Isolamento delle cellule spermatogeniche murine utilizzando un colorante legante del DNA permeabile alle cellule violetto

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule germinali meiotiche e post-meiotiche vive dai teste di topo adulti. Utilizzando un colorante legante il DNA a bassa citotossicità, eccitato dalla violetta e uno smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, si possono isolare popolazioni di cellule spermatogeniche altamente arricchite per molte applicazioni a valle.

Abstract

L'isolamento degli spermatociti meiotici è essenziale per studiare i meccanismi molecolari alla base della meiosi e della spermatogenesi. Sebbene esistano protocolli di isolamento cellulare stabiliti che utilizzano la colorazione Hoechst 33342 in combinazione con lo smistamento delle celle attivato dalla fluorescenza, richiede smistatori di celle dotati di un laser ultravioletto. Qui descriviamo un protocollo di isolamento cellulare usando la macchia DyeCycle Violet (DCV), un colorante legante del DNA a bassa citotossicità strutturalmente simile a Hoechst 33342. Il DCV può essere eccitato sia dai laser ultravioletti che da quelli viola, il che migliora la flessibilità di scelta dell'apparecchiatura, incluso uno smistatore di celle non dotato di un laser ultravioletto. Usando questo protocollo, si possono isolare tre sottopopolazioni a cellule vive in prophase I meiotico, tra cui leptotene/zigotene, pachytene e spermatociti diplotene, così come spermatidi rotondi post-meiotici. Descriviamo anche un protocollo per preparare la sospensione a cella singola dai test del mouse. Nel complesso, la procedura richiede un breve periodo di tempo per il completamento (4-5 ore a seconda del numero di celle necessarie), il che facilita molte applicazioni downstream.

Introduzione

La spermatogenesi è un processo complesso in cui una piccola popolazione di cellule staminali spermatogoniche sostiene la produzione continua di un gran numero di spermatozoi per tutta la^{vita adulta 1,2}. Durante la spermatogenesi, il rimodellamento dinamico della cromatina avviene quando le cellule spermatogeniche subiscono meiosi per produrre spermatidi aploidi^3,4,5. L'isolamento degli spermatociti meiotici è essenziale per l'indagine molecolare e sono stati stabiliti diversi approcci per isolare gli spermatociti mei....

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (protocollo n. IACUC2018-0040) presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center.

1. Installazione di attrezzature e reagenti per la preparazione della sospensione cellulare testicolare

1. Preparare ogni stock enzimatico in 1x Hanks's Balanced Salt Solution (HBSS) e conservare a -20 °C. (Tabella1).
   NOTA: Preparare in qualsiasi momento prima dell'esperimento.
2. Un giorno prima dell'esperimento: tubi di raccolta del mantello (tubi da 1,5 ml) con siero bovino fetale (FBS) a 4 °C durante la notte.

Risultati

Un risultato rappresentativo di questo protocollo di ordinamento è illustrato nella figura 3. Il tempo totale di smistamento di due tester (un mouse) è di solito di circa 3 ore, che dipende dalla concentrazione della sospensione cellulare e dalla velocità di smistamento. Dopo lo smistamento, la purezza degli spermatociti è confermata dall'immunostaining di SYCP3 e γH2AX (Figura 3A). La purezza rappresentativa delle frazioni di spermatociti L/Z, P, D ordinat.......

Discussione

Qui presentiamo un protocollo pratico e semplice per isolare le sottopopolazioni di spermatociti e spermatidi da un singolo topo maschio adulto. Per garantire la riproducibilità di questo protocollo, ci sono alcuni passaggi critici che necessitano di attenzione. Prima della digestione enzimatica, il passaggio di lavaggio mira a rimuovere le cellule interstiziali; dopo la digestione, questo passaggio aiuta a rimuovere spermatozoi e detriti. Lavare / centrifugare 3 volte è importante. Nella nostra ricetta del tampone di .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tube	Watson	131-7155C
100 mm Petri dish	Corning, Falcon	351029
15 mL Centrifuge tube	Watson	1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh)	Corning, Falcon	352235
50 mL Centrifuge tube	Watson	1342-050S
60 mm Petri dish	Corning, Falcon	351007
70 µm nylon mesh	Corning, Falcon	352350
Cell sorter	Sony	SH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-free	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-23141
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196
Cover glass	Fisher	12-544-G
Cytospin 3	Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Fisher	D1306	working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase I	Sigma	D5025-150KU
Donkey serum	Sigma	S30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11885076
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000044
Hostone H1T antibody	gift from Mary Ann Handel		1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175095
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher	P36930
rH2AX antibody	Millipore	05-635	working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody	QED Bioscience	55101	working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15
SYCP3 antibody	Abcam	ab205846	working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20)	Sigma	P9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)	Invitrogen	V35003
Water bath