Durchstechen Sie den Boden eines 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchens mit einer 23-g-Nadel und legen Sie das Röhrchen in ein 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen. Machen Sie 2 Sätze pro Tier.
3. Schneiden Sie ein Ende der Knochen auf und legen Sie 4-8 Knochen in das Mikrozentrifugenröhrchen, wobei die offenen Enden zum 23-G-Nadelloch zeigen.
   HINWEIS: Die Anzahl der Knochen pro Röhre hängt vom Knochen ab, z. B. passen 8 Tibien, Humeri und Ulnae oder 4 Femure.
4. Zentrifugieren Sie die Röhrchen (wobei das 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchen die Knochen im 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen enthält) bei 300 × g für 2 min bei Raumtemperatur (RT).
5. Entsorgen Sie das 0,6-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, das jetzt Knochen ohne Knochenmark enthält, und lassen Sie nur das 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen übrig, das jetzt mit Mark gefüllt ist. Geben Sie 1 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen (mit Ammoniumchlorid) in jedes Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie das Zellpellet durch Pipettieren. 1 Min. bei RT inkubieren. Wiederholen Sie den Lyseschritt bei Bedarf.
6. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein konisches 50-ml-Röhrchen und fügen Sie Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) ohne Kalzium und Magnesium (mindestens das doppelte Volumen der Zellsuspension) hinzu, um den Lysepuffer zu neutralisieren. Pelletzellen bei 300 × g für 5 min. Saugen Sie den Überstand vollständig an.
7. Laden Sie einen 70-μm-Filter auf ein konisches 50-ml-Röhrchen und filtern Sie die Zellen hindurch, indem Sie das Röhrchen und den Filter mit DPBS waschen. Verwerfen Sie den Filter, und zählen Sie die Zellen.
   HINWEIS: Die Verwendung von 30 Spendermäusen (12 Wochen alt) ergibt durchschnittlich 200-300 × 10⁶ Zellen.

3. Zellsortierung zur Isolierung von LSK-Zellen für die Transduktion

1. Die in Schritt 2.7 gezählten Zellen werden in MACS-Puffer (Magnetic Cell Sorting) (DPBS, 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure, 0,5 % Rinderserumalbumin, 10 μg/ml Penicillin-Streptomycin) im gewünschten Volumen (90 μl pro 10⁷ Zellen) resuspendiert.
2. Fügen Sie 10 μl CD117+ Kügelchen pro 10⁷ Zellen hinzu. Gut mischen, vor Licht schützen und bei 4 °C 15 Min. inkubieren.
3. Bereiten Sie die MACS LS-Säule vor, indem Sie die Säule in das Magnetfeld legen und mit MACS-Puffer spülen.
4. Waschen Sie die Zellen aus Schritt 3.2 mit einem geeigneten Volumen MACS-Puffer (mindestens das Doppelte Ihres Volumens) und zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei 300 × g .
5. Saugen Sie den Überstand vollständig an. Das Pellet wird wieder suspendiert, so dass die Endkonzentration 10⁸ Zellen in 500 μl MACS-Puffer beträgt.
6. Tragen Sie die Zellsuspension auf die LS-Säule auf. 3-mal mit 3 mL MACS-Puffer waschen.
   HINWEIS: Eine LS-Spalte kann bis zu 10^{bis 8} beschriftete Zellen und 2 × insgesamt 10^{bis 9} Zellen aufnehmen.
7. Nehmen Sie die Säule aus dem Magnetabscheider und legen Sie sie in ein geeignetes Auffangröhrchen. Fügen Sie 5 ml MACS-Puffer hinzu und spülen Sie die magnetisch markierten Zellen sofort aus, indem Sie den Kolben fest in die Säule drücken.
8. Pelletieren Sie die Zellen bei 300 × g für 10 min. Saugen Sie den Überstand vollständig an.
9. Suspendieren Sie die Zellen in 100 μl MACS-Puffer pro 10⁷ Zellen und fügen Sie die färbenden Antikörper für die Abstammung (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) und Sca-1 hinzu.
   HINWEIS: Die Verwendung von 30 Spendermäusen (12 Wochen alt) ergibt durchschnittlich 100-180 × 10⁶ Zellen.
10. Gut mischen, vor Licht schützen und bei 4 °C 20 min inkubieren.
11. Waschen Sie die Zellen durch Zugabe von 5-10 ml MACS-Puffer und zentrifugieren Sie sie 10 Minuten lang bei 300 × g . Saugen Sie den Überstand vollständig an.
12. Re-Suspendierung von bis zu 10⁸ Zellen in 500 μl MACS-Puffer
13. Filtrieren Sie die Zellen mit einem 70-μm-Zellsieb und führen Sie eine FACS für die Sca1+-Population der Abstammungslinie durch.
    HINWEIS: Etwa 1,8-2,6 % der Bevölkerung sollten Abstammungslinien-Sca1+ sein.
14. Sammeln Sie die Zellen in LSK-Kulturmedium (100 μl pro 10.000 Zellen): serumfreies Expansionsmedium, 100 ng/ml Thrombopoietin, Mausstammzellfaktor, Fms-verwandter Tyrosinkinase-3-Ligand und IL-7 mit 100 μg/ml Penicillin-Streptomycin.
15. Pelletzellen mit 300 × g für 10 min. Saugen Sie den Überstand vollständig an.

4. LSK-Transduktion und -Kultur zur Erzeugung von Kontroll- und Knockout-Zellen

1. Resuspendieren Sie die Zellen in LSK-Kulturmedium.
2. 10.000 Zellen pro Well in 96-Well-Platten mit flachem Boden in LSK-Kulturmedium säen.
3. Über Nacht bei 37 °C mit 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit unter aseptischen Bedingungen inkubieren.
4. Bereiten Sie 50 μg/ml Retronektinlösung in DPBS vor und geben Sie 300 μl in jede Vertiefung einer nicht TC-behandelten 24-Well-Polystyrolplatte. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
5. Verwerfen Sie am nächsten Tag die Retronektinlösung, spülen Sie die beschichtete Platte mit 300 μl DPBS aus und wiederholen Sie den Vorgang.
6. Übertragen Sie 50.000 LSK-Zellen in 500 μl Medium (5 Vertiefungen aus der 96-Well-Platte in Schritt 4.2) in jede retronectinbeschichtete Vertiefung der 24-Well-Polystyrolplatte aus Schritt 4.4.Verwenden Sie weitere 100 μl LSK-Medium pro 5 Vertiefungen, um die in der 96-Well-Platte verbleibenden Zellen zu spülen und zu sammeln. Stellen Sie sicher, dass 600 μl das Volumen pro Vertiefung in der 24-Well-Platte ist, nachdem Sie diesen Schritt ausgeführt haben (5 × 100 μl Vertiefungen von der 96-Well-Platte + 100 μl, die zum Waschen dieser 5 Vertiefungen verwendet wurden).
   HINWEIS: Schauen Sie nach der Übertragung unter dem Mikroskop auf die jetzt leere 24-Well-Platte, um zu bestätigen, dass alle Zellen entnommen wurden. Verwenden Sie LSK-Medium, um Zellen zu sammeln, die nicht übertragen wurden, um den Zellverlust aus dieser kleinen Population zu minimieren.
7. Geben Sie 300 μl Virusüberstand in jede Vertiefung und schütteln Sie die Platte 5 Minuten lang bei einem Einstellwert von 500. Den Teller bei 600 × g und 37 °C 20 min drehen. Verwenden Sie mindestens 5 × 10⁶ Viruspartikel pro ml.
   HINWEIS: In dieser Studie wurde ein von pLentiPuro modifizierter Vektor verwendet, bei dem das Puromycin-Widerstandselement gegen VexGFP ausgetauscht wurde. Das Virus wurde bei einer Infektionsvielfalt von 50-100 hinzugefügt.
8. 1 h inkubieren. Fügen Sie 500 μl vorgewärmtes LSK-Medium hinzu.
9. 2 Tage lang bei 37 °C mit 5 % CO₂ und 95 % Luftfeuchtigkeit unter aseptischen Bedingungen inkubieren.

5. Bestrahlung von Tieren zur Vorbereitung der Transplantation von Spenderstammzellen

1. Nach 2 Tagen Inkubation werden die Empfängertiere zweimal im Abstand von 4 h mit 475 cGy bestrahlt. Nach der zweiten Bestrahlungsrunde werden die Tiere in autoklavierte Käfige gesetzt und 12 Wochen lang als immundefiziente Tiere behandelt. Die Mäuse erhielten eine Anreicherung, ein Hydrogel und eine Überwachung an der Käfigseite, um bei Bedarf eine unterstützende Pflege und Intervention zu gewährleisten. Mäuse können zusätzlich zu unterstützenden Pflege- und Interventionsmethoden antibiotische Nahrung oder Wasser erhalten.
   ANMERKUNG. Die Bestrahlungsdosen können je nach Bestrahlungsgerät unterschiedlich sein. Führen Sie eine Dosistitration des Bestrahlungsgeräts durch, um die beste Dosierung zu ermitteln. Dosen zwischen 700 und 1300 cGy für C57Bl/6-Mäuse haben sich in verschiedenen Literaturbeispielen als wirksam erwiesen¹⁷. Wählen Sie 3-4 Dosen in diesem Bereich aus und bewerten Sie 5 Mäuse pro Dosis auf Überleben und Transplantation. Wenn die Transplantation nicht erfolgreich ist oder die Strahlendosis zu hoch ist, leben die Mäuse nicht länger als 3 Wochen nach der Transplantation. 4 Wochen nach der Transplantation bluten die überlebenden Mäuse, um die Transplantation durch FACS zu bewerten. Wir führen retroorbitale (RO) Blutentnahmen von ~50-100 μl pro Maus durch, um die Transplantation zu bewerten. Die Mäuse standen während der Entnahme unter Narkose (2-3 % Isofluran) und erhielten Augengleitmittel und 1,0 ml subkutane Kochsalzlösung als unterstützende Pflege nach der RO-Blutentnahme.

6. Zellvorbereitung und Injektion in bestrahlte Empfängertiere

1. Pipettieren Sie die Zellen aus jeder Vertiefung aus Schritt 4.9, wobei Sie die Gruppen getrennt halten, nachdem die Zellen mit verschiedenen gRNAs transduziert wurden, und pelletieren Sie sie bei 300 × g für 10 Minuten.
2. Resuspendieren Sie die Zellen in MACS-Puffer, filtrieren Sie mit einem 70-μm-Sieb und sortieren Sie die VexGFP+-Population.
   HINWEIS: Etwa 10-15% der Zellen sollten VexGFP+ sein.
3. Pelletieren Sie die Zellen bei 300 × g für 10 min. Resuspendieren Sie sie in Hanks ausgewogener Salzlösung: 5.000 oder mehr Zellen pro Maus in 200 μl.
   HINWEIS: HBSS ist nicht pharmazeutisch. Sie können auch in Erwägung ziehen, eine sterile Kochsalzlösung in pharmazeutischer Qualität zur Injektion zu verwenden.
4. Injizieren Sie die Zellen intravenös 3 h nach der letzten Bestrahlungsdosis.
   HINWEIS: Zwölf Wochen später haben die Mäuse ein vollständig transplantiertes Immunsystem und können in In-vivo-Modelle aufgenommen werden.

7. CD40-agonistisches Antikörper-induziertes Kolitis-Modell in Wildtyp-Mäusen

HINWEIS: Wiegen und beurteilen Sie die Tiere täglich. Bieten Sie bei Bedarf unterstützende Pflege an: 1,0 ml subkutane Natriumchloridlösung bei 10 % Gewichtsverlust oder wenn sie dehydriert sind. Die Positivkontrolle für dieses Modell ist Anti-p40, das zweimal pro Woche intraperitoneal mit 25 mg/kg verabreicht wird, beginnend am Tag -1.

HINWEIS: In dieser Studie umfassten die Versuchsgruppen die naive Kontrolle, die Fahrzeugkontrolle (Negativkontrolle) und die Anti-p40-Kontrollgruppe (positiv). Zusammen kontrollieren diese Gruppen das normale Verhalten des CD40-agonistischen Antikörper-induzierten Colitis-Modells. Vektor-, SgNone- und SgRNA-Gruppen: Die Vektorkontrollen für den gängigen lentiviralen Vektor, SgNone ist eine verschlüsselte Non-Targeting-Guide-Kontrolle, und die SgRNA-Gruppen sind die "Behandlungs"-Gruppen, die eine verminderte Expression der Ziel-gRNA aufweisen.

1. Tag 0: Injektion eines CD40-agonistischen Antikörpers in einer Dosis von 10 mg/kg intraperitoneal in DPBS bei allen Tieren mit Ausnahme der naiven Kontrolle.
2. Tag 3 und 6: Führen Sie eine Videoendoskopie durch, um das Fortschreiten der Erkrankung wie zuvor beschrieben^{zu beurteilen 16}.
   1. Betäuben Sie die Mäuse mit 2-3% Isofluran. Bieten Sie während der Genesung eine thermische Unterstützung über den Mechanismus des internen Anästhesiegeräts und/oder ein externes Wärmekissen.
   2. Sobald die Mäuse unter Narkose stehen, verabreichen Sie einen DPBS-Einlauf (ohne Kalzium und Magnesium), um den Dickdarm auf die Endoskopie vorzubereiten.
      HINWEIS: Für die Durchführung eines Einlaufs sind ca. 1-2 ml erforderlich.
   3. Bewegen Sie die Maus nach einem Einlauf und unter Narkose zum Nasenkegel des Anästhesiegeräts.
   4. Führen Sie das Endoskop vorsichtig in den Dickdarm ein, schieben Sie sich langsam zum proximalen Dickdarm vor, während Sie die Kamera zentriert und den Dickdarm mit Luft aufgeblasen halten (entweder mit der mitgelieferten Luftpumpe oder mit einem Schlauch/einer Spritze zum manuellen Aufblasen), ziehen Sie dann das Endoskop langsam zurück und nehmen Sie ein Video und Bilder in 3 cm, 2 cm und 1 cm Entfernung vom Anus auf.
      HINWEIS: Um die Reizung des Dickdarms zu minimieren, kann der Spitze des Endoskops steriles Gleitmittel zugesetzt werden.
   5. Bewerten Sie jedes Bild individuell basierend auf dem Gefäßmuster und der Verdickung der Schleimhaut, wie in Tabelle 1 beschrieben. Kombinieren Sie die Punktzahlen aus den 3 Bildern pro Maus, um jedem Tier eine Summenpunktzahl zuzuweisen.
3. Tag 7: Alle Mäuse durch Isofluran-Überdosierung oder CO₂ -Kammer einschläfern und so viel Blut wie möglich durch Herzpunktion für Serum sammeln. Wiegen Sie die Milz, um die Splenomegalie zu messen, und sammeln Sie sie für die Durchflusszytometrie, und sammeln Sie den Dickdarm für die Histopathologie.
   HINWEIS: Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete Gewebeschnitte des Dickdarms der Maus wurden präpariert und für die Immunhistochemie (IHC) verwendet, wie zuvor von Wang et al.^{beschrieben 19}.

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Ergebnisse

Nach dem oben beschriebenen Verfahren wurden Mäuse erzeugt, die CD40-gerichtete gRNA exprimierten. In Woche 2 wurden B-Zellen, CD11b+-Makrophagen und CD11c+-dendritische Zellen (DCs) transplantiert (Abbildung 2). T-Zellen brauchten jedoch, wie auf der Grundlage früherer Literatur¹⁸ erwartet, länger, um vollständig zu transplantieren, und benötigten 12 Wochen nach der Transplantation, um ~90% zu er...

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Diskussion

Die hier gezeigten Ergebnisse stellen eine neuartige CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editing-Plattform vor, die in der Lage ist, die Genfunktion in diesem CD40-agonistischen Antikörper-induzierten Kolitis-Modell zu untersuchen. Die Zellsortierung bereicherte den Pool genetisch veränderter LSK-Zellen, was zu einer Reduzierung der CD40-Expression bei den rekonstituierten Tieren um über 90 % führte - in nur 4 Monaten. Darüber hinaus hatte die verminderte Expression von CD40 im Immunsystem e...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture plates	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µm filter unit	Millipore	#SLHV013SL
0.6 mL microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-060-C-S
1.5 mL Eppendorf Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15mL Conical	VWR	21008-918
23 G Needle	VWR	#305145
24 Well Non-TC Plates	Falcon	#351147
24-Well TC Plates	Falcon	#353047
50 mL Conical tube	VWR	21008-951
5 mL Syringe	BD Biosciences	#309647
70 µm Filter	Miltenyi	#130-098-462
96-Well Flat Bottom Plates	Corning	#3599
96-Well U-Bottom Plates	Corning/Costar	#3365
Anesthesia Machine	VetEquip - COMPAC5	#901812
Anti-CD40 Agonist monoclonal antibody	BioXcell	BE-0016
Anti-p40 monoclonal antibody	BioXcell	BE-0051
B220 PE Antibody	BioLegend	#103208
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Mice	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 background
CD117+ Beads	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE Antibody	BioLegend	#101208
CD3 PE Antibody	BD Biosciences	#553240
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrifuge
Countertop Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
Endoscope	Karl Storz	N/A	Custom Coloview Tower
Flow cytometer	BD Biosciences	FACS Aria II
Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE Antibody	BD Biosciences	#553128
Hank's balanced salt solution (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Incubator	Binder	#9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	#6679401710
LS Column	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy Mice	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6 background
mouse stem cell factor (mSCF)	PeproTech	#250-03
Sodium chloride (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM serum-free media	Invitrogen	#31985-070
Penicillin-streptomycin (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Plate Shaker	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene (10 µg/µL)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	#00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Antibody	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE Antibody	eBioscience	#12-5921
Thrombopoietin (TPO)	PeproTech	#315-14
X-ray Irradiator	Precision X-Ray	X-Rad 320