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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Hier präsentieren wir eine einfache und effiziente Methode, um lebende meiotische und postmeiotische Keimzellen von erwachsenen Maushoden zu isolieren. Mit einem zytotoxischen, violett-erregten DNA-Bindungsfarbstoff und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung kann man hoch angereicherte spermatogene Zellpopulationen für viele nachgelagerte Anwendungen isolieren.

Zusammenfassung

Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist wichtig, um molekulare Mechanismen zu untersuchen, die der Meiose und Spermatogenese zugrunde liegen. Obwohl es etablierte Zellisolationsprotokolle mit Hoechst 33342 Färbung in Kombination mit fluoreszenzaktivierter Zellsortierung gibt, sind Zellsortierer mit einem ultravioletten Laser erforderlich. Hier beschreiben wir ein Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck, einem DNA-Bindungsfarbstoff mit geringer Zytotoxizität, der Hoechst 33342 strukturell ähnelt. DCV kann sowohl von ultravioletten als auch von violetten Lasern angeregt werden, was die Flexibilität der Geräteauswahl verbessert, einschließlich eines Zellsortierers, der nicht mit einem ultravioletten Laser ausgestattet ist. Mit diesem Protokoll kann man drei lebende Zellsubpopulationen in der meiotischen Prophase I isolieren, einschließlich Leptotene/Zygoten, Pachyten und Diploten-Spermatozyten sowie postmetiotische runde Spermatien. Wir beschreiben auch ein Protokoll zur Vorbereitung der einzelzelligen Suspension von Maushoden. Insgesamt benötigt das Verfahren eine kurze Zeit (4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen), was viele nachgelagerte Anwendungen erleichtert.

Einleitung

Spermatogenese ist ein komplexer Prozess, bei dem eine kleine Population von SpermatogonialStammzellen die kontinuierliche Produktion einer großen Anzahl von Spermien während des Erwachsenenlebens1,2aufrechterhält. Während der Spermatogenese findet die dynamische Chromatin-Remodellierung statt, wenn spermatogene Zellen einer Meiose unterzogen werden, um haploide Spermaatiden3,4,5zu produzieren. Die Isolierung meiotischer Spermatozyten ist für die molekulare Untersuchung von wesentlicher Bedeutung, und es wurden verschiedene Ansätze zur Isolierung meiotischer Spermatozyten etabliert, einschließlich sedimentationsbasierter Trennung6,7 und fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Diese Methoden haben jedoch technische Einschränkungen. Während sedimentationsbasierte Trennung eine große Anzahl von Zellenergibt 5,6,7, ist es arbeitsintensiv. Die etablierte FACS-basierte Methode verwendet Hoechst 33342 (Ho342), um meiotische Spermatozyten basierend auf DNA-Gehalt und Lichtstreuungseigenschaften zu trennen und erfordert FACS-Zellsortierer, die mit einem ultravioletten (UV) Laser8,9,10,11ausgestattet sind. Alternative FACS-basierte Methoden erfordern transgene Mauslinien, die floreszierende Proteine ausdrücken, Synchronisation von Spermatogenese12oder Zellfixierung und Antikörperkennzeichnung, die nicht mit der Isolierung von lebenden Zellen kompatibel ist13. Zwar gibt es eine andere alternative Methode mit einem zelldurchlässigen DNA-Bindungsfarbstoff, DyeCycle Green Stain14,15,16,17, Diese Methode wird für die Isolierung von spermaatogenen Zellen aus juvenilen Hoden empfohlen. Daher besteht die kritische Notwendigkeit, eine einfache und robuste Isolationsmethode für lebende meiotische Spermatozyten zu entwickeln, die auf jeden Mausstamm jeden Alters angewendet werden können und mit jedem FACS-Zellsortierer durchgeführt werden können.

Hier beschreiben wir ein so lang ersehntes Zellisolationsprotokoll mit dem DyeCycle Violet (DCV) Fleck. DCV ist ein geringer Zytotoxizität, zelldurchlässiger DNA-Bindungsfarbstoff strukturell ähnlich Ho342, aber mit einem Anregungsspektrum in Richtung des violetten Bereichs18verschoben. Darüber hinaus verfügt DCV über ein breiteres Emissionsspektrum im Vergleich zu DCG. So kann es sowohl durch UV- als auch violette Laser angeregt werden, was die Flexibilität der Geräte verbessert, so dass ein FACS-Zellsortierer nicht mit einem UV-Laser ausgestattet ist. Das hier vorgestellte DCV-Protokoll verwendet eine zweidimensionale Trennung mit DCV-Blau und DCV-Rot, was den Vorteil des Ho342-Protokolls nachahmt. Mit diesem Vorteil ermöglicht uns unser DCV-Protokoll, hoch angereicherte Keimzellen aus den adulten Hoden zu isolieren. Wir bieten ein detailliertes Gating-Protokoll, um lebende spermatogene Zellen von erwachsenen Maushoden einer Maus (aus zwei Hoden) zu isolieren. Wir beschreiben auch ein effizientes und schnelles Protokoll zur Vorbereitung einer einzelzelligen Suspension aus Maushoden, die für diese Zellisolierung verwendet werden können. Das Verfahren erfordert eine kurze Zeit zu vervollständigen (Vorbereitung der einzelzelligen Suspension - 1 Stunde, Farbstoff Färbung - 30 min, und Zellsortierung - 2-3 Stunden: insgesamt - 4-5 Stunden abhängig von der Anzahl der benötigten Zellen; Abbildung 1). Nach der Zellisolation kann eine breite Palette von nachgelagerten Anwendungen wie RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq und Zellkultur abgeschlossen werden.

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Protokoll

Dieses Protokoll folgt den Richtlinien des Institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung (Protokoll Nr. IACUC2018-0040) im Cincinnati Children es Hospital Medical Center.

1. Ausrüstungs- und Reagenzaufbau zur Herstellung der Hodenzellsuspension

  1. Bereiten Sie jeden Enzymbestand in 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) vor und lagern Sie bei -20 °C . (Tabelle1).
    HINWEIS: Bereiten Sie jederzeit vor dem Experiment vor.
  2. Einen Tag vor dem Experiment: Mantelsammelrohre (1,5 ml Röhren) mit Fetal rinderserum (FBS) bei 4 °C über Nacht.
  3. Am Tag des Experiments: Stellen Sie das Wasserbad auf 37 °C.
  4. Vorwärmes Dulbecco es Modified Eagle Medium (DMEM) bei 37 °C und bereiten 2 ml 1x Dissoziationspuffer für jede Probe direkt vor Gebrauch vor (Tabelle 1) in 15 ml Zentrifugenrohr.
    HINWEIS: 2 ml Dissoziationspuffer wird für zwei Hoden vorbereitet. Das Dissoziationspufferrezept finden Sie in Tabelle 1.

2. Tierische Zerlegung und Vorbereitung der Hodenzellsuspension

  1. Opfern Sie eine 8 Wochen alte männliche Maus, indem Sie mindestens 10 min in einer Kohlendioxidkammer zurücklassen.
  2. Entfernen Sie beide Hoden und legen Sie sie auf eine 60 mm Petrischale, die 2 ml eiskalte Phosphat-gepufferte Saline (PBS) enthält.
  3. Entfernen Sie die Tunika albuginea aus den Hoden. Die seminiferen Tubuli leicht zerstreuen, indem sie sich sanft mit Zangen trennen.
  4. Die seminiferen Tubuli mit einem neuen Tropfen eiskaltem PBS in eine 100 mm Petrischale geben und seminiferous Tubuli sanft mit Zangen entwirren. Wiederholen Sie diese Wäsche 3 Mal, um interstitielle Zellen so weit wie möglich zu entfernen.
  5. Inkubieren Sie unverwirrte seminiferöse Tubuli in einem 15 ml-Rohr, das 2 ml Dissoziationspuffer bei 37 °C für 20 min enthält.
  6. Die Tubuli mit einer 1000-L-Mikropipette 20 Mal sanft pipette.
  7. Inkubieren Für 6 min. Wiederholen Sie sanftes Pipettieren 20 Mal.
  8. Inkubieren Sie für 3 min. Wiederholen Sie die sanfte Pipettierung 10 Mal, bis keine sichtbaren Brocken mehr sichtbar sind.
  9. Fügen Sie der Federung 10 ml FACS-Puffer hinzu. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur und den Überstand entsorgen.
  10. Wiederholen Sie Schritt 2.9 zweimal, um die Spermatozoen und so viel Schmutz wie möglich zu entfernen.

3. Zellfärbung

  1. Setzen Sie das Zellpellet mit 3 ml FACS-Puffer (Tabelle 1) wieder auf und filtern Sie die Zellsuspension durch ein 70 m Nylon-Zellsieb in ein 50 ml-Rohr.
    HINWEIS: Die erwartete Zellausbeute beträgt etwa 100 Millionen Zellen pro zwei Hoden (von einer 8 Wochen alten B6-Wildtypmaus).
  2. Zählen Sie die Zellzahl und teilen Sie 10% der Zellen in eine neue Röhre als ungefärbte Negative Kontrolle und lassen Sie auf Eis.
  3. Fügen Sie der verbleibenden Zellsuspension 6 l DCV-Färbung (die ursprüngliche Konzentration beträgt 5 mM) hinzu und mischen Sie sie gut. Die Endkonzentration beträgt 10 M, die Kapazität beträgt etwa 100 Millionen Zellen.
  4. Bei 37 °C für 30 min im Dunkeln inkubieren. Schütteln Sie die Zellsuspension alle 10 min.
  5. Nach der Inkubation, ohne Waschschritt, direkt 5 l DNase I (die Lagerkonzentration beträgt 10 mg/ml) in die Zellsuspension geben und die Zellen durch die 35-m-Nylon-Mesh-Kappe in ein 5 ml FACS-Rohr filtern. Halten Sie die Proben auf Eis bis zum Sortieren.

4. Durchflusszytometrie und Versuchstore

  1. Bereiten Sie den FACS-Zellensortierer vor. Stellen Sie sicher, dass der FACS-Zellsortierer mit einer Excitation-Optik ausgestattet ist: Violett (405-nm) Laser; Detektionsoptik: Filterkombination aus 450/50 Bandpass [gleicher Filtersatz aus 4,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) zur DCV-blauen Detektion] und 665/30 Bandpass [gleicher Filtersatz von Allophycocyanin (APC) zur DCV-Rot-Erkennung]. Hier verwenden wir Sony SH800S Zellsortierer als Beispiel.
  2. Erstellen Sie ein neues Experiment und richten Sie die folgenden Arbeitsdiagramme ein, in denen die zu optimierenden Parameter angezeigt werden: Klicken Sie auf "Neue Dichte" in der Menüleiste"Arbeitsblattwerkzeuge", um eine Vorwärtsstreuung - Fläche (FSC-A) vs. Zurückstreuung – Flächendiagramm (BSC-A) auf einer linearen Skala zu erstellen. Klicken Sie auf "Neues Histogramm", um ein DCV-blaues Histogrammdiagramm auf logarithmischer Skala zu erstellen.
  3. Kurz wirbeln Sie die ungefärbte Negativkontrolle (ab Schritt 3.2) und laden Sie die Probe.
  4. Klicken Sie auf "Start" und "Record", um mit der Verarbeitung des nicht befleckten Samples zu beginnen. Während die Probe läuft, klicken Sie auf"Detektor- & Schwellenwerteinstellungen ",um die FSC- und BSC-Spannungen zu optimieren, indem Sie beide Photomultiplier-Rohr-Spannungen (PMT) nach oben oder unten anpassen, um die ungefärbten Zellen auf der Skala des FSC/BSC-Plots zu platzieren.
  5. Passen Sie die PMT-Spannung aufFL1: DAPInach oben und unten an, während die Probe läuft, um die Position der DCV-negativen Population im ersten Jahrzehnt des DCV-blauen histogramm-logarithmischen Diagramms zu lokalisieren (Abbildung 2A). Nachdem Sie die PMT-Spannungseinstellung abgeschlossen haben, klicken Sie auf "Stopp", um die unbefleckte Probe zu entladen.
  6. Wirbeln Sie die Probe kurz (ab Schritt 3.5) und laden Sie die Probe.
  7. Klicken Sie auf"Nächste Röhre", um ein neues Arbeitsblatt für die DCV-befleckte Probe zu erstellen. und klicken Sie auf "Start" und "Record", um die DCV-befleckte Probe zu erhalten, ≥ 1 x 106 Ereignisse aufzuzeichnen. Fügen Sie die folgenden Arbeitsplots hinzu: Klicken Sie auf "Neue Dichte" in der Menüleiste"Arbeitsblattwerkzeuge", um ein FSC-H (Höhe) vs. FSC-W (Breite) Dichtediagramm auf einer linearen Skala zu erstellen; Klicken Sie auf "Neue Dichte", um ein DCV-blau-rot-rotedichtes Diagramm auf einer linearen Skala zu erstellen. Nachdem Sie ≥ 1 x 106 Ereignisse aufgezeichnet haben, klicken Sie auf "Beenden" und entladen Sie das Sample.
  8. Klicken Sie auf der Menüleiste"Plot Tools" auf "Polygon" auf " Polygon " , um ein großes Tor "Zellen" zu zeichnen, um die meisten Zellen einzuschließen und kleine Trümmer auszuschließen (Abbildung 2B). Wenden Sie das Tor "Zellen" auf FSC-H vs. FSC-W Dichteplot an. Klicken Sie auf "Rechteck", um ein "Single Cells" Gate zu zeichnen, um nicht-einzelne Zellen auszuschließen (Abbildung 2C).
  9. Wenden Sie "Single Cells" Gate auf DCV-blau vs. DCV-rote Dichte Diagramm und passen Sie die Skala, um ein erweitertes Profil zu erfassen, wie in Abbildung 2Dgezeigt. Klicken Sie auf "Polygon" auf die Menüleiste "Plot Tools", um ein "DCV" Tor zu zeichnen, um die unbefleckten Zellen und die Seitenpopulation auszuschließen (Abbildung 2D).
  10. Wenden Sie "DCV" Gate auf DCV-blauehistogramm-Plot auf einer linearen Skala an. Die drei Hauptspitzen beziehen sich auf unterschiedliche DNA-Gehalte: 1C, 2C und 4C (Abbildung 2E).
  11. Klicken Sie auf "Neue Dichte", um ein DCV-blaues vs. DCV-rotdichtes Diagramm auf einer linearen Skala zu erstellen und "DCV" Gate anzuwenden, um das Zurückgating aus Abbildung 2E durchzuführen, um die 1C- und 4C-Populationen zu lokalisieren (Abbildung 2F). Klicken Sie auf "Ellipse", um ein Tor auf die 1C-Population zu zeichnen, die sich innerhalb eines kondensierten Bereichs (Tor 1C) befindet. Klicken Sie auf "Polygon", um ein Tor auf der 4C-Population zu zeichnen, die eine kontinuierliche Kurve (Tor 4C) ist.
  12. Klicken Sie auf "Neue Dichte", um ein DCV-blaues vs. DCV-rotedichtedichtes Diagramm auf einer linearen Skala zu erstellen und das "4C"-Gate anzuwenden; Passen Sie die Skala an, um sie zu vergrößern, und klicken Sie auf"Polygon", um ein "4C_1"-Gate für eine genauere Auswahl zu zeichnen (Abbildung 2G).
  13. Klicken Sie auf "Neue Dichte", um ein neues FSC-A vs. BSC-A-Dichtediagramm auf einer linearen Skala zu erstellen und "4C_1"-Gate anzuwenden. Es wird drei angereicherte Populationen geben, die durch die Größe von Leptoten (L) /zygoten (Z), Pachyten (P) und Diploten (D) Spermatozyten getrennt sind. Klicken Sie auf "Polygon" oder "Ellipse", um 3 Tore zu zeichnen: "L/Z", "P" und "D" basierend auf der wachsenden Größe (Abbildung 2H).
  14. Klicken Sie auf"Neues Punktdiagramm", um ein DCV-blaues vs. DCV-rotes Farbpunktdiagramm auf einer linearen Skala zu erstellen, um Gate anzuwenden und sicherzustellen, dass sich die drei Gandaden in einer kontinuierlichen Reihenfolge innerhalb des "4C_1"-Gatebefindens befinden (Abbildung 2I).
  15. In ähnlicher Weise klicken Sie für die 1C-Population auf "Neue Dichte", um ein neues FSC-A vs. BSC-A-Dichtediagramm auf einer linearen Skala zu erstellen und "1C"-Gate anzuwenden, wählen Sie die einheitliche Größe der Zellen als reine runde Spermapopulation aus und klicken Sie auf "Ellipse", um ein "RS" Gate zu zeichnen (Abbildung 2J).

5. Männliche Keimzellsubpopulationen sortieren

  1. Bereiten Sie 1,5 ml-Rohre mit 500 L 50% FBS für die Zellsammlung vor und laden Sie das Sammelrohr in den Kollektor und klicken Sie auf"Lastsammlung".
  2. Klicken Sie auf "Next Tube", "Start", "Record" und "Sort Start". Für die Verwendung eines Zwei-Wege-Systems, das es ermöglicht, zwei von Interesse sindde Populationen gleichzeitig in das Sammelgerät zu sortieren, folgen Sie paarweise Kombinationen: Leptotene (L) /zygoten (Z) und pachytene (P) Spermatozyten basierend auf L/Z und P-Back-Gates; Runde Spermaatien (RS) und Diploten (D) Spermatozyten basierend auf RS und D-Rückentoren.
  3. Passen Sie während der Ausführung des Beispiels die Durchflussrate auf 3000 Ereignisse/s an, um die effizienteste Sortierung zu erhalten.

6. Reinheitsanalyse sortierter Zellen

  1. Sammeln Sie ≥ 10.000 Zellen/jede Population. Führen Sie eine Zellimmunostainierung durch, um die Unterstufe zu bestätigen.
  2. Zentrifuge bei 300 x g für 5 min bei 4 °C und sorgfältig den Überstand entsorgen, wobei etwa 110 l der Flüssigkeit im Boden des Rohres gehalten werden.
  3. Nehmen Sie einen 10-L-Tropfen der Zellsuspension, um unter dem Mikroskop zu beobachten und die Übersichtszellmorphologie und -zahl zu bewerten.
  4. Tragen Sie auf jeden der Probenkammerschlitten 100 l Zellsuspension auf (siehe Materialtabelle)auf, und laden Sie die Kammern auf den Cytospin.
  5. Drehen Sie die Proben bei 30 x g für 5 min bei Raumtemperatur. Zeichnen Sie einen Kreis um die Zelle mit einem hydrophoben Stift. Trockene Dias auf der Laborbank für ein paar Minuten bei Raumtemperatur.
  6. Legen Sie 50 L PBS in den Kreis der Rutsche und tippen Sie ab.
  7. Primäre Antikörperlösung (Verdünnung der primären Antikörper mit 5% Eselserum in PBS mit 0,02% Polysorbat 20) im Kreis der Rutsche und inkubieren bei 4 °C über Nacht.
    ANMERKUNG: Um die Unterstufe der meiotischen Spermatozyten zu beurteilen, wurde SYCP3, ein Marker für meiotische Chromosomenachsen, und "H2AX", ein Marker für die Reaktion auf DNA-Schäden, nachgewiesen. (Für die Antikörper-Arbeitskonzentration, siehe Tabelle der Materialien).
  8. Tippen Sie auf die primäre Antikörperlösung aus den Dias.
  9. Legen Sie 50 L PBS in den Kreis der Rutsche und tippen Sie ab. Wiederholen Sie dies einmal.
  10. Sekundäre Antikörperlösung (verdünnte sekundäre Antikörper in PBS mit 0,02% Polysorbat 20) im Kreis der Rutsche hinzufügen und bei Raumtemperatur für 1 h im Dunkeln brüten.
  11. Legen Sie 50 L PBS in den Kreis der Rutsche und tippen Sie ab. Wiederholen Sie dies einmal.
  12. Fügen Sie 50 l DAPI (Lagerkonzentration ist 0,1 g/ml) Fleck für 5 min und tippen Sie ab.
  13. Fügen Sie 1-2 Tropfen Montagemedien auf die Dias. Bedecken Sie die Montagemedien vorsichtig mit einem Deckglas und drücken Sie vorsichtig das Deckglas, um zusätzliche Montagemedien und Luftblasen zu entfernen. Die Dias sind für die Mikroskopie-Evaluierung bereit.

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Ergebnisse

Ein repräsentatives Ergebnis dieses Sortierprotokolls ist in Abbildung 3dargestellt. Die Gesamtsortierzeit von zwei Hoden (eine Maus) beträgt in der Regel etwa 3 Stunden, was von der Konzentration der Zellsuspension und der Sortiergeschwindigkeit abhängt. Nach der Sortierung wird die Reinheit der Spermatozyten durch Immunfärbung von SYCP3 und H2AX bestätigt (Abbildung 3A). Die repräsentative Reinheit der sortierten L/Z-, P-, D-Spermatozytenfraktionen betr?...

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Diskussion

Hier stellen wir ein praktisches und einfaches Protokoll vor, um Subpopulationen von Spermatozyten und Spermatoren aus einer einzigen erwachsenen männlichen Maus zu isolieren. Um die Reproduzierbarkeit dieses Protokolls zu gewährleisten, gibt es einige wichtige Schritte, die Aufmerksamkeit erfordern. Vor der Enzymverdauung, Waschschritt zielt darauf ab, interstitielle Zellen zu entfernen; nach der Verdauung hilft dieser Schritt, Spermatozoen und Schmutz zu entfernen. Waschen/Zentrieren ist wichtig. In unserem Dissoziat...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Danksagungen

Wir danken den Mitgliedern der Laboratorien Namekawa, Yoshida und Maezawa für ihre Hilfe; Katie Gerhardt für die Bearbeitung des Manuskripts; Mary Ann Händel für die gemeinsame Nutzung des H1T-Antikörpers, des Cincinnati Children es Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core für die gemeinsame Nutzung der FACS-Ausrüstung, die von NIH S10OD023410 unterstützt wird; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) an T.N.; Lalor Foundation Postdoktorandenstipendium an A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) nach S.Y.; das Forschungsprojekt Grant von der Azabu University Research Services Division, Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology (MEXT)-Supported Program for the Private University Research Branding Project (2016–2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), the Takeda Science Foundation (2019) und dem Uehara Memorial Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) an S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 bis S.H.N.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubeWatson131-7155C
100 mm Petri dishCorning, Falcon351029
15 mL Centrifuge tubeWatson1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh)Corning, Falcon352235
50 mL Centrifuge tubeWatson1342-050S
60 mm Petri dishCorning, Falcon351007
70 µm nylon meshCorning, Falcon352350
Cell sorterSonySH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-freeFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation036-23141
Collagenase, Type 1WorthingtonLS004196
Cover glassFisher12-544-G
Cytospin 3Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)FisherD1306working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase ISigmaD5025-150KU
Donkey serumSigmaS30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11885076
Fetal bovine serum (FBS)Gibco16000044
Histone H1t antibodygift from Mary Ann Handel1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS)Gibco14175095
Hyaluronidase from bovine testesSigmaH3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade MountantFisherP36930
rH2AX antibodyMillipore05-635working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibodyQED Bioscience55101working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope SlidesFisher12-550-15
SYCP3 antibodyAbcamab205846working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20)SigmaP9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)InvitrogenV35003
Water bath

Referenzen

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