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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Qui presentiamo un metodo semplice ed efficiente per isolare le cellule germinali meiotiche e post-meiotiche vive dai teste di topo adulti. Utilizzando un colorante legante il DNA a bassa citotossicità, eccitato dalla violetta e uno smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, si possono isolare popolazioni di cellule spermatogeniche altamente arricchite per molte applicazioni a valle.

Abstract

L'isolamento degli spermatociti meiotici è essenziale per studiare i meccanismi molecolari alla base della meiosi e della spermatogenesi. Sebbene esistano protocolli di isolamento cellulare stabiliti che utilizzano la colorazione Hoechst 33342 in combinazione con lo smistamento delle celle attivato dalla fluorescenza, richiede smistatori di celle dotati di un laser ultravioletto. Qui descriviamo un protocollo di isolamento cellulare usando la macchia DyeCycle Violet (DCV), un colorante legante del DNA a bassa citotossicità strutturalmente simile a Hoechst 33342. Il DCV può essere eccitato sia dai laser ultravioletti che da quelli viola, il che migliora la flessibilità di scelta dell'apparecchiatura, incluso uno smistatore di celle non dotato di un laser ultravioletto. Usando questo protocollo, si possono isolare tre sottopopolazioni a cellule vive in prophase I meiotico, tra cui leptotene/zigotene, pachytene e spermatociti diplotene, così come spermatidi rotondi post-meiotici. Descriviamo anche un protocollo per preparare la sospensione a cella singola dai test del mouse. Nel complesso, la procedura richiede un breve periodo di tempo per il completamento (4-5 ore a seconda del numero di celle necessarie), il che facilita molte applicazioni downstream.

Introduzione

La spermatogenesi è un processo complesso in cui una piccola popolazione di cellule staminali spermatogoniche sostiene la produzione continua di un gran numero di spermatozoi per tutta lavita adulta 1,2. Durante la spermatogenesi, il rimodellamento dinamico della cromatina avviene quando le cellule spermatogeniche subiscono meiosi per produrre spermatidi aploidi3,4,5. L'isolamento degli spermatociti meiotici è essenziale per l'indagine molecolare e sono stati stabiliti diversi approcci per isolare gli spermatociti meiotici, tra cui la separazione basata sulla sedimentazione6,7 e lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Tuttavia, questi metodi hanno limitazioni tecniche. Mentre la separazione basata sulla sedimentazione produce un gran numero dicellule 5,6,7, è ad alta intensità di lavoro. Il metodo stabilito basato su FACS utilizza Hoechst 33342 (Ho342) per separare gli spermatociti meiotici in base al contenuto di DNA e alle proprietà di scattering della luce e richiede smistatori cellulari FACS dotati di un laser ultravioletto (UV)8,9,10,11. Metodi alternativi basati su FACS richiedono linee di topo transgeniche che esprimono proteine florescenti, sincronizzazione della spermatogenesi12o fissazione cellulare ed etichettatura degli anticorpi che non è compatibile con l'isolamento delle cellulevive 13. Mentre esiste un altro metodo alternativo che utilizza un colorante legante al DNA permeabile alle cellule, colorante DyeCycle Green14,15,16,17, questo metodo è raccomandato per l'isolamento delle cellule spermatogeniche dal testicolo giovanile. Pertanto, è fondamentale sviluppare un metodo di isolamento semplice e robusto per gli spermatociti meiotici vivi che possono essere applicati a qualsiasi ceppo di topo di qualsiasi età e che possono essere eseguiti utilizzando qualsiasi smistatore di celle FACS.

Qui descriviamo un protocollo di isolamento cellulare così ricercato da tempo usando la macchia DyeCycle Violet (DCV). Il DCV è un colorante legante il DNA a bassa citotossicità e permeabile alle cellule strutturalmente simile all'Ho342, ma con uno spettro di eccitazione spostato verso l'intervallo viola18. Inoltre, il DCV ha uno spettro di emissione più ampio rispetto al DCG. Pertanto, può essere eccitato sia dai laser UV che viola, che migliorano la flessibilità delle apparecchiature, consentendo l'uso di uno smistatore di celle FACS non dotato di un laser UV. Il protocollo DCV qui presentato utilizza la separazione bidimensionale con blu DCV e rosso DCV, imitando il vantaggio del protocollo Ho342. Con questo vantaggio, il nostro protocollo DCV ci consente di isolare le cellule germinali altamente arricchite dal testicolo adulto. Forniamo un protocollo di gating dettagliato per isolare le cellule spermatogeniche vive dai tester di topo adulti di un topo (da due teste). Descriviamo anche un protocollo efficiente e rapido per preparare sospensioni a cella singola dai test del mouse che possono essere utilizzati per questo isolamento cellulare. La procedura richiede un breve tempo per essere completata (preparazione della sospensione a cella singola - 1 ora, colorazione del colorante - 30 minuti e smistamento delle cellule - 2-3 ore: totale - 4-5 ore a seconda del numero di celle necessarie; Figura 1). A seguito dell'isolamento cellulare, è possibile completare un'ampia gamma di applicazioni downstream tra cui RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq e coltura cellulare.

Protocollo

Questo protocollo segue le linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (protocollo n. IACUC2018-0040) presso il Cincinnati Children's Hospital Medical Center.

1. Installazione di attrezzature e reagenti per la preparazione della sospensione cellulare testicolare

  1. Preparare ogni stock enzimatico in 1x Hanks's Balanced Salt Solution (HBSS) e conservare a -20 °C. (Tabella1).
    NOTA: Preparare in qualsiasi momento prima dell'esperimento.
  2. Un giorno prima dell'esperimento: tubi di raccolta del mantello (tubi da 1,5 ml) con siero bovino fetale (FBS) a 4 °C durante la notte.
  3. Il giorno dell'esperimento: impostare il bagno d'acqua a 37 °C.
  4. Pre-caldo Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) a 37 °C e preparare 2 ml di tampone di dissociazione 1x per ogni campione subito primadell'uso (tabella 1)in tubo di centrifuga da 15 ml.
    NOTA: Il tampone di dissociazione da 2 mL è preparato per due teste. Per la ricetta del tampone di dissociazione, fare riferimento alla tabella 1.

2. Dissezione animale e preparazione della sospensione cellulare testicolare

  1. Sacrifica un topo maschio di 8 settimane lasciandolo in una camera di anidride carbonica per almeno 10 minuti.
  2. Rimuovere entrambi i tester e posizionarlo su una piastra di Petri da 60 mm contenente 2 mL di salina tamponata con fosfato ghiacciato (PBS).
  3. Rimuovere la tunica albuginea dai teste. Disperdere leggermente i tubuli seminiferi separando delicatamente con le forcep.
  4. Trasferire i tubuli seminiferi in una piastra di Petri da 100 mm con una nuova goccia di PBS ghiacciato e districare delicatamente i tubuli seminiferi con le forcep. Ripetere questo lavaggio 3 volte per rimuovere il più possibile le cellule interstiziali.
  5. Incubare tubuli seminiferi non angolati in un tubo da 15 ml contenente 2 ml di tampone di dissociazione a 37 °C per 20 min.
  6. Pipettare delicatamente i tubuli 20 volte utilizzando una micropipetta da 1000 μL.
  7. Incubare per 6 min. Ripetere la pipettazione delicata 20 volte.
  8. Incubare per 3 minuti. Ripetere la pipettazione delicata 10 volte fino a quando non rimangono blocchi visibili.
  9. Aggiungere 10 mL di buffer FACS alla sospensione. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il supernatante.
  10. Ripetere il passaggio 2.9 due volte per rimuovere gli spermatozoi e il più possibile i detriti.

3. Colorazione cellulare

  1. Resuspend il pellet di cella con 3 ml di tampone FACS(tabella 1) e filtrare la sospensione cellulare attraverso un filtro a celle di nylon da 70 μm in un tubo da 50 ml.
    NOTA: La resa cellulare prevista è di circa 100 milioni di cellule per due testicoli (da un topo di tipo selvaggio B6 di 8 settimane).
  2. Contare il numero di cellule e dividere il 10% delle cellule in un nuovo tubo come controllo negativo non macchiato e lasciare sul ghiaccio.
  3. Aggiungere 6 μL di macchia DCV (la concentrazione originale è di 5 mM) alla sospensione cellulare rimanente e mescolare bene. La concentrazione finale è di 10 μM, e la capacità è di circa 100 milioni di cellule.
  4. Incubare a 37 °C per 30 minuti al buio. Agitare delicatamente la sospensione cellulare ogni 10 minuti.
  5. Dopo l'incubazione, senza un passaggio di lavaggio, aggiungere direttamente 5 μL di DNasi I (la concentrazione del materiale è di 10 mg/mL) alla sospensione cellulare e filtrare le cellule in un tubo FACS da 5 ml attraverso il cappuccio in rete di nylon da 35 μm. Tenere i campioni sul ghiaccio fino allo smistamento.

4. Citometria a flusso e cancelli sperimentali

  1. Preparare lo smistatore di celle FACS. Assicurarsi che lo smistatore di celle FACS sia dotato di ottica di eccitazione: laser Viola (405 nm); Ottica di rilevamento: combinazione di filtri di 450/50 pass banda [stesso set di filtri di 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) per il rilevamento DCV-blu] e 665/30 pass banda [stesso set di filtri di Allophycocyanin (APC) per il rilevamento dcv-rosso]. Qui usiamo lo smistatore di celle SONY SH800S come esempio.
  2. Create un nuovo esperimento e impostate i seguenti grafici di lavoro che visualizzano i parametri da ottimizzare: fate clic su "Nuova densità" sulla barra dei menu "Strumentifoglio di lavoro " per creare un plottaggio di densità di dispersione in avanti - area (FSC-A) vs back scatter - area (BSC-A) su scala lineare. Fate clic su "Nuovo istogramma" per creare un istogramma blu DCV su scala logaritmica.
  3. Vortice brevemente il controllo negativo non macchiato (dal passaggio 3.2) e caricare il campione.
  4. Fate clic su "Start" e "Record" per iniziare a elaborare l'esempio non macchiato. Mentre il campione è in esecuzione, fate clic su " Impostazioni rivelatore e soglia " per ottimizzare le tensioni FSC e BSC regolando entrambe le tensioni del tubo fotomoltiplicatore (PMT) versol'altoo verso il basso per posizionare le celle non macchiate sulla scala del grafico FSC/BSC.
  5. Regolare la tensione PMT su e giù su "FL1: DAPI" mentre il campione è in esecuzione per localizzare la posizione della popolazione DCV-negativa nel primo decennio del grafico logaritmico dell'istogramma blu DCV (Figura 2A). Dopo aver completato la regolazione della tensione PMT, fateclic su" Interrompi " per scaricare il campione non contaminato.
  6. Vortice brevemente del campione (dal passaggio 3.5) e caricare il campione.
  7. Fate clic su "Next Tube" per creare un nuovo foglio di lavoro per l'esempio macchiato di DCV; e fare clic su "Start" e "Record" per acquisire il campione macchiato di DCV, registrare ≥ 1 x 106 eventi. Aggiungete i seguenti grafici di lavoro: fate clic su "Nuova densità" sulla barra dei menu "Strumentifoglio di lavoro " per creare un plottaggio di densità FSC-H (altezza) vs FSC-W (larghezza) su scala lineare; Fate clic su "Nuovadensità " per creare un plottaggio densità DCV-blu vs DCV-rosso su scala lineare. Dopo aver ≥ 1 x 106 eventi, fate clic su "Interrompi" e scaricate l'esempio.
  8. Nel grafico di densità FSC-A vs BSC-A, fate clic su "Poligono" sulla barra dei menu "Plot Tools" per disegnare un grande cancello "Cells" per includere la maggior parte delle celle ed escludere piccoli detriti(Figura 2B). Applicate il gate "Cells" al plot di densità FSC-H vs FSC-W. Fare clic su "Rettangolo" perdisegnare ungate " Singole celle " per escludere celle non singole (Figura 2C).
  9. Applicate il gate "Single Cells" al plottaggio di densità DCV-blu vs DCV-rosso e regolate la scala per catturare un profilo esteso come mostrato nella Figura 2D. Fate clic su "Poligono" sulla barra dei menu "Plot Tools" per disegnare un gate "DCV" per escludere le celle non macchiate e la popolazione laterale (Figura 2D).
  10. Applicate il gate "DCV" al grafico dell'istogramma blu DCV su scala lineare. I tre picchi principali si riferiscono a diversi contenuti di DNA: 1C, 2C e 4C (Figura 2E).
  11. Fate clic su "Nuovadensità " per creare un plottaggio densità DCV-blu vs DCV-rosso su scala lineare e applicate il gate "DCV" per eseguire il back gating dalla Figura 2E per individuare le popolazioni 1C e 4C (Figura 2F). Fate clic su "Ellisse" per disegnare un cancello sulla popolazione 1C, che si trova all'interno di un'area condensata (gate 1C). Fare clic su "Poligono" per disegnare una porta sulla popolazione 4C che è una curva continua (gate 4C).
  12. Fate clic su "Nuovadensità " per creare un plottaggio di densità DCV-blu vs DCV-rosso su scala lineare e applicate il gate "4C"; regolare la scala per ingrandire e fare clic su "Poligono" per disegnare un gate "4C_1" per una selezione più precisa (Figura 2G).
  13. Fate clic su "Nuovadensità " per creare un nuovo plottaggio densità FSC-A vs BSC-A su scala lineare e applicate il gate "4C_1"; ci saranno tre popolazioni arricchite separate per dimensioni corrispondenti agli spermatociti leptotene (L) /zigotene (Z), pachytene (P) e diplotene (D). Fare clic su "Poligono" o" Ellisse" per disegnare 3 porte: "L/Z", "P" e "D" in base alle dimensioni crescenti (Figura 2H).
  14. Fate clic su "Nuovo graficoa punti " per creare un grafico a punti di colore DCV-blu vs DCV-rosso su scala lineare per applicare gate e assicurarsi che le tre popolazioni siano in ordine continuo all'interno del gate "4C_1" (Figura 2I).
  15. Allo stesso modo, per la popolazione 1C, fare clic su "Nuova Densità" per creare un nuovo grafico di densità FSC-A vs BSC-A su scala lineare e applicare il gate "1C", selezionare la dimensione unificata delle cellule come pura popolazione spermatida rotonda, e fare clic su "Ellisse" per disegnare un cancello "RS" (Figura 2J).

5. Ordinare le sottopopolazioni di cellule germinali maschili

  1. Preparare tubi da 1,5 ml contenenti 500 μL 50% FBS per la raccolta delle celle e caricare il tubo di raccolta nel collettore e fare clic su "Load Collection".
  2. Fare clicsu " Next Tube", "Start", "Record" e "Sort Start". Per l'utilizzo di un sistema a doppio senso che consente di ordinare due popolazioni di interesse contemporaneamente nel dispositivo di raccolta, seguire combinazioni a coppie: leptotene (L) /zigotene (Z) e spermatociti pachytene (P) basati su back-gate L/Z e P; Spermatidi rotondi (RS) e spermatociti diplotene (D) a base di porte posteriori RS e D.
  3. Durante l'esecuzione dell'esempio, regolare la portata a ~3000 eventi/s per ottenere l'ordinamento più efficiente.

6. Analisi della purezza delle cellule ordinate

  1. Raccogli ≥ 10.000 cellule/ogni popolazione. Eseguire l'immunoso immunosocienza cellulare per confermare il sottostaggio.
  2. Centrifugare a 300 x g per 5 min a 4 °C e scartare con cura il supernatante, mantenendo circa 110 μL del liquido nella parte inferiore del tubo.
  3. Prendere una goccia di 10 μL di sospensione cellulare per osservare al microscopio e valutare la morfologia e il numero delle cellule panoramiche.
  4. Applicare 100 μL di sospensione cellulare su ciascuna delle diapositive della camera campione (vedere Tabella dei materiali) e caricare le camere sul Citospino.
  5. Ruotare i campioni a 30 x g per 5 minuti a temperatura ambiente. Disegna un cerchio intorno alla cellula con una penna idrofobica. Scivoli asciutti sul banco di laboratorio per alcuni minuti a temperatura ambiente.
  6. Rilasciare 50 μL di PBS nel cerchio della diapositiva e toccare.
  7. Aggiungere la soluzione di anticorpi primari (diluire gli anticorpi primari con il 5% di siero d'asino in PBS con 0,02% di polisorbato 20) nel cerchio dello scivolo e incubare a 4 °C durante la notte.
    NOTA: Per giudicare il sottostagio degli spermatociti meiotici, è stato rilevato SYCP3, che è un marcatore degli assi cromosomici meiotici, e γH2AX, che è un marcatore della risposta al danno del DNA. (Per la concentrazione di lavoro degli anticorpi, fare riferimento alla tabella dei materiali).
  8. Toccare la soluzione anticorpale primaria dalle diapositive.
  9. Rilasciare 50 μL di PBS nel cerchio della diapositiva e toccare. Ripeti una volta.
  10. Aggiungere la soluzione anticorpale secondaria (diluire gli anticorpi secondari in PBS con 0,02% di polisorbato 20) nel cerchio dello scivolo e incubare a temperatura ambiente per 1 h al buio.
  11. Rilasciare 50 μL di PBS nel cerchio della diapositiva e toccare. Ripeti una volta.
  12. Aggiungere 50 μL di DAPI (la concentrazione del materiale è di 0,1 μg/mL) per 5 minuti e toccare.
  13. Aggiungere 1-2 gocce di supporti di montaggio sulle diapositive. Coprire con cura i supporti di montaggio con un vetro di copertura e premere delicatamente il vetro di copertura per rimuovere i supporti di montaggio aggiuntivi e la bolla d'aria. Le diapositive sono pronte per la valutazione della microscopia.

Risultati

Un risultato rappresentativo di questo protocollo di ordinamento è illustrato nella figura 3. Il tempo totale di smistamento di due tester (un mouse) è di solito di circa 3 ore, che dipende dalla concentrazione della sospensione cellulare e dalla velocità di smistamento. Dopo lo smistamento, la purezza degli spermatociti è confermata dall'immunostaining di SYCP3 e γH2AX (Figura 3A). La purezza rappresentativa delle frazioni di spermatociti L/Z, P, D ordinat...

Discussione

Qui presentiamo un protocollo pratico e semplice per isolare le sottopopolazioni di spermatociti e spermatidi da un singolo topo maschio adulto. Per garantire la riproducibilità di questo protocollo, ci sono alcuni passaggi critici che necessitano di attenzione. Prima della digestione enzimatica, il passaggio di lavaggio mira a rimuovere le cellule interstiziali; dopo la digestione, questo passaggio aiuta a rimuovere spermatozoi e detriti. Lavare / centrifugare 3 volte è importante. Nella nostra ricetta del tampone di ...

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Ringraziamo i membri dei laboratori Namekawa, Yoshida e Maezawa per il loro aiuto; Katie Gerhardt per aver modificato il manoscritto; Mary Ann Handel per aver condiviso l'anticorpo H1T, il Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) Research Flow Cytometry Core per la condivisione delle apparecchiature FACS supportate da NIH S10OD023410; Grant-in-Aid for Scientific Research (KAKENHI; 17K07424) a T.N.; Lalor Foundation Postdoctoral Fellowship ad A.S.; da AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) a S.Y.; il Research Project Grant della Divisione Servizi di Ricerca dell'Università di Azabu, Programma sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia (MEXT) per il Private University Research Branding Project (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019) e Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) a S.M.; National Institute of Health R01 GM122776 to S.H.N.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubeWatson131-7155C
100 mm Petri dishCorning, Falcon351029
15 mL Centrifuge tubeWatson1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh)Corning, Falcon352235
50 mL Centrifuge tubeWatson1342-050S
60 mm Petri dishCorning, Falcon351007
70 µm nylon meshCorning, Falcon352350
Cell sorterSonySH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-freeFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation036-23141
Collagenase, Type 1WorthingtonLS004196
Cover glassFisher12-544-G
Cytospin 3Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)FisherD1306working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase ISigmaD5025-150KU
Donkey serumSigmaS30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11885076
Fetal bovine serum (FBS)Gibco16000044
Histone H1t antibodygift from Mary Ann Handel1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS)Gibco14175095
Hyaluronidase from bovine testesSigmaH3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade MountantFisherP36930
rH2AX antibodyMillipore05-635working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibodyQED Bioscience55101working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope SlidesFisher12-550-15
SYCP3 antibodyAbcamab205846working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20)SigmaP9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)InvitrogenV35003
Water bath

Riferimenti

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