使用紫罗兰兴奋细胞渗透DNA结合染料分离穆林精子生成细胞

摘要

在这里，我们提出了一个简单而有效的方法来从成年小鼠睾丸中分离活的美病细胞和后美生菌细胞。使用低细胞毒性、紫罗兰兴奋的DNA结合染料和荧光激活细胞分选，可以分离高度丰富的精子致原细胞群，用于许多下游应用。

摘要

分离美的精子细胞对于研究美因病和精子生成背后的分子机制至关重要。虽然有既定的细胞隔离协议使用 Hoechst 33342 染色结合荧光激活细胞分选，但它需要配备紫外线激光的细胞分拣机。在这里，我们描述一个细胞隔离协议使用染料循环紫罗兰（DCV）污渍，低细胞毒性DNA结合染料结构类似于霍赫斯特33342。DCV 可以同时受到紫外线和紫罗兰激光器的兴奋，从而提高了设备选择的灵活性，包括未配备紫外线激光的电池分拣机。使用该协议，可以分离出三个活细胞亚群在美的正头 I，包括麻黄素/酶，帕奇滕，和二苯甲酸精子细胞，以及后美的圆形精子。我们还描述了一个协议，用于准备从鼠标睾丸的单细胞悬浮。总体而言，该过程需要很短的时间才能完成（4-5 小时取决于所需的单元数量），这有利于许多下游应用。

引言

精子生成是一个复杂的过程，其中一小群精子干细胞维持着大量精子在整个成年生中^{连续生产1，2。}在精子生成过程中，动态染色质重塑发生在精子生成细胞经历美病产生单倍体精子^3，4，5。分离美的精子细胞对于分子研究至关重要，并建立了几种不同的分离美亚精子细胞的方法，包括^{沉积分离6、7}和荧光活性细胞分选（FACS）8、9、10、11、12、13、14、15、16、17。但是，这些方法有技术限制。虽然沉积基分离产生大量的细胞^5，6，7，它是劳动密集型的。已建立的基于FACS的方法使用Hochst 33342（Ho342）根据DNA含量和光散射特性分离美的精子细胞，并要求FACS细胞分拣机配备^{紫外线（UV）激光8，9，10，11。}基于FACS的替代方法要求转基因小鼠线表达荧光蛋白，精子^生成12的同步，或细胞固定和抗体标签，不兼容分离活细胞^13。虽然有另一种方法使用细胞渗透DNA结合染料，DyeCycle绿色染色14，15，16，17，此方法被推荐用于分离精子细胞从幼年睾丸。因此，迫切需要开发一种简单而坚固的分离方法，用于活体精子细胞，可应用于任何年龄的小鼠菌株，并可以使用任何 FACS 细胞分拣机进行。

在这里，我们描述这样一个长期寻求的细胞隔离协议使用染料循环紫罗兰（DCV）污渍。DCV是一种低细胞毒性，细胞渗透DNA结合染料结构类似于Ho342，但与激发光谱转向紫罗兰范围^18。此外，与 DCG 相比，DCV 具有更广泛的发射频谱。因此，它可以通过紫外线和紫罗兰激光器，从而提高设备的灵活性，允许使用不配备UV激光的FACS细胞分拣机。此处介绍的 DCV 协议使用二维分离，具有 DCV 蓝色和 DCV 红色，模仿 Ho342 协议的优势。凭借这一优势，我们的DCV协议使我们能够从成人睾丸中分离出高度丰富的生殖细胞。我们提供详细的浇注方案，从一只小鼠的成年小鼠睾丸（从两个睾丸）分离出活的精子细胞。我们还描述了一个高效和快速的协议，用于准备单细胞悬浮从鼠标睾丸，可用于此细胞隔离。该程序需要很短的时间才能完成（准备单细胞悬浮 - 1小时，染色染色 - 30分钟，细胞分选 - 2-3小时:总计 - 4-5小时，视所需细胞数量不同; 图1）。细胞分离后，可以完成广泛的下游应用，包括RNA-seq、ATAC-seq、ChIP-seq和细胞培养。

研究方案

该协议遵循机构动物护理和使用委员会的准则（协议号）。IACUC2018-0040）在辛辛那提儿童医院医疗中心。

1. 用于制备睾丸悬浮液的设备和试剂设置

1. 将每种酶储存在1x汉克斯的平衡盐溶液（HBSS）中，储存在-20°C（表1）。
   注:在实验前随时准备。
2. 实验前一天:在4°C下用胎儿牛血清（FBS）收集管（1.5 mL管）。
3. 实验当天:将水浴设置为37°C。
4. 在37°C下预热Dulbecco的改性鹰介质（DMEM），并在15 mL离心管中为每个样品准备2 mL的1x分离缓冲液（表1）。
   注:为两个睾丸准备了 2 mL 分离缓冲器。有关分离缓冲区配方，请参阅表 1。

2. 动物解剖和睾丸细胞悬浮的准备

1. 牺牲一只8周大的雄性老鼠，在二氧化碳室中离开至少10分钟。
2. 去除睾丸，并放在含有 2 mL 冰冷磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 的 60 mm 培养皿上。
3. 从睾丸上取下图尼卡阿尔布吉纳。用钳子轻轻分离，稍微分散半尼的管。
4. 将半尼性管转到 100 mm 培养皿中，用一滴新的冰冷 PBS 和用钳子轻轻解开半尼性管。重复此洗涤 3 次，以尽可能去除间位细胞。
5. 在含有2 mL分离缓冲液的15 mL管中孵育半尼特管，在37°C下孵育20分钟。
6. 使用 1000 μL 微管轻轻移液管 20 次。
7. 孵育6分钟。重复轻轻移液20次。
8. 孵育3分钟。重复轻轻移液 10 次，直到没有可见的块保留。
9. 将 10 mL 的 FACS 缓冲液添加到悬架中。在室温下以 300 x g 离心 5 分钟，然后丢弃上一代。
10. 重复步骤2.9两次，以去除精子和尽可能多的碎片。

3. 细胞染色

1. 用 3 mL 的 FACS 缓冲液（表 1）将细胞颗粒重新悬浮，并通过 70 μm 尼龙细胞滤网将细胞悬浮液过滤到 50 mL 管中。
   注:预计细胞产量约为每两个睾丸1亿个细胞（来自8周大的B6野生型小鼠）。
2. 计算细胞数，将10%的细胞分成新的管子，作为未污染的负对，并留在冰上。
3. 将6μL的DCV污渍（原浓度为5 mM）加入剩余细胞悬浮液并混合好。最终浓度为10μM，容量约为1亿个细胞。
4. 在黑暗中37°C孵育30分钟。每 10 分钟轻轻摇动一次电池悬架。
5. 孵育后，无需洗涤步骤，直接将5μL的DNase I（库存浓度为10mg/mL）添加到细胞悬浮液中，并通过35μm尼龙网盖将细胞过滤成5 mL FACS管。将样品放在冰上直到分拣。

4. 流式细胞学和实验门

1. 准备 FACS 单元分拣机。确保 FACS 细胞分拣机配备激励光学器件:紫罗兰 （405-nm） 激光器;检测光学元件:450/50带通的滤波器组合[用于DCV-蓝色检测的相同滤波器组4×6-6-6-2-苯酚（DAPI）]和665/30带通（用于DCV-红色检测的同一过滤器组）。在这里，我们使用索尼SH800S细胞分拣机作为例子。
2. 创建新的实验并设置以下显示要优化的参数的工作图:单击"工作表工具"菜单栏上的"新密度"，以创建线性比例上的正向散点面积 （FSC-A） 与后散射 = 面积 （BSC-A） 密度图。单击"新直方图"以在对数刻度上创建 DCV 蓝色直方图图图。
3. 简要地涡旋未沾污的负控制（从步骤 3.2 开始）并加载样品。
4. 单击"开始"和"记录"开始处理未污染的样本。在样品运行时，单击"检测器和阈值设置"，通过向上或向下调整光电倍增管 （PMT） 电压来优化 FSC 和 BSC 电压，从而将未污染的电池放在 FSC/BSC 图的刻度上。
5. 在样本运行时，在"FL1:DAPI"上上下调整PMT电压，以定位DCV-蓝色直方图对数图第一个十年中DCV负量的位置（图2A）。完成 PMT 电压调整后，单击"停止"卸载未污染的样品。
6. 简要涡流样品（从步骤3.5开始）并加载样品。
7. 单击"下一管"为 DCV 染色样本创建新工作表;并单击"开始"和"记录"获取 DCV 染色样本，记录 ≥ 1 x 10^{6 事件} 的记录。添加以下工作图:单击"工作表工具"菜单栏上的"新密度"，以在线性比例上创建 FSC-H（高度）与 FSC-W（宽度）密度图;单击"新密度"以线性比例创建 DCV 蓝色与 DCV 红色密度图。录制 1 ≥ x 10⁶ 事件后，单击"停止"并卸载示例。
8. 在 FSC-A 与 BSC-A 密度图上，单击"绘图工具"菜单栏上的"多边形"以绘制大门"单元格"以包括大多数单元格并排除小碎片（图 2B）。将门"细胞"应用于FSC-H与FSC-W密度图。单击"矩形"绘制"单细胞"门以排除非单个单元格（图 2C）。
9. 将"单单元"门应用于 DCV 蓝色与 DCV 红色密度图，并调整比例以捕获扩展轮廓，如图2D 所示。单击"绘图工具"菜单栏上的"多边形"以绘制一个"DCV"门以排除未污染的单元格和侧总体（图 2D）。
10. 将"DCV" 门应用于线性刻度上的 DCV 蓝色直方图图。三个主要峰是指不同的DNA含量:1C、2C和4C（图2E）。
11. 单击"新密度"以线性比例创建 DCV 蓝色与 DCV-红色密度图，并应用"DCV"门从图 2E 执行反向浇注以定位 1C 和 4C 比例（图 2F）。单击"椭圆"在 1C 总体（位于压缩区域（门 1C）内绘制门。单击"多边形"在 4C 总体上绘制一个门，即连续曲线（门 4C）。
12. 单击"新密度"以线性比例创建 DCV 蓝色与 DCV 红色密度图，并应用"4C"门;调整比例以放大并单击"多边形"以绘制"4C_1"门，以进行更精确的选择（图 2G）。
13. 单击"新密度"以线性比例创建新的 FSC-A 与 BSC-A 密度图，并应用"4C_1"门;将有三个富集种群，其大小与与钩端氨酸（L）/zygotene（Z）、帕奇泰尼（P）和二苯（D）精子细胞对应的大小分离。单击"多边形"或"椭圆"以绘制 3 个门:"L/Z"，"P"和"D"基于不断增长的大小 （图 2H）。
14. 单击"新点图"，以线性比例创建 DCV 蓝色与 DCV-红色颜色点图，以应用栅极，并确保三个比例在"4C_1"门内连续排列（图 2I）。
15. 同样，对于 1C总体，单击"新密度"以在线性比例上创建新的 FSC-A 与 BSC-A 密度图，并应用"1C"门，选择细胞的统一大小作为纯圆形精子群体，然后单击"椭圆"绘制"RS"门（图 2J）。

5. 排序雄性生殖细胞亚细胞

1. 准备含有 500 μL 50% FBS 的 1.5 mL 管，用于细胞收集，将收集管加载到收集器中，然后单击"负载收集"。
2. 点击"下一管"，"开始"，"记录"和"排序开始"。对于使用双向系统，允许两个感兴趣的群体同时分类到收集设备中，遵循成对组合:结合（L）/zygotene （Z） 和基于L/Z和P背门的帕奇腾（P）精子细胞;圆形精子 （RS） 和二甲苯 （D） 精子细胞基于 RS 和 D 背门。
3. 在示例运行时，将流速调整为 +3000 事件/s，以获得最有效的排序。

6. 已排序细胞的纯度分析

1. 收集≥ 10，000 个细胞/每个群体。执行细胞免疫，以确认子阶段。
2. 在 4 °C 下 以 300 x g 离心 5 分钟，并小心丢弃上清液，将大约 110 μL 的液体留在管底。
3. 在显微镜下观察10μL的细胞悬浮液，并评估细胞形态和数量。
4. 将 100 μL 的细胞悬浮液涂抹到每个样品室幻灯片上（ 参见材料表），然后将腔室加载到细胞平上。
5. 在室温下以30 x g 旋转样品5分钟。用疏水笔在细胞周围画一个圆圈。在室温下，在实验室工作台上干燥幻灯片几分钟。
6. 在幻灯片的圆圈中放置 50 μL 的 PBS 并点击关闭。
7. 在幻灯片的圆圈中加入原抗体溶液（PBS中5%驴血清的稀释原抗体，聚糖20）在4°C下孵育。
   注:为了判断美的精子细胞的亚位，检测出SYCP3，这是美的染色体轴的标记，而+2AX是DNA损伤反应的标记。（关于抗体工作浓度，请参阅 材料表）。
8. 从幻灯片中点击掉主抗体溶液。
9. 在幻灯片的圆圈中放置 50 μL 的 PBS 并点击关闭。重复一次。
10. 在幻灯片的圆圈中加入二次抗体溶液（用0.02%聚糖20稀释PBS中的二次抗体），并在室温下在黑暗中孵育1小时。
11. 在幻灯片的圆圈中放置 50 μL 的 PBS 并点击关闭。重复一次。
12. 加入 50 μL 的 DAPI（库存浓度为 0.1 μg/mL）污渍 5 分钟，然后点开。
13. 在幻灯片上添加 1-2 滴安装介质。用盖玻璃小心地盖住安装介质，轻轻按压盖玻璃以去除额外的安装介质和气泡。幻灯片已准备好进行显微镜评估。

结果

此排序协议的代表性结果如图3 所示。两个睾丸（一只鼠标）的总分拣时间通常为3小时左右，这取决于细胞悬浮液的浓度和分拣速度。分类后，通过SYCP3和+2AX的免疫处理确认精子细胞的纯度（图3A）。排序L/Z、P、D精子细胞分数的代表性纯度分别约为80.4%、90.6%和87.6%（图3C）。我们根据先前19日公布的标准确定^子阶段

讨论

在这里，我们提出了一个实用和简单的协议，从单个成年雄性小鼠中分离精子细胞和精子的亚群。为了确保此协议的可重复性，有一些关键步骤需要注意。在酶消化之前，洗涤步骤旨在去除间分裂细胞;消化后，这一步有助于去除精子和碎片。洗/离心3次很重要。在我们的分离缓冲液配方中，几种不同酶的组合有助于将睾丸分离到单细胞悬浮液中，而不会造成过多的细胞损伤。轻轻移液以避免造成?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tube	Watson	131-7155C
100 mm Petri dish	Corning, Falcon	351029
15 mL Centrifuge tube	Watson	1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh)	Corning, Falcon	352235
50 mL Centrifuge tube	Watson	1342-050S
60 mm Petri dish	Corning, Falcon	351007
70 µm nylon mesh	Corning, Falcon	352350
Cell sorter	Sony	SH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-free	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-23141
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196
Cover glass	Fisher	12-544-G
Cytospin 3	Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Fisher	D1306	working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase I	Sigma	D5025-150KU
Donkey serum	Sigma	S30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11885076
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000044
Histone H1t antibody	gift from Mary Ann Handel		1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175095
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher	P36930
rH2AX antibody	Millipore	05-635	working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody	QED Bioscience	55101	working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15
SYCP3 antibody	Abcam	ab205846	working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20)	Sigma	P9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)	Invitrogen	V35003
Water bath