Isolement des cellules spermatogéniques murines à l’aide d’un colorant liant à l’ADN perméable à la cellule violette

Résumé

Ici, nous présentons une méthode simple et efficace pour isoler les cellules germinales méiotiques et post-méiotiques vivantes des testicules adultes de souris. À l’aide d’une faible cytotoxicité, d’un colorant liant l’ADN violet et d’un tri cellulaire activé par fluorescence, on peut isoler des populations de cellules spermatogéniques hautement enrichies pour de nombreuses applications en aval.

Résumé

L’isolement des spermatocytes méiotiques est essentiel pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la méiose et à la spermatogenèse. Bien qu’il existe des protocoles établis d’isolement cellulaire à l’aide de la coloration Hoechst 33342 en combinaison avec le tri cellulaire activé par fluorescence, il nécessite des trieurs cellulaires équipés d’un laser ultraviolet. Ici nous décrivons un protocole d’isolement cellulaire utilisant la tache de violet de DyeCycle (DCV), un colorant liant d’ADN de basse cytotoxicité structurellement semblable à Hoechst 33342. DCV peut être excité par les lasers ultraviolets et violets, ce qui améliore la flexibilité du choix de l’équipement, y compris un trieur de cellules non équipé d’un laser ultraviolet. En utilisant ce protocole, on peut isoler trois sous-populations de cellules vivantes dans la prophase méiotique I, y compris le leptotene/zygotène, le pachytene et les spermatocytes diplotènes, ainsi que les spermatides ronds post-méiotiques. Nous décrivons également un protocole pour préparer la suspension à cellule unique à partir de testicules de souris. Dans l’ensemble, la procédure nécessite un court laps de temps à compléter (4-5 heures selon le nombre de cellules nécessaires), ce qui facilite de nombreuses applications en aval.

Introduction

La spermatogenèse est un processus complexe dans lequel une petite population de cellules souches spermatogoniales soutiennent la production continue d’un grand nombre de spermatozoïdes tout au long de la^{vie adulte 1,2}. Pendant la spermatogenèse, le remodelage dynamique de chromatine a lieu quand les cellules spermatogenic subissent la méiose pour produire des spermatides haploïdes^3,4,5. L’isolement des spermatocytes méiotiques est essentiel à l’investigation moléculaire, et plusieurs approches différentes pour isoler les spermatocytes méiotiques ont été établies, y compris la séparation basée sur la sédimentation^6,7 et le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17}. Toutefois, ces méthodes ont des limites techniques. Alors que la séparation basée sur la sédimentation donne un grand nombre de cellules 5 ,^6,7,il^està forte intensité de main-d’œuvre. La méthode établie à base de FACS utilise Hoechst 33342 (Ho342) pour séparer les spermatocytes méiotiques en fonction de la teneur en ADN et des propriétés de diffusion de la lumière et nécessite des trieurs cellulaires FACS équipés d’un laser ultraviolet (UV)^8,9,10,11. D’autres méthodes à base de FACS nécessitent des lignées de souris transgéniques qui expriment des protéines florescentes, la synchronisation de la spermatogenèse^12,ou la fixation cellulaire et l’étiquetage des anticorps qui n’est pas compatible avec l’isolement des cellules^{vivantes 13}. Bien qu’il existe une autre méthode alternative utilisant un colorant liant l’ADN perméable à la cellule, DyeCycle Green tache^14,15,16,17, cette méthode est recommandée pour l’isolement des cellules spermatogenic de testicules juvéniles. Par conséquent, il y a un besoin critique de développer une méthode simple et robuste d’isolement pour les spermatocytes méiotiques vivants qui peuvent être appliqués à n’importe quelle souche de souris de n’importe quel âge et qui peuvent être exécutés utilisant n’importe quel trieur de cellules facs.

Ici, nous décrivons un tel protocole d’isolement cellulaire recherché depuis longtemps en utilisant la tache DyeCycle Violet (DCV). Le DCV est une faible cytotoxicité, un colorant liant l’ADN perméable aux cellules structurellement similaire à Ho342, mais avec un spectre d’excitation déplacé vers la gamme^{violette 18}. En outre, DCV a un spectre d’émissions plus large par rapport à DCG. Ainsi, il peut être excité par les lasers UV et violets, ce qui améliore la flexibilité de l’équipement, permettant l’utilisation d’un trieur de cellules FACS non équipé d’un laser UV. Le protocole DCV présenté ici utilise la séparation bidimensionnelle avec le bleu DCV et le rouge DCV, imitant l’avantage du protocole Ho342. Avec cet avantage, notre protocole DCV nous permet d’isoler les cellules germinales hautement enrichies des testicules adultes. Nous fournissons un protocole de gating détaillé pour isoler les cellules spermatogenic vivantes des testicules adultes de souris d’une souris (de deux testicules). Nous décrivons également un protocole efficace et rapide pour préparer la suspension à cellule unique à partir de testicules de souris qui peuvent être utilisés pour cet isolement cellulaire. La procédure nécessite un court laps de temps (préparation de la suspension à cellule unique - 1 heure, colorant - 30 min, et le tri cellulaire - 2-3 heures: total - 4-5 heures selon le nombre de cellules nécessaires; Figure 1). Après l’isolement cellulaire, un large éventail d’applications en aval, y compris l’ARN-seq, ATAC-seq, ChIP-seq, et la culture cellulaire peuvent être complétés.

Protocole

Ce protocole suit les lignes directrices du Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (protocole no. IACUC2018-0040) au Cincinnati Children’s Hospital Medical Center.

1. Installation d’équipement et de reagent pour la préparation de la suspension des cellules testiculaires

1. Préparer chaque stock d’enzymes dans la solution de sel équilibré (HBSS) de Hanks et les conserver à -20 °C.
   REMARQUE : Préparez-vous à tout moment avant l’expérience.
2. Un jour avant l’expérience : Tubes de collecte de manteaux (tubes de 1,5 mL) avec sérum bovin fœtal (FBS) à 4 °C pendant la nuit.
3. Le jour de l’expérience : Réglez le bain d’eau à 37 °C.
4. Préchauffer le medium d’aigle modifié (DMEM) de Dulbecco à 37 °C et préparer 2 mL de tampon de dissociation 1x pour chaque échantillon juste avant utilisation (tableau 1) dans un tube de centrifugeuse de 15 mL.
   REMARQUE : Un tampon de dissociation de 2 mL est préparé pour deux testicules. Pour la recette tampon de dissociation, veuillez consulter le tableau 1.

2. Dissection animale et préparation de la suspension des cellules testiculaires

1. Sacrifiez une souris mâle de 8 semaines en partant dans une chambre de dioxyde de carbone pendant au moins 10 minutes.
2. Retirer les deux testicules et les placer sur une boîte de Pétri de 60 mm contenant 2 mL de solution saline tamponnée de phosphate glacé (PBS).
3. Retirer la tunica albuginea des testicules. Dispersez légèrement les tubules séminifères en les séparant doucement avec des forceps.
4. Transférer les tubules séminifères dans une boîte de Pétri de 100 mm avec une nouvelle goutte de PBS glacé et démêler délicatement les tubules séminifères avec des forceps. Répétez ce lavage 3 fois pour enlever les cellules interstitielles autant que possible.
5. Incuber des tubules séminifères non emmêlés dans un tube de 15 mL contenant 2 mL de tampon de dissociation à 37 °C pendant 20 min.
6. Pipette doucement les tubules 20 fois à l’aide d’une micropipette de 1000 μL.
7. Incuber pendant 6 min. Répétez le pipetage doux 20 fois.
8. Incuber pendant 3 min. Répétez le pipetage doux 10 fois jusqu’à ce qu’il ne reste pas de morceaux visibles.
9. Ajouter 10 mL de tampon FACS à la suspension. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à température ambiante et jeter le supernatant.
10. Répétez l’étape 2.9 deux fois pour enlever le spermatozoa et autant de débris que possible.

3. Coloration cellulaire

1. Resuspendez la pastille cellulaire avec 3 mL de tampon FACS (Tableau 1) et filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire en nylon de 70 μm dans un tube de 50 mL.
   REMARQUE : Le rendement cellulaire attendu est d’environ 100 millions de cellules par deux testicules (provenant d’une souris de type sauvage B6 de 8 semaines).
2. Comptez le numéro de cellule et divisez 10% des cellules en un nouveau tube comme le contrôle négatif non taché et laissez sur la glace.
3. Ajouter 6 μL de tache DCV (la concentration initiale est de 5 mM) à la suspension cellulaire restante et bien mélanger. La concentration finale est de 10 μM, et la capacité est d’environ 100 millions de cellules.
4. Incuber à 37 °C pendant 30 min dans l’obscurité. Secouez doucement la suspension cellulaire toutes les 10 minutes.
5. Après l’incubation, sans étape de lavage, ajouter directement 5 μL de DNase I (la concentration en stock est de 10 mg/mL) à la suspension cellulaire et filtrer les cellules dans un tube FACS de 5 mL à travers le bouchon en nylon de 35 μm. Gardez les échantillons sur la glace jusqu’au tri.

4. Cytométrie d’écoulement et portes expérimentales

1. Préparez le trieur de cellules FACS. Assurez-vous que le trieur de cellules FACS est équipé de l’optique Excitation : laser Violet (405 nm); Optique de détection : combinaison de filtre de 450/50 bandpass [même ensemble de filtre de 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) pour la détection bleu DCV] et de 665/30 bandpass [même ensemble de filtre d’Allophycocyanin (APC) pour la détection rouge DCV]. Ici, nous utilisons Sony SH800S trieur de cellules à titre d’exemple.
2. Créez une nouvelle expérience et configurez les parcelles de travail suivantes affichant les paramètres à optimiser : Cliquez sur la barre de menu «Outils defeuillede travail » pour créer une zone de dispersion vers l’avant - zone (FSC-A) vs dispersion arrière – parcelle de densité de zone (BSC-A) à l’échelle linéaire. Cliquez sur" Nouvel histogramme" pour créer une intrigue d’histogramme bleu DCV à l’échelle logarithmique.
3. Vortex brièvement le contrôle négatif non taché (à partir de l’étape 3.2) et charger l’échantillon.
4. Cliquez sur "Démarrer" et "Enregistrer" pour commencer à traiter l’échantillon non taché. Pendant que l’échantillon est en cours d’exécution, cliquez sur «Paramètres détecteuret seuil » pour optimiser les tensions FSC et BSC en ajustant à la fois les tensions du tube photomultiplier (PMT) vers le haut ou vers le bas pour placer les cellules non tachées sur l’échelle de la parcelle FSC/BSC.
5. Ajustez la tension pmt de haut en bas sur "FL1: DAPI" tandis que l’échantillon est en cours d’exécution pour localiser la position de la population négative de DCV dans la première décennie de la parcelle logarithmique d’histogramme bleu DCV (figure 2A). Après avoir terminé l’ajustement de tension PMT, cliquez sur" Stop" pour décharger l’échantillon non taché.
6. Vortex brièvement l’échantillon (à partir de l’étape 3.5) et charger l’échantillon.
7. Cliquez sur "Next Tube" pour créer une nouvelle feuille de travail pour l’échantillon teinté de DCV; et cliquez sur "Démarrer" et "Enregistrer" pour acquérir l’échantillon teinté de DCV, enregistrer ≥ 1 x 10⁶ événements. Ajouter les parcelles de travail suivantes : Cliquez sur la barre de menu «Nouvelles densités» sur la barre de menu «Worksheet Tools» pour créer une parcelle de densité FSC-H (hauteur) vs FSC-W (largeur) à l’échelle linéaire; Cliquez sur" Nouvelle densité" pour créer une parcelle de densité bleu DCV vs DCV-rouge sur une échelle linéaire. Après avoir enregistré ≥ 1 x 10⁶ événements, cliquez sur "Stop" et déchargez l’échantillon.
8. Sur la parcelle de densité FSC-A vs BSC-A, cliquez sur "Polygone" sur la barre de menu "Plot Tools" pour dessiner une grande porte "Cells" pour inclure la plupart des cellules et exclure les petits débris (Figure 2B). Appliquez la porte "Cellules" sur la parcelle de densité FSC-H vs FSC-W. Cliquez sur" Rectangle" pour dessiner une porte "Cellules simples" pour exclure les cellules non-individuelles (Figure 2C).
9. Appliquezla porte« Cellules simples » sur la parcelle de densité bleu DCV vs DCV-rouge et ajustez l’échelle pour capturer un profil étendu tel qu’indiqué dans la figure 2D. Cliquez sur "Polygone" sur la barre de menu "Plot Tools" pour dessiner une porte "DCV" pour exclure les cellules non tachées et la population latérale (Figure 2D).
10. Appliquez laporte « DCV» sur la parcelle d’histogramme bleu DCV à l’échelle linéaire. Les trois principaux pics se réfèrent à des teneurs en ADN différentes : 1C, 2C et 4C (Figure 2E).
11. Cliquez sur «Nouvelle densité» pour créer une parcelle de densité bleu DCV vs DCV-rouge sur une échelle linéaire et appliquer la porte «DCV» pour effectuer des gations arrière à partir de la figure 2E pour localiser les populations de 1C et 4C (figure 2F). Cliquez sur" Ellipse" pour dessiner une porte sur la population de 1C, qui se trouve dans une zone condensée (porte 1C). Cliquez sur" Polygone" pour dessiner une porte sur la population 4C qui est une courbe continue (porte 4C).
12. Cliquez sur« Nouvelle densité» pour créer une parcelle de densité bleu DCV vs DCV-rouge sur une échelle linéaire et appliquer la porte « 4C » ; ajuster l’échelle pour zoomer et cliquer sur "Polygone" pour dessiner une porte " 4C_1 " pour une sélection plus précise (Figure 2G).
13. Cliquez sur« Nouvelle densité» pour créer une nouvelle parcelle de densité FSC-A vs BSC-A sur une échelle linéaire et appliquer la porte « 4C_1 » ; il y aura trois populations enrichies séparées par taille correspondant aux spermatocytes leptotene (L) /zygotène (Z), pachytene (P) et diplotène (D). Cliquez sur "Polygone" ou "Ellipse" pour dessiner 3 portes: « L/Z », « P », et « D » en fonction de la taille croissante (Figure 2H).
14. Cliquez sur "Nouvelle parcelle de point" pour créer une parcelle de point couleur bleu DCV vs DCV-rouge sur une échelle linéaire pour appliquer la porte et s’assurer que les trois populations sont dans un ordre continu dans la porte " 4C_1 " ( Figure2I).
15. De même, pour la population de 1C, cliquez sur «Nouvelle densité» pour créer une nouvelle parcelle de densité FSC-A vs BSC-A sur une échelle linéaire et appliquez la porte « 1C », sélectionnez la taille unifiée des cellules comme population ronde pure de spermatid, et cliquez sur« Ellipse» pour dessiner une porte« RS»(figure 2J).

5. Trier les sous-populations masculines de cellules germinales

1. Préparez des tubes de 1,5 mL contenant 500 μL 50% FBS pour la collecte cellulaire et chargez le tube de collecte dans le collecteur et cliquez sur "Load Collection« .
2. Cliquez sur "Next Tube« , "Start« , "Record" et "Sort Start« . Pour l’utilisation d’un système bi-sens qui permet de trier deux populations d’intérêt en même temps dans le dispositif de collecte, suivez des combinaisons bi-sensées : leptotene (L) /zygotène (Z) et spermatocytes pachytene (P) basés sur les portes arrière L/Z et P; Spermatocytes ronds (RS) et diplotène (D) à base de portes arrière RS et D.
3. Pendant que l’échantillon est en cours d’exécution, ajustez le débit à ~3000 événements/s pour obtenir le tri le plus efficace.

6. Analyse de pureté des cellules triées

1. Recueillir ≥ 10 000 cellules/chaque population. Effectuer l’immunostaining cellulaire pour confirmer le sous-scène.
2. Centrifugeuse à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter soigneusement le supernatant, en gardant environ 110 μL du liquide dans le fond du tube.
3. Prenez une goutte de suspension cellulaire de 10 μL pour observer au microscope et évaluer la morphologie et le nombre des cellules.
4. Appliquez 100 μL de suspension cellulaire sur chacune des diapositives de chambre de l’échantillon (voir tableau des matériaux)et chargez les chambres sur le Cytospin.
5. Faire tourner les échantillons à 30 x g pendant 5 min à température ambiante. Dessinez un cercle autour de la cellule avec un stylo hydrophobe. Toboggans secs sur le banc de laboratoire pendant quelques minutes à température ambiante.
6. Déposez 50 μL de PBS dans le cercle de la diapositive et appuyez sur.
7. Ajouter la solution d’anticorps primaires (diluer les anticorps primaires avec 5% de sérum d’âne dans PBS avec 0,02% polysorbate 20) dans le cercle de la lame et incuber à 4 °C pendant la nuit.
   NOTE : Pour juger le sous-étage des spermatocytes méiotiques, SYCP3 a été détecté, qui est un marqueur des axes méiotiques de chromosome, et γH2AX, qui est un marqueur de réponse de dommages d’ADN. (Pour la concentration de travail des anticorps, veuillez consulter le Tableau des matériaux).
8. Appuyez sur la solution d’anticorps primaire à partir des diapositives.
9. Déposez 50 μL de PBS dans le cercle de la diapositive et appuyez sur. Répétez une fois.
10. Ajouter la solution secondaire d’anticorps (diluer les anticorps secondaires dans pbs avec 0,02% Polysorbate 20) dans le cercle de la glissière et incuber à température ambiante pendant 1 h dans l’obscurité.
11. Déposez 50 μL de PBS dans le cercle de la diapositive et appuyez sur. Répétez une fois.
12. Ajouter 50 μL de DAPI (la concentration en stock est de 0,1 μg/mL) tache pendant 5 min et appuyez sur.
13. Ajouter 1-2 gouttes de supports de montage sur les diapositives. Couvrez soigneusement le support de montage avec un verre de couverture et appuyez doucement sur le verre de couverture pour enlever le support supplémentaire et la bulle d’air. Les diapositives sont prêtes pour l’évaluation de la microscopie.

Résultats

Un résultat représentatif de ce protocole de tri est indiqué à la figure 3. Le temps total de tri de deux testicules (une souris) est généralement d’environ 3 heures, ce qui dépend de la concentration de suspension cellulaire et de la vitesse de tri. Après le tri, la pureté des spermatocytes est confirmée par l’immunostaining de SYCP3 et γH2AX (Figure 3A). La pureté représentative des fractions triées de spermatocytes L/Z, P, D est d’environ ...

Discussion

Ici nous présentons un protocole pratique et simple pour isoler des sous-populations des spermatocytes et des spermatds d’une souris mâle adulte simple. Pour assurer la reproductibilité de ce protocole, certaines étapes critiques doivent être prises. Avant la digestion des enzymes, l’étape de lavage vise à éliminer les cellules interstitielles; après digestion, cette étape aide à enlever le spermatozoa et les débris. Le lavage/centrifugage 3 fois est important. Dans notre recette tampon de dissociation, l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tube	Watson	131-7155C
100 mm Petri dish	Corning, Falcon	351029
15 mL Centrifuge tube	Watson	1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh)	Corning, Falcon	352235
50 mL Centrifuge tube	Watson	1342-050S
60 mm Petri dish	Corning, Falcon	351007
70 µm nylon mesh	Corning, Falcon	352350
Cell sorter	Sony	SH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-free	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-23141
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196
Cover glass	Fisher	12-544-G
Cytospin 3	Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Fisher	D1306	working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase I	Sigma	D5025-150KU
Donkey serum	Sigma	S30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11885076
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000044
Histone H1t antibody	gift from Mary Ann Handel		1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175095
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher	P36930
rH2AX antibody	Millipore	05-635	working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody	QED Bioscience	55101	working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15
SYCP3 antibody	Abcam	ab205846	working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20)	Sigma	P9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)	Invitrogen	V35003
Water bath