חקירת תפקוד גן המטרה במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40 באמצעות טכנולוגיות מבוססות CRISPR/Cas9

Summary

כאן, אנו מתארים את המתודולוגיה להפיל גן מעניין במערכת החיסון באמצעות טכנולוגיות מבוססות אנדונוקלאז הקשור ל-CRISPR (CRISPR)/CRISPR (Cas9) והערכה של עכברים אלה במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים על ידי אשכול של התמיינות 40 (CD40).

Abstract

מערכת החיסון מתפקדת כדי להגן על בני אדם מפני פולשים זרים כמו חיידקים ווירוסים. עם זאת, הפרעות במערכת החיסון עלולות להוביל לאוטואימוניות, מחלות דלקתיות וסרטן. מחלות המעי הדלקתיות (IBD) - מחלת קרוהן (CD) וקוליטיס כיבית (UC) - הן מחלות כרוניות המאופיינות בדלקת מעיים חוזרת. למרות שמחלת המעי הדלקתית נפוצה ביותר במדינות המערב (1 ל-1,000), שיעורי האירועים עולים ברחבי העולם. באמצעות מחקרי אסוציאציה, חוקרים קישרו מאות גנים לפתולוגיה של IBD. עם זאת, הפתולוגיה המשוכללת מאחורי IBD והמספר הגבוה של גנים פוטנציאליים מציבים אתגרים משמעותיים במציאת המטרות הטיפוליות הטובות ביותר. בנוסף, הכלים הדרושים לאפיון תפקודי של כל קשר גנטי מציגים גורמים מגבילים רבים כגון יצירת עכברים מהונדסים גנטית עבור כל גן. כדי לחקור את הפוטנציאל הטיפולי של גני המטרה, פותחה מערכת מודל המשתמשת בטכנולוגיות מבוססות אנדונוקלאז הקשור ל-CRISPR (CRISPR)/CRISPR (Cas9) ואשכול של נוגדנים אגוניסטיים התמיינות 40 (CD40). המחקר הנוכחי מראה כי ניתן להשתמש בעריכה בתיווך CRISPR/Cas9 במערכת החיסון כדי לחקור את ההשפעה של גנים in vivo. מוגבלת לתא ההמטופויאטי גישה זו עורכת באופן אמין את מערכת החיסון המחודשת המתקבלת. עכברים שנערכו ב-CRISPR/Cas9 נוצרים מהר יותר והם הרבה פחות יקרים מעכברים מסורתיים מהונדסים גנטית. יתר על כן, לעריכת CRISPR/Cas9 של עכברים יש יתרונות מדעיים משמעותיים בהשוואה לייצור וגידול עכברים מהונדסים גנטית, כגון היכולת להעריך מטרות קטלניות עובריות. תוך שימוש ב-CD40 כמטרה מודל במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40, מחקר זה מדגים את ההיתכנות של גישה זו.

Introduction

מחלות אוטואימוניות מתייחסות למצבים שבהם מערכת החיסון של המטופל תוקפת את התאים והאיברים שלו, וכתוצאה מכך דלקת כרונית ונזק לרקמות. כמעט 100 סוגים שונים של מצבים אוטואימוניים תוארו עד כה, המשפיעים על 3-5% מאוכלוסיית האדם¹. רבים מהמצבים האוטואימוניים, כולל זאבת אדמנתית מערכתית ו-IBD, חסרים טיפולים יעילים ומציגים צרכים רפואיים משמעותיים שלא נענו. כיום משפיעה על כ-1.5 מיליון אנשים בארה"ב לבדה, IBD היא מחלה הרסנית המאופיינת בדלקת מעיים מתקדמת, מתמשכת וחוזרת ללא תרופה זמינה. יש צורך בחשיפת הפתוגנזה והפתופיזיולוגיה הבסיסית כדי לספק את אסטרטגיות הטיפול והמניעה החדשות שחולי IBD זקוקים להן ^2,3.

למעלה מ-230 מיקומים שונים של IBD זוהו באמצעות ניתוחי אסוציאציות כלל-גנומיים (GWAS)⁴. למרות שהאסוציאציות הללו הבהירו גנים חדשים שהם שחקנים חשובים פוטנציאליים במנגנונים ובמסלולים העיקריים של IBD, רק כמה גנים ממיקומים אלה נחקרו. חלק מהגנים היו מעורבים במסלולים ספציפיים. לדוגמה, מסלול חישת החיידקים נקשר לחלבון 2 המכיל אוליגומריזציה קושרת נוקלאוטידים (NOD2); מסלול האוטופגיה נקשר ל-16 הקשורים לאוטופגיה כמו 1 (ATG16L1), משפחת GTPase M הקשורה לחסינות (IRGM) ומשפחת תחום גיוס קספאז 9 (CARD9); והמסלול הפרו-דלקתי נקשר לתגובות תאי T מונעות אינטרלוקין (IL)-23⁴. מודלים שונים של עכברים in vivo שימשו לאפיון פונקציונלי של גנים שזוהו באמצעות GWAS ^5,6.

אחד המודלים המרכזיים המשמשים לחקר פתוגנזה של IBD ^7,8 הוא מודל CD40 של קוליטיס, הגורם לדלקת מעיים חיסונית מולדת לאחר הזרקת נוגדן אגוניסטי CD40 לעכברים חסרי חיסון (תאי T ו-B). משמש בעיקר לבחינת התרומה של חסינות מולדת להתפתחות IBD, בעיקר מקרופאגים ותאים דנדריטיים⁹, לא ברור אם ניתן לגרום למחלה בעכברים מסוג בר (WT) בעלי יכולת חיסונית מלאה. בנוסף למודלים של בעלי חיים, נדרשים גם כלים ספציפיים לגנים לאפיון תפקודי של גן, כולל תרכובות כימיות ותרופות ביולוגיות. חשוב מכך, בעלי חיים מהונדסים גנטית חיוניים לחשיפת תפקודו של גן מסוים. עם זאת, האסטרטגיות המשמשות בדרך כלל לייצור הזרקה והשבחה של עכברים מהונדסים גנטית - נמשכות לעתים קרובות יותר משנה וכרוכות בעלות כספית משמעותית. תהליך מגביל קצב זה מהווה אתגר משמעותי במסע להבהיר את התפקודים של הגנים הקשורים ל-IBD שזוהו על ידי GWAS.

הפרוטוקול המוצג כאן מספק אלטרנטיבה בת קיימא לגידול עכברים מהונדסים גנטית. ראשית, כפי שמוצג באיור 1 , תאי טירוזין קינאז חיוביים לאנטיגן 1, קולטן טירוזין קינאז חיובי לערכת (שושלת-Sca1+c-Kit+ או LSK) מבודדים ממח העצם של עכברי נוקין Cas9 (KI) הנושאים אלל ספציפי (CD45.2) כדי לאפשר מעקב אחר תאי חיסון של תורם. לאחר מכן, תאים אלה נחשפים ללנטי-וירוסים הנושאים RNA מנחים שונים (gRNAs) ולסמן פלואורסצנטי, חלבון פלואורסצנטי ירוק מעורר סגול (VexGFP), כדי לאפשר מעקב אחר תאים מותמרים. יומיים לאחר מכן, תאי VexGFP+ ממוינים ומוזרקים לעכברי Ly5.1 Pep Boy המוקרנים באופן קטלני, שהם עכברי C57Bl/6 הנושאים את האלל CD45.1 כדי לאפשר מעקב אחר תאי מערכת החיסון של המקבל. שנים עשר שבועות לאחר מכן, מערכת החיסון נבנתה מחדש במלואה, וניתן לרשום את העכברים למודלים in vivo.

בנוסף ליתרון של חיסכון בעלויות וזמן ייצור מהיר יותר בהשוואה לדור וגידול של בעלי חיים מהונדסים גנטית, מתודולוגיה זו אידיאלית למטרות קטלניות עובריות, מכיוון שהיא מכוונת ספציפית לתא ההמטופויאטי יתר על כן, עבור מטרות בהן אין כלים זמינים, כגון נוגדן, מערכת זו מספקת גישה ישימה. לסיכום, כדי להתמודד עם האתגרים שתוארו עד כה, פותחה פלטפורמת עריכת גנום מבוססת CRISPR/Cas9 in vivo כדי ליצור במהירות מודלים של בעלי חיים מהונדסים גנטית 10,11,12,13,14. מחקר זה מדגים כי דלקת מעיים בעכברי WT C57Bl/6 יכולה להיגרם על ידי נוגדן אגוניסטי CD40. CD40 הוא מווסת מרכזי של מחלות במודל זה ולכן שימש כמטרה מודל לאימות הנוקאאוט מבוסס CRISPR/Cas9 ואובדן תפקוד הגנים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים המבוצעים בהתאם לפרוטוקול זה חייבים להיות מאושרים על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC). כל ההליכים המתוארים כאן אושרו על ידי AbbVie IACUC.

1. יצירת נגיפי לנטי נדרשים ורכש של בעלי חיים תורמים ומקבלים

הערה: טבלת החומרים כוללת פרטי מקור ומספר הזמנה עבור כל בעלי החיים, המכשירים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. בנה את הפלסמידים באמצעות וקטור lentiGuide-puro ששונה ל-VexGFP או mCherry.
   1. שיבוט ה-gRNA המקושקש שאינו מכוון (SgNone) או ה-gRNA המכוון ל-CD40 לתוך הווקטור ששונה.
      הערה: במחקר זה, הרצפים עבור כל gRNA היו כדלקמן: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTCTGTTCCAC; SgCD40.2, GACAAACAGTACCTCCACGA; ו-SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
   2. לייצר את החלקיקים הלנטי-ויראליים כפי שתואר קודם לכן¹⁵.
      1. העברה משותפת של הפלסמידים המקודדים ל-gRNA לתאי 293T עם פלסמידים של אריזות VSV-G ו-pLEX.
      2. שנו את מדיום התרבית לאחר 18 שעות של טרנספקציה, ואספו את הסופרנטנטים המכילים את הנגיף לאחר 24-48 שעות לאחר שינוי המדיום.
      3. כדי להעריך את יעילות CD40 gRNA, צור קו תאים יציב CD40 293T על ידי טרנספקציה של פלסמיד pcDNA3.1 המקודד ל-CD40.
   3. העבירו את התאים באמצעות ה-lentiviruses המתוארים, והעריכו אותם על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) שבועיים לאחר מכן.
      הערה: עכברי Cas9 KI שימשו כעכברים תורמים. ודא שעכברי Cas9 KI נמצאים על רקע C57Bl/6 (ומבטאים את האלל CD45.2) בעת שימוש בעכברי C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy (המבטאים את האלל CD45.1) כנמענים, כך ש-GvHD נמנע וכדי לעקוב אחר תאים תורמים ומקבלים.
2. תכננו את הניסוי. עבור נוקאאוט של גנים (KO), השתמש ב-3-6 gRNAs לכל גן. עבור כל gRNA, הכינו 20% עכברים מושתלים נוספים כדי לקחת בחשבון אובדן בעלי חיים במהלך ההשתלה ולאחריה.
   הערה: מודל הקוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40 דורש מינימום של 8 עכברים לקבוצה לצורך הפעלה סטטיסטית. לפיכך, 10 עכברים לכל gRNA הוכנו במחקר זה. מספר העכברים הדרושים לדגמי in vivo אחרים ישתנה בהתאם לדגם בו נעשה שימוש.
3. השתמש בעכברים מאותו מין תורם ומקבל בגילאי 8-12 שבועות.
   הערה: עכברים הומתו על פי הנחיות IACUC שאושרו תוך שימוש במינימום 5% איזופלורן ואושרו עם פריקת צוואר הרחם כשיטה משנית.

2. קצירת מח עצם והכנה למיון תאים

1. בעזרת מלקחיים ומספריים, קצרו עצמות מכל עכבר תורם (עצם הירך, השוקה, עצם הזרוע והאולנה), והסירו בזהירות כמה שיותר שריר/רקמה.
2. נקב את החלק התחתון של צינור מיקרו-צנטריפוגה של 0.6 מ"ל עם מחט של 23 גרם, והנח את הצינור בתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. הכינו 2 סטים לכל חיה.
3. חותכים קצה אחד של העצמות פתוח, ומניחים 4-8 עצמות בתוך צינור המיקרו-צנטריפוגה עם קצוות פתוחים הפונים לכיוון חור המחט 23 G.
   הערה: מספר העצמות בכל צינור תלוי בעצם, למשל, 8 עצם השוקה, עצם הזרוע והאולנה או 4 עצם הירך יתאימו.
4. צנטריפוגה את הצינורות (עם צינור המיקרו-צנטריפוגה 0.6 מ"ל המכיל את העצמות בתוך צינור הצנטריפוגה של 1.5 מ"ל) ב-300 × גרם למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
5. השליכו את צינור המיקרו-צנטריפוגה של 0.6 מ"ל, המכיל כעת עצמות ללא מח, והשאירו רק את צינור הצנטריפוגה של 1.5 מ"ל מלא כעת במח. הוסף 1 מ"ל של מאגר ליזה של תאי דם אדומים (המכיל אמוניום כלוריד) לכל צינור צנטריפוגה, והשהה מחדש את גלולת התא על ידי פיפטינג. דגירה ב- RT למשך דקה. חזור על שלב הליזיס במידת הצורך.
6. העבירו את תרחיף התא לצינור חרוטי של 50 מ"ל, והוסיפו את תמיסת המלח הפוספטית של Dulbecco (DPBS) ללא סידן ומגנזיום (לפחות כפול מנפח תרחיף התא) כדי לנטרל את מאגר הליזיס. תאי גלולה במשקל 300 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.
7. טען מסנן של 70 מיקרומטר על צינור חרוטי של 50 מ"ל, וסנן את התאים דרכו, באמצעות DPBS כדי לשטוף את הצינור והמסנן. השליכו את המסנן וספרו את התאים.
   הערה: שימוש ב-30 עכברים תורמים (בני 12 שבועות) יניב 200-300 ×-^10-6 תאים בממוצע.

3. מיון תאים לבידוד תאי LSK לצורך התמרה

1. השעו מחדש את התאים שנספרו בשלב 2.7 במאגר מיון תאים מגנטיים (MACS) (DPBS, 2 מ"מ חומצה אתילנדיאמין טטראצטית, 0.5% אלבומין בסרום בקר, 10 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין) בנפח הרצוי (90 מיקרוליטר לכל 10⁷ תאים).
2. הוסף 10 מיקרוליטר של חרוזי CD117+ לכל 10⁷ תאים. מערבבים היטב, מגנים מפני אור ודוגרים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
3. הכן את עמודת MACS LS על ידי הצבת העמודה בשדה המגנטי ושטיפתה עם מאגר MACS.
4. שטפו את התאים משלב 3.2 עם נפח מתאים של מאגר MACS (לפחות כפול מהנפח שלכם), וצנטריפוגה ב-300 × גרם למשך 10 דקות.
5. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין. השעו מחדש את הגלולה כך שהריכוז הסופי יהיה 10⁸ תאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS.
6. החל את מתלה התא על עמודת ה- LS. שטפו עם 3 פעמים עם 3 מ"ל של מאגר MACS.
   הערה: עמודת LS אחת יכולה להכיל עד 10⁸ תאים עם תוויות ו- 2 × 10⁹ תאים בסך הכל.
7. הסר את העמוד מהמפריד המגנטי והנח אותו בצינור איסוף מתאים. הוסף 5 מ"ל של מאגר MACS, ושטוף מיד את התאים המסומנים מגנטית על ידי דחיפה חזקה של הבוכנה לתוך העמודה.
8. גלולה את התאים בחום של 300 × גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.
9. השעו מחדש את התאים ב-100 מיקרוליטר של מאגר MACS לכל 10⁷ תאים, והוסיפו את הנוגדנים לצביעה לשושלת (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) ו-Sca-1.
   הערה: שימוש ב-30 עכברים תורמים (בני 12 שבועות) יניב 100-180 ×-^10-6 תאים בממוצע.
10. מערבבים היטב, מגנים מפני אור ודוגרים בחום של 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
11. שטפו את התאים על ידי הוספת 5-10 מ"ל של מאגר MACS, וצנטריפוגה בחום של 300 × גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.
12. השעיה מחדש עד 10⁸ תאים ב-500 מיקרוליטר של מאגר MACS
13. סנן את התאים עם מסננת תאים של 70 מיקרומטר, ובצע FACS עבור אוכלוסיית שושלת-Sca1+.
    הערה: כ-1.8-2.6% מהאוכלוסייה צריכים להיות שושלת-Sca1+.
14. אסוף את התאים במדיום תרבית LSK (100 מיקרוליטר לכל 10,000 תאים): מדיום התפשטות ללא סרום, 100 ננוגרם/מ"ל טרומבופויטין, גורם תאי גזע של עכבר, טירוזין קינאז 3 ליגנד הקשור ל-Fms, ו-IL-7 עם 100 מיקרוגרם/מ"ל פניצילין-סטרפטומיצין.
15. תאי גלולה במשקל 300 × גרם למשך 10 דקות. שאפו את הסופרנטנט לחלוטין.

4. התמרה ותרבית LSK ליצירת תאי בקרה ונוקאאוט

1. השעו מחדש את התאים במדיום תרבית LSK.
2. זרע 10,000 תאים לבאר בלוחות תרבית רקמה שטוחה (TC) של 96 בארות במדיום תרבית LSK.
3. דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5%_CO2 ו-95% לחות בתנאים אספטיים.
4. הכן תמיסת רטרונקטין של 50 מיקרוגרם/מ"ל ב-DPBS, והוסף 300 מיקרוליטר לכל באר של צלחת פוליסטירן 24 בארות שאינה מטופלת ב-TC. יש לדגור למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
5. למחרת, השליכו את תמיסת הרטרונקטין, שטפו את הצלחת המצופה ב-300 מיקרוליטר DPBS וחזרו על הפעולה.
6. העבר 50,000 תאי LSK ב-500 מיקרוליטר של מדיום (5 בארות מלוח 96 הבארות בשלב 4.2) לכל באר מצופה רטרונקטין של צלחת הפוליסטירן בת 24 הבארות משלב 4.4.השתמש ב-100 מיקרוליטר נוספים של מדיום LSK לכל 5 בארות כדי לשטוף ולאסוף את כל התאים הנוספים שנותרו בצלחת 96 הבארות. ודא ש-600 מיקרוליטר הוא הנפח לבאר בצלחת 24 הבארות לאחר שלב זה (5 × 100 מיקרוליטר בארות מצלחת 96 בארות + 100 מיקרוליטר המשמשות לשטיפת 5 הבארות הללו).
   הערה: לאחר ההעברה, הסתכל במיקרוסקופ על צלחת 24 הבארות הריקה כעת כדי לאשר שכל התאים נאספו. השתמש במדיום LSK כדי לאסוף תאים שלא הועברו כדי למזער את אובדן התאים מאוכלוסייה קטנה זו.
7. הוסיפו 300 מיקרוליטר של חומר וירוס לכל באר, ונערו את הצלחת בערך מוגדר של 500 למשך 5 דקות. סובבו את הצלחת בחום של 600 × גרם ו-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. השתמש לפחות ב-5 ×-^10-6 חלקיקים נגיפיים למ"ל.
   הערה: במחקר זה, נעשה שימוש בווקטור שונה מ-pLentiPuro, שבו אלמנט ההתנגדות לפורומיצין הוחלף ל-VexGFP. הנגיף נוסף בריבוי הדבקות של 50-100.
8. דגירה למשך שעה. הוסף 500 מיקרוליטר של מדיום LSK מחומם מראש.
9. דגירה למשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂ ו-95% לחות בתנאים אספטיים.

5. הקרנה לבעלי חיים כהכנה להשתלת תאי גזע מתורם

1. לאחר יומיים של דגירה, יש להקרין את בעלי החיים הנמענים ב-475 cGy פעמיים במרווח של 4 שעות. לאחר סבב ההקרנה השני, הכניסו את בעלי החיים לכלובים אוטוקלבים, והתייחסו אליהם כבעלי חיים חסרי חיסון למשך 12 שבועות. העכברים קיבלו העשרה, הידרוג'ל וניטור צד הכלוב כדי לספק טיפול תומך והתערבות לפי הצורך. עכברים עשויים לקבל מזון או מים אנטיביוטיים בנוסף לשיטות טיפול והתערבות תומכות.
   הערה. מינוני ההקרנה עשויים להיות שונים עם רדיאטורים שונים. בצע טיטרציה של מינון של הרדיאטור כדי לזהות את המינון הטוב ביותר. מינונים בין 700 ל-1300 cGy עבור עכברי C57Bl/6 נמצאו יעילים בדוגמאות ספרות שונות¹⁷. בחר 3-4 מנות בטווח זה, והעריך 5 עכברים למנה להישרדות והשתלה. אם ההשתלה לא מוצלחת או שמינון הקרינה גבוה מדי, עכברים לא יחיו מעבר ל-3 שבועות לאחר ההשתלה. לאחר 4 שבועות לאחר ההשתלה, יש לדמם את העכברים ששרדו כדי להעריך את ההשתלה על ידי FACS. אנו מבצעים איסוף דם רטרו-אורביטלי (RO) של ~50-100 מיקרוליטר לעכבר כדי להעריך את ההשתלה. העכברים היו תחת הרדמה (2-3% איזופלורן) במהלך האיסוף וקיבלו חומר סיכה לעיניים ותמיסת מלח תת עורית של 1.0 מ"ל כטיפול תומך לאחר איסוף דם RO.

6. הכנת תאים והזרקה לבעלי חיים מושתלים מוקרנים

1. הוצא את התאים מכל באר משלב 4.9, תוך שמירה על הקבוצות נפרדות כעת לאחר שהתאים עברו התמרה עם gRNAs שונים, וגלולה אותם ב-300 × גרם למשך 10 דקות.
2. השעו מחדש את התאים במאגר MACS, סנן עם מסננת של 70 מיקרומטר ומיין את אוכלוסיית VexGFP+.
   הערה: כ-10-15% מהתאים צריכים להיות VexGFP+.
3. גלולה את התאים בחום של 300 × גרם למשך 10 דקות. השעו אותם בתמיסת המלח המאוזנת של האנק: 5,000 תאים או יותר לעכבר ב-200 מיקרוליטר.
   הערה: HBSS אינו באיכות פרמצבטית. אתה יכול גם לשקול להשתמש במי מלח סטריליים באיכות פרמצבטית להזרקה.
4. יש להזריק את התאים לווריד 3 שעות לאחר מנת ההקרנה האחרונה.
   הערה: שנים עשר שבועות לאחר מכן, לעכברים תהיה מערכת חיסון מושתלת במלואה וניתן יהיה לרשום אותם למודלים in vivo.

7. מודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40 בעכברים מסוג בר

הערה: שקלו והעריכו את בעלי החיים מדי יום. לספק טיפול תומך לפי הצורך: 1.0 מ"ל של תמיסת נתרן כלורי תת עורית בירידה של 10% במשקל או אם הם מיובשים. הבקרה החיובית למודל זה היא אנטי-p40 במינון תוך-צפקי של 25 מ"ג/ק"ג פעמיים בשבוע החל מהיום הראשון.

הערה: במחקר זה, קבוצות הניסוי כללו קבוצות ביקורת נאיביות, ביקורת רכב (שלילית) וקבוצות ביקורת נגד p40 (חיובי). יחד, קבוצות אלה שולטות בהתנהגות הנורמלית של מודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40. קבוצות וקטור, SgNone ו-SgRNA: בקרות הווקטור עבור הווקטור הלנטי-ויראלי הנפוץ, SgNone הוא בקרת מדריך מקושקשת שאינה ממוקדת, וקבוצות ה-SgRNA הן קבוצות ה"טיפול" הנושאות ביטוי מופחת של ה-gRNA המטרה.

1. יום 0: הזרקת נוגדן אגוניסטי CD40 במינון 10 מ"ג/ק"ג תוך צפקי ב-DPBS לכל בעלי החיים למעט בקרה נאיבית.
2. ימים 3 ו-6: בצע אנדוסקופיה בווידאו כדי להעריך את התקדמות המחלה כפי שתואר קודם לכן¹⁶.
   1. להרדים את העכברים עם 2-3% איזופלורן. לספק תמיכה תרמית באמצעות מנגנון מכונת הרדמה פנימית ו/או כרית חום חיצונית במהלך ההתאוששות.
   2. לאחר שהעכברים נמצאים תחת הרדמה, יש לתת חוקן DPBS (ללא סידן ומגנזיום) כדי להכין את המעי הגס לאנדוסקופיה.
      הערה: נדרשים כ-1-2 מ"ל לביצוע חוקן.
   3. לאחר חוקן ובזמן הרדמה, העבר את העכבר לקונוס האף של מכונת ההרדמה.
   4. הכנס בעדינות את האנדוסקופ למעי הגס, התקדם לאט למעי הגס הפרוקסימלי תוך שמירה על המצלמה במרכז והמעי הגס מנופח באוויר (באמצעות משאבת האוויר המצורפת או חבר צינור/מזרק לניפוח ידני), ואז משוך לאט את האנדוסקופ ואסוף סרטון ותמונות במרחק של 3 ס"מ, 2 ס"מ ו-1 ס"מ מפי הטבעת.
      הערה: כדי למזער את הגירוי של המעי הגס, ניתן להוסיף חומר סיכה סטרילי לקצה האנדוסקופ.
   5. ציין כל תמונה בנפרד על סמך דפוס כלי הדם ועיבוי הרירית כמתואר בטבלה 1. שלב את הציונים מ-3 התמונות לכל עכבר כדי להקצות ציון סכום לכל חיה.
3. יום 7: המתת חסד של כל העכברים על ידי מנת יתר של איזופלורן או תא CO₂ , ואיסוף כמה שיותר דם על ידי ניקוב לב לסרום. שקלו את הטחול כדי למדוד טחול ואספו לזרימה ציטומטרית, ואספו את המעי הגס להיסטופתולוגיה.
   הערה: קטעי רקמה קבועים בפורמלין ומשובצים בפרפין של המעי הגס של העכבר הוכנו ושימשו לאימונוהיסטוכימיה (IHC) כפי שתואר בעבר על ידי וואנג ואחרים¹⁹.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בעקבות ההליך שתואר לעיל, נוצרו עכברים המבטאים gRNA ממוקד CD40. בשבוע השני, תאי B, מקרופאגים CD11b+ ותאים דנדריטיים CD11c+ (DCs) הושתלו (איור 2). עם זאת, לתאי T, כצפוי בהתבסס על ספרות קודמת¹⁸, לקח זמן רב יותר להשתלה מלאה ונדרשו 12 שבועות לאחר הה?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

התוצאות המוצגות כאן מציגות פלטפורמת עריכת גנום חדשה מבוססת CRISPR/Cas9 המסוגלת לחקור את תפקוד הגנים במודל קוליטיס הנגרמת על ידי נוגדנים אגוניסטיים CD40. מיון התאים העשיר את מאגר תאי ה-LSK המהונדסים גנטית, וכתוצאה מכך הפחתה של למעלה מ-90% בביטוי CD40 בקרב בעלי החיים ששוחזרו - תוך 4 חוד...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture plates	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µm filter unit	Millipore	#SLHV013SL
0.6 mL microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-060-C-S
1.5 mL Eppendorf Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15mL Conical	VWR	21008-918
23 G Needle	VWR	#305145
24 Well Non-TC Plates	Falcon	#351147
24-Well TC Plates	Falcon	#353047
50 mL Conical tube	VWR	21008-951
5 mL Syringe	BD Biosciences	#309647
70 µm Filter	Miltenyi	#130-098-462
96-Well Flat Bottom Plates	Corning	#3599
96-Well U-Bottom Plates	Corning/Costar	#3365
Anesthesia Machine	VetEquip - COMPAC5	#901812
Anti-CD40 Agonist monoclonal antibody	BioXcell	BE-0016
Anti-p40 monoclonal antibody	BioXcell	BE-0051
B220 PE Antibody	BioLegend	#103208
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Mice	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 background
CD117+ Beads	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE Antibody	BioLegend	#101208
CD3 PE Antibody	BD Biosciences	#553240
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrifuge
Countertop Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
Endoscope	Karl Storz	N/A	Custom Coloview Tower
Flow cytometer	BD Biosciences	FACS Aria II
Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE Antibody	BD Biosciences	#553128
Hank's balanced salt solution (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Incubator	Binder	#9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	#6679401710
LS Column	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy Mice	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6 background
mouse stem cell factor (mSCF)	PeproTech	#250-03
Sodium chloride (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM serum-free media	Invitrogen	#31985-070
Penicillin-streptomycin (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Plate Shaker	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene (10 µg/µL)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	#00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Antibody	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE Antibody	eBioscience	#12-5921
Thrombopoietin (TPO)	PeproTech	#315-14
X-ray Irradiator	Precision X-Ray	X-Rad 320