CD40 Agonistik Antikor ile İndüklenen Kolit Modelinde Hedef Gen Fonksiyonunun CRISPR/Cas9 Tabanlı Teknolojiler Kullanılarak İncelenmesi

Özet

Burada, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) / CRISPR ile ilişkili endonükleaz (Cas9) tabanlı teknolojileri kullanarak bağışıklık sisteminde ilgilenilen bir geni devre dışı bırakma metodolojisini ve bu farelerin bir farklılaşma kümesi 40 (CD40) agonistik antikor kaynaklı kolit modelinde değerlendirilmesini açıklıyoruz.

Özet

Bağışıklık sistemi, insanları bakteri ve virüs gibi yabancı istilacılara karşı savunmak için işlev görür. Bununla birlikte, bağışıklık sistemi bozuklukları otoimmünite, enflamatuar hastalık ve kansere yol açabilir. İnflamatuar barsak hastalıkları (IBD) - Crohn hastalığı (CH) ve ülseratif kolit (UC) - tekrarlayan bağırsak iltihabı ile işaretlenmiş kronik hastalıklardır. IBD en çok Batı ülkelerinde (1.000'de 1) yaygın olmasına rağmen, olay oranları dünya çapında artmaktadır. İlişkilendirme çalışmaları sayesinde, araştırmacılar yüzlerce geni IBD patolojisine bağladılar. Bununla birlikte, IBD'nin arkasındaki ayrıntılı patoloji ve yüksek sayıda potansiyel gen, en iyi terapötik hedefleri bulmada önemli zorluklar yaratmaktadır. Ek olarak, her bir genetik ilişkiyi işlevsel olarak karakterize etmek için gereken araçlar, her gen için genetik olarak değiştirilmiş farelerin üretilmesi gibi birçok hız sınırlayıcı faktör sunar. Hedef genlerin terapötik potansiyelini araştırmak için, kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR)/CRISPR ile ilişkili endonükleaz (Cas9) tabanlı teknolojiler ve bir farklılaşma 40 (CD40) agonistik antikor kümesi kullanılarak bir model sistem geliştirilmiştir. Bu çalışma, bağışıklık sisteminde CRISPR / Cas9 aracılı düzenlemenin, genlerin in vivo etkisini araştırmak için kullanılabileceğini göstermektedir. Hematopoietik bölme ile sınırlı olan bu yaklaşım, ortaya çıkan yeniden yapılandırılmış bağışıklık sistemini güvenilir bir şekilde düzenler. CRISPR / Cas9 ile düzenlenmiş fareler daha hızlı üretilir ve geleneksel genetiği değiştirilmiş farelerden çok daha ucuzdur. Ayrıca, farelerin CRISPR / Cas9 düzenlemesi, embriyonik ölümcül hedefleri değerlendirme yeteneği gibi genetik olarak değiştirilmiş farelerin üretilmesi ve yetiştirilmesine kıyasla önemli bilimsel avantajlara sahiptir. CD40 agonistik antikor kaynaklı kolit modelinde model hedef olarak CD40'ı kullanan bu çalışma, bu yaklaşımın uygulanabilirliğini göstermektedir.

Giriş

Otoimmün hastalıklar, bir hastanın bağışıklık sisteminin kendi hücrelerine ve organlarına saldırarak kronik iltihaplanma ve doku hasarına neden olduğu durumları ifade eder. Bugüne kadar insan nüfusunun %3-5'ini etkileyen yaklaşık 100 farklı otoimmün durum tanımlanmıştır¹. Sistemik lupus eritematozus ve IBD dahil olmak üzere otoimmün durumların çoğu, etkili tedavilerden yoksundur ve karşılanmamış önemli tıbbi ihtiyaçlar sunar. Şu anda yalnızca ABD'de yaklaşık 1,5 milyon insanı etkileyen IBD, tedavisi olmayan ilerleyici, kalıcı ve tekrarlayan bağırsak iltihabı ile işaretlenmiş yıkıcı bir hastalıktır. Altta yatan patogenez ve patofizyolojinin çözülmesi, İBH hastalarının ihtiyaç duyduğu yeni tedavi ve önleme stratejilerini sağlamak için gereklidir ^2,3.

Genom çapında ilişkilendirme analizleri (GWAS) yoluyla 230'dan fazla farklı IBD lokusu ^{tanımlanmıştır4}. Bu ilişkiler, IBD'nin anahtar mekanizmalarında ve yollarında potansiyel olarak önemli oyuncular olan yeni genleri aydınlatmış olsa da, bu lokuslardan sadece birkaç gen incelenmiştir. Bazı genler belirli yolaklarda rol oynamıştır. Örneğin, mikrop algılama yolu, nükleotid bağlayıcı oligomerizasyon alanı içeren protein 2 (NOD2) ile ilişkilendirilmiştir; otofaji yolu, otofaji ile ilgili 16 gibi 1 (ATG16L1), bağışıklıkla ilgili GTPaz ailesi M (IRGM) ve kaspaz işe alım alanı aile üyesi 9 (CARD9) ile ilişkilendirilmiştir; ve pro-inflamatuar yol, interlökin (IL)-23 güdümlü T hücresi yanıtları ile ilişkilendirilmiştir⁴. GWAS^5,6 ile tanımlanan genleri işlevsel olarak karakterize etmek için çeşitli in vivo fare modelleri kullanılmıştır.

IBD patogenezini ^7,8 incelemek için kullanılan anahtar modellerden biri, immün yetmezliği olan (T ve B hücreli) farelere bir CD40 agonistik antikorunun enjeksiyonunu takiben doğuştan gelen immün bağırsak iltihabını indükleyen CD40 kolit modelidir. Öncelikle doğuştan gelen bağışıklığın, çoğunlukla makrofajlar ve dendritik hücreler⁹ olmak üzere IBD gelişimine katkısını incelemek için kullanılır, hastalığın tamamen bağışıklığa yetkin vahşi tip (WT) farelerde indüklenip indüklenemeyeceği belirsizdir. Hayvan modellerine ek olarak, kimyasal bileşikler ve biyolojikler de dahil olmak üzere bir genin fonksiyonel karakterizasyonu için gene özgü araçlar da gereklidir. Daha da önemlisi, genetiği değiştirilmiş hayvanlar, belirli bir genin işlevini ortaya çıkarmak için gereklidir. Bununla birlikte, tipik olarak genetiği değiştirilmiş fareler (embriyo enjeksiyonu ve üreme) yapmak için kullanılan stratejiler genellikle bir yıldan fazla sürer ve önemli bir finansal maliyete neden olur. Bu hız sınırlama süreci, GWAS tarafından tanımlanan IBD ile ilişkili genlerin işlevlerini aydınlatma arayışında önemli bir zorluk teşkil etmektedir.

Burada sunulan protokol, genetiği değiştirilmiş farelerin yetiştirilmesi için uygun bir alternatif sunmaktadır. İlk olarak, Şekil 1 şemasında gösterildiği gibi, soy negatif, kök hücre antijeni-pozitif, reseptör tirozin kinaz Kit-pozitif (soy-Sca1+c-Kit+ veya LSK) hücreleri, donör bağışıklık hücresi takibine izin vermek için spesifik bir alel (CD45.2) taşıyan Cas9 knockin (KI) farelerinin kemik iliğinden izole edilir. Daha sonra, bu hücreler, transdüksiyonlu hücrelerin izlenmesine izin vermek için farklı kılavuz RNA'lar (gRNA'lar) ve bir floresan işaretleyici, mor uyarılmış yeşil floresan proteini (VexGFP) taşıyan lentivirüslere maruz bırakılır. İki gün sonra, VexGFP + hücreleri sıralanır ve alıcı bağışıklık hücresi takibine izin vermek için CD45.1 alelini taşıyan C57Bl/6 fareleri olan ölümcül şekilde ışınlanmış alıcı Ly5.1 Pep Boy farelerine enjekte edilir. On iki hafta sonra, bağışıklık sistemi tamamen yeniden yapılandırılır ve fareler in vivo modellere kaydedilebilir.

Genetiği değiştirilmiş hayvanların üretilmesi ve yetiştirilmesine kıyasla maliyet tasarrufu ve daha hızlı nesil süresi avantajına ek olarak, bu metodoloji, özellikle hematopoietik bölmeyi hedef aldığı için embriyonik ölümcül olan hedefler için idealdir. Ayrıca, antikor gibi hiçbir aracın bulunmadığı hedefler için bu sistem uygulanabilir bir yaklaşım sağlar. Özetle, şimdiye kadar açıklanan zorlukların üstesinden gelmek için, genetiği değiştirilmiş hayvan modellerini hızlı bir şekilde oluşturmak için in vivo CRISPR/Cas9 tabanlı bir genom düzenleme platformu geliştirildi 10,11,12,13,14. Bu çalışma, WT C57Bl / 6 farelerinde bağırsak iltihabının bir CD40 agonistik antikoru tarafından indüklenebileceğini göstermektedir. CD40, bu modelde hastalığın önemli bir düzenleyicisidir ve bu nedenle CRISPR / Cas9 tabanlı nakavt ve gen fonksiyonu kaybını doğrulamak için bir model hedef olarak kullanılmıştır.

Protokol

Bu protokole uygun olarak gerçekleştirilen tüm hayvan deneyleri, ilgili Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmalıdır. Burada açıklanan tüm prosedürler AbbVie IACUC tarafından onaylanmıştır.

1. Gerekli lentivirüslerin üretilmesi ve donör ve alıcı hayvanların temini

NOT: Malzeme Tablosu, bu protokolde kullanılan tüm hayvanlar, aletler ve reaktifler için kaynak ve sipariş numarası ayrıntılarını içerir.

1. VexGFP veya mCherry olarak modifiye edilmiş bir lentiGuide-puro vektörü kullanarak plazmitleri oluşturun.
   1. Karıştırılmış hedeflemeyen gRNA'yı (SgNone) veya CD40 hedeflemeli gRNA'yı modifiye vektöre klonlayın.
      NOT: Bu çalışmada, her bir gRNA için diziler aşağıdaki gibidir: SgNone, CTATGATTGCAACTGTGCAG; SgCD40.1, AGCGAATCTCCCTGTTCCAC; SgCD40.2, GACAACAACAGTACCTCCACGA; ve SgCD40.3, ACGTAACACACTGCCCTAGA.
   2. Daha önce tarif edildiği gibi lentiviral parçacıkları üretin¹⁵.
      1. gRNA kodlayan plazmitleri VSV-G ve pLEX paketleme plazmitleri ile 293T hücrelerine birlikte transfekte edin.
      2. Transfeksiyondan 18 saat sonra kültür ortamını değiştirin ve ortam değişimini takiben 24-48 saat sonra virüsü içeren süpernatanları toplayın.
      3. CD40 gRNA verimliliğini değerlendirmek için, CD40'ı kodlayan bir pcDNA3.1 plazmitinin transfeksiyonu ile bir CD40 kararlı 293T hücre hattı oluşturun.
   3. Tarif edilen lentivirüsleri kullanarak hücreleri transfekte edin ve iki hafta sonra floresanla aktive edilen hücre sıralaması (FACS) ile değerlendirin.
      NOT: Cas9 KI fareleri donör fare olarak kullanıldı. C57Bl/6-Ly5.1 Pep Boy farelerini (CD45.1 alelini eksprese eden) alıcı olarak kullanırken Cas9 KI farelerinin bir C57Bl / 6 arka planında olduğundan (ve CD45.2 alelini ifade ettiğinden) emin olun, bu nedenle GvHD'den kaçınılır ve verici ve alıcı hücreleri izlemek için.
2. Deneyi tasarlayın. Gen nakavt (KO) için, gen başına 3-6 gRNA kullanın. Her gRNA için, nakil sırasında ve sonrasında hayvan kaybını hesaba katmak için %20 ekstra alıcı fare hazırlayın.
   NOT: CD40 agonistik antikorun neden olduğu kolit modeli, istatistiksel güçlendirme için grup başına en az 8 fare gerektirir. Bu nedenle, bu çalışmada gRNA başına 10 fare hazırlanmıştır. Diğer in vivo modeller için gereken fare sayısı, kullanılan modele göre değişecektir.
3. 8-12 haftalık aynı cinsiyetten donör ve alıcı fareleri kullanın.
   NOT: Fareler, minimum% 5 izofluran kullanılarak IACUC onaylı kılavuzlar altında ötenazi yapıldı ve ikincil bir yöntem olarak servikal çıkık ile doğrulandı.

2. Kemik iliği hasadı ve hücre tasnifi için hazırlık

1. Forseps ve makas kullanarak, her donör fareden (femur, tibia, humerus ve ulna) kemikleri toplayın ve mümkün olduğunca fazla kas/dokuyu dikkatlice çıkarın.
2. 0.6 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün altını 23 G'lik bir iğne ile delin ve tüpü 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpünün içine yerleştirin. Hayvan başına 2 set yapın.
3. Kemiklerin bir ucunu kesin ve açık uçları 23 G iğne deliğine bakacak şekilde mikrosantrifüj tüpünün içine 4-8 kemik yerleştirin.
   NOT: Tüp başına kemik sayısı kemiğe bağlıdır, örneğin 8 tibia, humeri ve ulnae veya 4 femur sığacaktır.
4. Tüpleri (1,5 mL santrifüj tüpünün içindeki kemikleri içeren 0,6 mL mikrosantrifüj tüpü ile) 300 × g'da oda sıcaklığında (RT) 2 dakika santrifüj edin.
5. Şimdi ilik içermeyen kemikler içeren 0.6 mL mikrosantrifüj tüpünü atın ve şimdi sadece 1.5 mL'lik santrifüj tüpünü ilikle doldurun. Her santrifüj tüpüne 1 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu (amonyum klorür içeren) ekleyin ve pipetleme yoluyla hücre peletini yeniden süspanse edin. RT'de 1 dakika inkübe edin. Gerekirse lizis adımını tekrarlayın.
6. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve lizis tamponunu nötralize etmek için kalsiyum ve magnezyum içermeyen (hücre süspansiyonunun hacminin en az iki katı) Dulbecco'nun fosfat tamponlu salinini (DPBS) ekleyin. 5 dakika boyunca 300 × g'da pelet hücreleri. Süpernatanı tamamen aspire edin.
7. 50 mL'lik konik bir tüpe 70 μm'lik bir filtre yükleyin ve tüpü ve filtreyi yıkamak için DPBS'yi kullanarak hücreleri filtreleyin. Filtreyi atın ve hücreleri sayın.
   NOT: 30 donör fare (12 haftalık) kullanmak ortalama olarak 200-300 × 10⁶ hücre verecektir.

3. Transdüksiyon için LSK hücrelerini izole etmek için hücre sıralama

1. Adım 2.7'de sayılan hücreleri manyetik hücre sıralama (MACS) tamponunda (DPBS, 2 mM etilendiamin tetraasetik asit,% 0.5 sığır serum albümini, 10 μg / mL penisilin-streptomisin) istenen hacimde (10⁷ hücre başına 90 μL) yeniden süspanse edin.
2. 10 7 hücre başına 10 μL^CD117 + boncuk ekleyin. İyice karıştırın, ışıktan koruyun ve 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
3. Kolonu manyetik alana yerleştirerek ve MACS tamponu ile durulayarak MACS LS kolonunu hazırlayın.
4. Adım 3.2'deki hücreleri uygun hacimde MACS tamponu ile yıkayın (hacminizin en az iki katı) ve 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı tamamen aspire edin. Peletleri, nihai konsantrasyon 500 μL MACS tamponunda 10⁸ hücre olacak şekilde yeniden süspanse edin.
6. Hücre süspansiyonunu LS sütununa uygulayın. 3 mL MACS tamponu ile 3 kez yıkayınız.
   NOT: Bir LS sütunu en fazla^{10 8} etiketli hücre ve toplam 2 × 10⁹ hücre alabilir.
7. Sütunu manyetik ayırıcıdan çıkarın ve uygun bir toplama tüpüne yerleştirin. 5 mL MACS tamponu ekleyin ve pistonu kolona sıkıca iterek manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri hemen yıkayın.
8. Hücreleri 300 × g'da 10 dakika boyunca peletleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin.
9. Hücreleri 10⁷ hücre başına 100 μL MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve soy (CD3, B220, Ter119, Gr-1, CD11b) ve Sca-1 için boyama antikorlarını ekleyin.
   NOT: 30 donör fare (12 haftalık) kullanmak ortalama olarak 100-180 × 10⁶ hücre verecektir.
10. İyice karıştırın, ışıktan koruyun ve 4 °C'de 20 dakika inkübe edin.
11. Hücreleri 5-10 mL MACS tamponu ekleyerek yıkayın ve 300 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen aspire edin.
12. 500 μL MACS tamponunda 10⁸ hücreye kadar yeniden süspansiyon
13. Hücreleri 70 μm'lik bir hücre süzgeci ile filtreleyin ve soy-Sca1+ popülasyonu için FACS gerçekleştirin.
    NOT: Nüfusun yaklaşık %1,8-2,6'sı soy-Sca1+ olmalıdır.
14. Hücreleri LSK kültür ortamında (10.000 hücre başına 100 μL) toplayın: serumsuz genleşme ortamı, 100 ng / mL trombopoietin, fare kök hücre faktörü, Fms ile ilişkili tirozin kinaz 3 ligandı ve 100 μg / mL penisilin-streptomisin ile IL-7.
15. 10 dakika boyunca 300 × g'da pelet hücreleri. Süpernatanı tamamen aspire edin.

4. Kontrol ve nakavt hücreleri oluşturmak için LSK transdüksiyonu ve kültürü

1. LSK kültür ortamındaki hücreleri yeniden süspanse edin.
2. LSK kültür ortamında 96 oyuklu düz tabanlı doku kültürü (TC) plakalarında oyuk başına 10.000 hücre tohumlayın.
3. Aseptik koşullar altında %5 CO₂ ve %95 nem ile 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.
4. DPBS'de 50 μg / mL retronektin çözeltisi hazırlayın ve TC ile muamele edilmemiş 24 oyuklu bir polistiren plakanın her bir oyuğuna 300 μL ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
5. Ertesi gün, retronektin solüsyonunu atın, kaplanmış plakayı 300 μL DPBS ile durulayın ve tekrarlayın.
6. 500 μL ortamdaki 50.000 LSK hücresini (adım 4.2'deki 96 oyuklu plakadan 5 oyuk) adım 4.4'teki 24 oyuklu polistiren plakanın her bir retronektin kaplı kuyucuğuna aktarın.96 oyuklu plakada kalan fazla hücreleri durulamak ve toplamak için 5 kuyucuk başına ek 100 μL LSK ortamı kullanın. Bu adımı takip eden 24 oyuklu plakada kuyucuk başına hacmin 600 μL olduğundan emin olun (96 oyuklu plakadan 5 × 100 μL kuyucuk + bu 5 kuyuyu yıkamak için kullanılan 100 μL).
   NOT: Aktardıktan sonra, tüm hücrelerin toplandığını doğrulamak için şu anda boş olan 24 oyuklu plakaya mikroskop altında bakın. Bu küçük popülasyondan hücre kaybını en aza indirmek için aktarılmayan hücreleri toplamak için LSK ortamını kullanın.
7. Her oyuğa 300 μL virüs süpernatan ekleyin ve plakayı 500 ayar değerinde 5 dakika çalkalayın. Plakayı 600 × g ve 37 °C'de 20 dakika döndürün. mL başına en az 5 × 10⁶ viral partikül kullanın.
   NOT: Bu çalışmada, puromisin direnç elemanının VexGFP'ye değiştirildiği pLentiPuro'dan modifiye edilmiş bir vektör kullanılmıştır. Virüs, 50-100 kişilik bir enfeksiyon çokluğunda eklendi.
8. 1 saat inkübe edin. 500 μL önceden ısıtılmış LSK ortamı ekleyin.
9. Aseptik koşullar altında %5 CO₂ ve %95 nem ile 37 °C'de 2 gün inkübe edin.

5. Donör kök hücre aşılamasına hazırlanmak için hayvan ışınlaması

1. 2 günlük inkübasyondan sonra, alıcı hayvanları 4 saat aralıklarla iki kez 475 cGy ile ışınlayın. İkinci ışınlama turunun ardından, hayvanları otoklavlanmış kafeslere yerleştirin ve 12 hafta boyunca bağışıklık yetmezliği olan hayvanlar olarak tedavi edin. Farelere, gerektiğinde destekleyici bakım ve müdahale sağlamak için zenginleştirme, hidrojel ve kafes tarafı izleme uygulandı. Fareler, destekleyici bakım ve müdahale yöntemlerine ek olarak antibiyotikli yiyecek veya su alabilir.
   NOT. Işınlama dozajları farklı ışınlayıcılara göre farklılık gösterebilir. En iyi dozu belirlemek için ışınlayıcının bir doz titrasyonunu gerçekleştirin. C57Bl / 6 fareler için 700 ile 1300 cGy arasındaki dozların çeşitli literatür örneklerinde etkili olduğu bulunmuştur¹⁷. Bu aralıkta 3-4 doz seçin ve hayatta kalma ve aşılama için doz başına 5 fareyi değerlendirin. Aşılama başarısız olursa veya radyasyon dozu çok yüksekse, fareler aşılamadan sonra 3 haftayı geçemez. Aşılamadan 4 hafta sonra, FACS ile aşılamayı değerlendirmek için hayatta kalan fareleri kanayın. Engraftmanı değerlendirmek için fare başına ~ 50-100 μL'lik retro-orbital (RO) kan alımları gerçekleştiriyoruz. Fareler toplama sırasında anestezi altındaydı (% 2-3 izofluran) ve RO kan alımını takiben destekleyici bakım olarak göz kayganlaştırıcı ve 1.0 mL deri altı salin aldı.

6. Hücre hazırlığı ve ışınlanmış alıcı hayvanlara enjeksiyon

1. Hücreleri adım 4.9'dan itibaren her bir oyuktan pipetleyin, hücreler farklı gRNA'larla transdüksiyon yapıldığı için grupları ayrı tutun ve 10 dakika boyunca 300 × g'da pelet haline getirin.
2. MACS tamponundaki hücreleri yeniden süspanse edin, 70 μm'lik bir süzgeçle filtreleyin ve VexGFP + popülasyonunu sıralayın.
   NOT: Hücrelerin yaklaşık %10-15'i VexGFP+ olmalıdır.
3. Hücreleri 10 dakika boyunca 300 × g'da pelet haline getirin. Bunları Hank'in dengeli tuz çözeltisinde yeniden süspanse edin: 200 μL'de fare başına 5.000 veya daha fazla hücre.
   NOT: HBSS farmasötik olmayan bir sınıftır. Enjeksiyon için farmasötik sınıf steril bir salin kullanmayı da düşünebilirsiniz.
4. Son ışınlama dozundan 3 saat sonra hücreleri intravenöz olarak enjekte edin.
   NOT: On iki hafta sonra, fareler tamamen aşılanmış bir bağışıklık sistemine sahip olacak ve in vivo modellere kaydedilebilir.

7. Yabani tip farelerde CD40 agonistik antikorun neden olduğu kolit modeli

NOT: Hayvanları günlük olarak tartın ve değerlendirin. Gerektiğinde destekleyici bakım sağlayın:% 10 kilo kaybında veya susuz kaldıklarında 1.0 mL deri altı sodyum klorür çözeltisi. Bu model için pozitif kontrol, -1. günden itibaren haftada iki kez 25 mg / kg'da intraperitoneal olarak dozlanan anti-p40'tır.

NOT: Bu çalışmada deney grupları naif kontrol, araç (negatif) kontrol ve anti-p40 (pozitif) kontrol gruplarından oluşmuştur. Birlikte, bu gruplar CD40 agonistik antikorun neden olduğu kolit modelinin normal davranışını kontrol eder. Vektör, SgNone ve SgRNA grupları: Ortak lentiviral vektör için vektör kontrolleri, SgNone şifreli hedeflemesiz bir kılavuz kontrolüdür ve SgRNA grupları, hedef gRNA'nın indirgenmiş ekspresyonunu taşıyan "tedavi" gruplarıdır.

1. 0. Gün: DPBS'de intraperitoneal olarak 10 mg / kg'da CD40 agonistik antikorunu naif kontrol dışında tüm hayvanlara enjekte edin.
2. 3. ve 6. günler: Daha önce tarif edildiği gibi hastalığın ilerlemesini değerlendirmek için video endoskopi yapın¹⁶.
   1. Fareleri% 2-3 izofluran ile uyuşturun. İyileşme sırasında dahili anestezi makinesi mekanizması ve/veya harici ısı yastığı ile termal destek sağlayın.
   2. Fareler anestezi altına alındıktan sonra, kolonu endoskopiye hazırlamak için bir DPBS (kalsiyum ve magnezyum içermeyen) lavmanı uygulayın.
      NOT: Lavman yapmak için yaklaşık 1-2 mL gereklidir.
   3. Lavmandan sonra ve anestezi altındayken, fareyi anestezi makinesinin burun konisine hareket ettirin.
   4. Endoskopu nazikçe kolona yerleştirin, kamerayı merkezde tutarken ve kolonu hava ile şişirirken (birlikte verilen hava pompasını kullanarak veya manuel olarak şişirmek için bir tüp / şırınga takın) yavaşça proksimal kolona ilerleyin, ardından endoskopu yavaşça çekin ve anüsten 3 cm, 2 cm ve 1 cm uzakta bir video ve görüntü toplayın.
      NOT: Kolonun tahrişini en aza indirmek için, endoskopun ucuna steril kayganlaştırıcı eklenebilir.
   5. Tablo 1'de açıklandığı gibi vasküler paterne ve mukozanın kalınlaşmasına göre her görüntüyü ayrı ayrı puanlayın. Her hayvana bir toplam puan atamak için fare başına 3 görüntüden elde edilen puanları birleştirin.
3. 7. Gün: Tüm fareleri izofluran doz aşımı veya CO₂ odası ile ötenazi yapın ve serum için kardiyak ponksiyon ile mümkün olduğunca fazla kan toplayın. Splenomegaliyi ölçmek ve akış sitometrisi için toplamak için dalağı tartın ve histopatoloji için kolonu toplayın.
   NOT: Fare kolonunun formalinle sabitlenmiş ve parafine gömülü doku kesitleri, daha önce Wang ve arkadaşları¹⁹ tarafından tanımlandığı gibi immünohistokimya (IHC) için hazırlanmış ve kullanılmıştır.

Sonuçlar

Yukarıda açıklanan prosedürü takiben, CD40 hedefli gRNA eksprese eden fareler üretildi. 2. haftaya kadar, B hücreleri, CD11b + makrofajlar ve CD11c + dendritik hücreler (DC'ler) aşılandı (Şekil 2). Bununla birlikte, T hücreleri, önceki literatüre^{göre beklendiği gibi, 18}, tam olarak aşılanması daha uzun sürdü ve engraftasyondan sonra ~% 90'a ulaşmak için 12 hafta sürdü (

Tartışmalar

Burada gösterilen sonuçlar, bu CD40 agonistik antikor kaynaklı kolit modelinde gen fonksiyonunu araştırabilen yeni bir CRISPR / Cas9 tabanlı genom düzenleme platformunu tanıtmaktadır. Hücre sınıflandırması, genetiği değiştirilmiş LSK hücrelerinin havuzunu zenginleştirdi ve sadece 4 ay içinde sulandırılmış hayvanlarda CD40 ekspresyonunda %90'ın üzerinde azalma ile sonuçlandı. Ayrıca, bağışıklık sistemi içinde CD40'ın azalmış ekspresyonu, CD40 agonist...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
6-well tissue culture plates	Corning/Costar	#3506
TransIT-LT1	Mirus Bio	MIR 2300/5/6
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)	Miltenyi Biotec	130-091-221
0.45 µm filter unit	Millipore	#SLHV013SL
0.6 mL microcentrifuge Tube	Axygen	MCT-060-C-S
1.5 mL Eppendorf Tube	Axygen	MCT-150-C-S
15mL Conical	VWR	21008-918
23 G Needle	VWR	#305145
24 Well Non-TC Plates	Falcon	#351147
24-Well TC Plates	Falcon	#353047
50 mL Conical tube	VWR	21008-951
5 mL Syringe	BD Biosciences	#309647
70 µm Filter	Miltenyi	#130-098-462
96-Well Flat Bottom Plates	Corning	#3599
96-Well U-Bottom Plates	Corning/Costar	#3365
Anesthesia Machine	VetEquip - COMPAC5	#901812
Anti-CD40 Agonist monoclonal antibody	BioXcell	BE-0016
Anti-p40 monoclonal antibody	BioXcell	BE-0051
B220 PE Antibody	BioLegend	#103208
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A7906-100G
Cas9 Knock-in Mice	Jackson Labs	#026179	C57Bl/6 background
CD117+ Beads	Miltenyi	#130-091-224
CD11b PE Antibody	BioLegend	#101208
CD3 PE Antibody	BD Biosciences	#553240
Centrifuge	Beckman Coulter	Allegra 6KR Centrifuge
Countertop Centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5424
DPBS	ThermoFisher	#14190136
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	Mediatech	#10-013-CV
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)	Invitrogen	AM9260G
Endoscope	Karl Storz	N/A	Custom Coloview Tower
Flow cytometer	BD Biosciences	FACS Aria II
Fms-related tyrosine kinase 3 ligand (Flt-L)	PeproTech	#250-31L
Gr-1 PE Antibody	BD Biosciences	#553128
Hank's balanced salt solution (HBSS)	ThermoFisher	#14170120
Heat-Inactivated Fetal Bovine Serum	HyClone	#SH30071.03
IL-7	PeproTech	#217-17
Incubator	Binder	#9040-0116
Isoflurane	HenrySchein	#6679401710
LS Column	Miltenyi	#130-042-041
Ly5.1 Pepboy Mice	Jackson Labs	#002014	C57Bl/6 background
mouse stem cell factor (mSCF)	PeproTech	#250-03
Sodium chloride (NaCl)	Hospira	#00409488850
OPTI-MEM serum-free media	Invitrogen	#31985-070
Penicillin-streptomycin (PenStrep)	ThermoFisher	#15140-122
Plate Shaker	ThermoFisher	#88880023
pLentiPuro	Addgene	#52963
Polybrene (10 µg/µL)	Sigma Aldrich	#TR-1003-G
Red Blood Cell Lysis Buffer	eBioscience	#00-4333
Retronectin	Takarbio	#T100B
Sca-1 APC Antibody	BioLegend	#108112
StemSpan	StemCell Technologies	#09600
Ter119 PE Antibody	eBioscience	#12-5921
Thrombopoietin (TPO)	PeproTech	#315-14
X-ray Irradiator	Precision X-Ray	X-Rad 320