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Resumen

Aquí presentamos un método simple y eficiente para aislar células germinales meíticas y post-meyóticas vivas de los testículos de ratón adultos. Usando un tinte de unión de ADN excitado por violeta y clasificación celular activada por fluorescencia, se pueden aislar poblaciones de células espermatogénicas altamente enriquecidas para muchas aplicaciones posteriores.

Resumen

El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para investigar los mecanismos moleculares subyacentes a la meiosis y la espermatogénesis. Aunque existen protocolos de aislamiento celular establecidos que utilizan la tinción Hoechst 33342 en combinación con la clasificación celular activada por fluorescencia, requiere clasificadores celulares equipados con un láser ultravioleta. Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV), un tinte de unión de ADN de baja citotoxicidad estructuralmente similar a Hoechst 33342. DcV puede ser excitado por láseres ultravioleta y violeta, lo que mejora la flexibilidad de la elección del equipo, incluyendo un clasificador de células no equipado con un láser ultravioleta. Usando este protocolo, uno puede aislar tres subpoblaciones de células vivas en la profase meótica I, incluyendo leptoteno/zygotene, paquiteno y espermatozoides diploteno, así como espermatozoides redondos post-meyóticos. También describimos un protocolo para preparar la suspensión de una sola célula a partir de testículos de ratón. En general, el procedimiento requiere un corto tiempo para completarse (4-5 horas dependiendo del número de celdas necesarias), lo que facilita muchas aplicaciones posteriores.

Introducción

La espermatogénesis es un proceso complejo en el que una pequeña población de células madre espermatogoniales sostiene la producción continua de un gran número de espermatozoides a lo largo de la vida adulta1,2. Durante la espermatogénesis, la remodelación dinámica de la cromatina tiene lugar cuando las células espermatogénicas se someten a meiosis para producir espermatozoides haploideos3,4,5. El aislamiento de espermatocitos meyóticos es esencial para la investigación molecular, y se han establecido varios enfoques diferentes para aislar los espermatocitos meyóticos, incluyendo la separación basada en sedimentación6,7 y la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS)8,9,10,11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, estos métodos tienen limitaciones técnicas. Mientras que la separación basada en sedimentación produce un gran número de células5,6,7,es intensiva en mano de obra. El método establecido basado en FACS utiliza Hoechst 33342 (Ho342) para separar los espermatocitos meyóticos basados en el contenido de ADN y las propiedades de dispersión de luz y requiere clasificadores celulares FACS equipados con un láser ultravioleta (UV)8,9,10,11. Los métodos alternativos basados en FACS requieren líneas de ratón transgénicas que expresen proteínas florescentes, sincronización de espermatogénesis12o fijación celular y etiquetado de anticuerpos que no sea compatible con el aislamiento de células vivas13. Si bien hay otro método alternativo utilizando un tinte de unión de ADN permeable a las células, DyeCycle Green stain14,15,16,17, este método se recomienda para el aislamiento de células espermatogénicas de testículos juveniles. Por lo tanto, existe una necesidad crítica de desarrollar un método de aislamiento simple y robusto para los esperatocitos meyóticos vivos que se pueden aplicar a cualquier cepa de ratón de cualquier edad y que se puede realizar utilizando cualquier clasificador celular FACS.

Aquí describimos un protocolo de aislamiento celular tan buscado desde hace mucho tiempo utilizando la mancha DyeCycle Violet (DCV). El DCV es un tinte de unión de ADN permeable a la célula de baja citotoxicidad estructuralmente similar al Ho342, pero con un espectro de excitación desplazado hacia el rango violeta18. Además, DCV tiene un espectro de emisiones más amplio en comparación con DCG. Por lo tanto, puede ser excitado por láseres UV y violeta, lo que mejora la flexibilidad del equipo, permitiendo el uso de un clasificador de células FACS no equipado con un láser UV. El protocolo DCV presentado aquí utiliza la separación bidimensional con azul DCV y rojo DCV, imitando la ventaja del protocolo Ho342. Con esta ventaja, nuestro protocolo DCV nos permite aislar células germinales altamente enriquecidas de los testículos adultos. Proporcionamos un protocolo detallado para aislar las células espermatogénicas vivas de los testículos adultos de ratón de un ratón (de dos testículos). También describimos un protocolo eficiente y rápido para preparar la suspensión de una sola célula a partir de pruebas de ratón que se pueden utilizar para este aislamiento de celda. El procedimiento requiere un corto tiempo para completar (preparación de la suspensión de una sola célula - 1 hora, tinción de tinte - 30 min, y clasificación celular - 2-3 horas: total - 4-5 horas dependiendo del número de células necesarias; Figura 1). Después del aislamiento celular, se puede completar una amplia gama de aplicaciones posteriores, incluyendo RNA-seq, ATAC-seq, ChIP-seq y cultivo celular.

Protocolo

Este protocolo sigue las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (protocolo no. IACUC2018-0040) en Cincinnati Children's Hospital Medical Center.

1. Configuración de equipos y reactivos para la preparación de la suspensión de células testiculares

  1. Preparar cada stock enzimático en 1x Solución de Sal Equilibrada (HBSS) de Hanks y almacenar a -20 oC.(Tabla1).
    NOTA: Prepárese en cualquier momento antes del experimento.
  2. Un día antes del experimento: Recubrir tubos recolectan (1,5 ml de tubos) con suero bovino fetal (FBS) a 4oC durante la noche.
  3. El día del experimento: Ajuste el baño de agua a 37 oC.
  4. Precalentar el medio de águila modificada (DMEM) de Dulbecco a 37 oC y preparar 2 ml de tampón de disociación 1x para cada muestra antes de su uso (Tabla 1) en tubo centrífugo de 15 ml.
    NOTA: El búfer de disociación de 2 ml está preparado para dos testículos. Para la receta del tampón de disociación, consulte la Tabla 1.

2. Disección animal y preparación de la suspensión de células testiculares

  1. Sacrificar un ratón macho de 8 semanas de edad dejando en una cámara de dióxido de carbono durante al menos 10 minutos.
  2. Retire ambos testículos y colóquelos en una placa Petri de 60 mm que contenga 2 ml de solución salina con fosfato helado (PBS).
  3. Retire la tunica albuginea de los testículos. Dispersa ligeramente los túbulos seminiferos separando suavemente con fórceps.
  4. Transfiera los túbulos seminíferos a un plato de Petri de 100 mm con una nueva gota de PBS helado y desenredar los túbulos seminíferos suavemente con fórceps. Repita este lavado 3 veces para eliminar las células intersticiales tanto como sea posible.
  5. Incubar túbulos seminiferos desenredados en un tubo de 15 ml que contenga 2 ml de tampón de disociación a 37oC durante 20 min.
  6. Pipetee suavemente los túbulos 20 veces con una micropipeta de 1000 l.
  7. Incubar durante 6 min. Repita el pipeteo suave 20 veces.
  8. Incubar durante 3 min. Repita el pipeteo suave 10 veces hasta que no queden trozos visibles.
  9. Añadir 10 mL de tampón FACS a la suspensión. Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
  10. Repita el paso 2.9 dos veces para extraer los espermatozoides y tantos desechos como sea posible.

3. Mancha de células

  1. Resuspender el pellet celular con 3 ml de tampón FACS (Tabla 1) y filtrar la suspensión celular a través de un colador de células de nylon de 70 m en un tubo de 50 ml.
    NOTA: El rendimiento celular esperado es de aproximadamente 100 millones de células por dos testículos (de un ratón de tipo salvaje B6 de 8 semanas de edad).
  2. Cuente el número de celda y divida el 10% de las células en un nuevo tubo como el control negativo no manchado y salga en hielo.
  3. Añadir 6 l de mancha de DCV (la concentración original es de 5 mM) a la suspensión celular restante y mezclar bien. La concentración final es de 10 m, y la capacidad es de aproximadamente 100 millones de células.
  4. Incubar a 37oC durante 30 minutos en la oscuridad. Agitar suavemente la suspensión celular cada 10 min.
  5. Después de la incubación, sin un paso de lavado, añadir directamente 5 sl de DNase I (la concentración de stock es de 10 mg/ml) a la suspensión celular y filtrar las células en un tubo FACS de 5 ml a través de la tapa de malla de nylon de 35 m. Mantenga las muestras sobre hielo hasta su clasificación.

4. Citometría de flujo y puertas experimentales

  1. Prepare el clasificador de células FACS. Asegúrese de que el clasificador de células FACS esté equipado con óptica de excitación: láser violeta (405 nm); Óptica de detección: combinación de filtros de paso de banda 450/50 [mismo conjunto de filtros de 4o,6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para la detección DCV-azul] y paso de banda 665/30 [mismo conjunto de filtros de aloficocian (APC) para la detección DE DCV-rojo]. Aquí utilizamos el clasificador de celdas SH800S de Sony como ejemplo.
  2. Cree un nuevo experimento y configure las siguientes gráficas de trabajo que muestren los parámetros que se van a optimizar: Haga clic en "Nueva densidad" en la barra de menús " Herramientas de hojade trabajo"para crear un trazado de densidad de dispersión hacia delante - área (FSC-A) frente a dispersión posterior - área (BSC-A) en una escala lineal. Haga clic en "Nuevo histograma" para crear una gráfica de histograma dcV-azul en escala logarítmica.
  3. Vórtice brevemente el control negativo no manchado (del paso 3.2) y cargue la muestra.
  4. Haga clic en "Iniciar" y "Grabar" para comenzar a procesar la muestra no manchada. Mientras la muestra se está ejecutando, haga clic en"Configuración de detector y umbral"para optimizar los voltajes FSC y BSC ajustando los voltajes del tubo fotomultiplicador (PMT) hacia arriba o hacia abajo para colocar las celdas no manchadas en la escala de la gráfica FSC/BSC.
  5. Ajuste la tensión PMT hacia arriba y hacia abajo en "FL1: DAPI" mientras la muestra se está ejecutando para localizar la posición de la población negativa DCV en la primera década de la gráfica logarítmica del histograma DCV-azul (Figura 2A). Después de completar el ajuste de voltaje PMT, haga clic en "Detener" para descargar la muestra no mantenida.
  6. Vórtice brevemente la muestra (del paso 3.5) y cargue la muestra.
  7. Haga clic en "Siguiente tubo" para crear una nueva hoja de trabajo para la muestra manchada de DCV; y haga clic en"Iniciar"y"Grabar"para adquirir la muestra manchada de DCV, registre ≥ 1 x 106 eventos. Agregue las siguientes gráficas de trabajo: Haga clic en "Nueva densidad" en la barra de menús " Herramientas de hoja detrabajo" para crear un trazado de densidad FSC-H (altura) frente a FSC-W (ancho) en una escala lineal; Haga clic en "Nueva densidad"para crear una gráfica de densidad DCV-azul frente a DCV-rojo en una escala lineal. Después de grabar ≥ 1 x 106 eventos, haga clic en"Detener"y descargue la muestra.
  8. En la gráfica de densidad FSC-A frente a BSC-A, haga clic en "Polígono" en la barra de menús "Herramientas de trazado" para dibujar una puerta grande "Celdas" para incluir la mayoría de las celdas y excluir pequeños desechos (Figura 2B). Aplique la puerta"Células"a la gráfica de densidad FSC-H frente a FSC-W. Haga clic en "Rectángulo" para dibujar una puerta "Celdas individuales" para excluir celdas no individuales(Figura 2C).
  9. Aplique la puerta "Single Cells" a dcV-blue vs. DCV-rojo trama de densidad y ajuste la escala para capturar un perfil extendido como se muestra en la Figura 2D. Haga clic en "Polígono" en la barra de menús "Herramientas de trazado" para dibujar una puerta "DCV" para excluir las celdas no manchadas y la población lateral (Figura 2D).
  10. Aplique la puerta "DCV" a la gráfica del histograma dcV-azul en una escala lineal. Los tres picos principales se refieren a diferentes contenidos de ADN: 1C, 2C y 4C(Figura 2E).
  11. Haga clic en "Nueva densidad" para crear una gráfica de densidad DCV-azul frente a DCV-rojo en una escala lineal y aplique la puerta "DCV" para realizar el desplazamiento desde la Figura 2E para localizar las poblaciones 1C y 4C (Figura 2F). Haga clic en "Elipse" para dibujar una puerta en la población 1C, que se encuentra dentro de un área condensada (puerta 1C). Haga clic en"Polígono"para dibujar una puerta en la población 4C que es una curva continua (puerta 4C).
  12. Haga clic en"Nueva densidad"para crear una gráfica de densidad DCV-azul frente a DCV-rojo en una escala lineal y aplicar la puerta "4C"; ajuste la escala para acercar y haga clic en"Polígono"para dibujar una puerta "4C_1" para una selección más precisa (Figura 2G).
  13. Haga clic en"Nueva densidad"para crear una nueva gráfica de densidad FSC-A frente a BSC-A en una escala lineal y aplicar la puerta "4C_1"; habrá tres poblaciones enriquecidas separadas por tamaño correspondientes a leptoteno (L) /zygoteno (Z), paquiteno (P) y diploteno (D) espermatozoides. Haga clic en "Polígono" o "Elipse" para dibujar 3 puertas: "L/Z", "P" y "D" en función del tamaño creciente (Figura 2H).
  14. Haga clic en"Nueva gráfica de puntos"para crear una gráfica de puntos dcV-azul frente a DCV-rojo en una escala lineal para aplicar la puerta y asegurarse de que las tres poblaciones están en un orden continuo dentro de la puerta "4C_1"(Figura 2I).
  15. Del mismo modo, para la población 1C, haga clic en"Nueva densidad"para crear una nueva gráfica de densidad FSC-A frente a BSC-A en una escala lineal y aplique la puerta "1C", seleccione el tamaño unificado de las células como población de espermatozoides redonda pura, y haga clic en "Elipse"para dibujar una puerta"RS"(Figura 2J).

5. Ordenar subpoblaciones de células germinales masculinas

  1. Preparar tubos de 1,5 ml que contengan 500 l 50% FBS para la recolección celular y cargar el tubo de recogida en el colector y haga clic en "Cargar colección".
  2. Haga clic en "Siguiente tubo", "Iniciar", "Grabar" y "Ordenar inicio". Para utilizar un sistema bidireccional que permita clasificar dos poblaciones de interés al mismo tiempo en el dispositivo de recolección, siga combinaciones por pares: leptoteno (L) /zygotene (Z) y esperatocitos de paquiteno (P) basados en puertas traseras L/Z y P; Espermatodes redondos (RS) y espermatozoides diploteno (D) basados en puertas traseras RS y D.
  3. Mientras se ejecuta el ejemplo, ajuste el caudal a 3000 eventos/s para obtener la clasificación más eficiente.

6. Análisis de pureza de células ordenadas

  1. Recoger ≥ 10.000 células/cada población. Realice inmunosuchación celular para confirmar el substage.
  2. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 oC y deseche cuidadosamente el sobrenadante, manteniendo alrededor de 110 l del líquido en la parte inferior del tubo.
  3. Tome una gota de 10 l de suspensión celular para observar bajo el microscopio y evaluar la morfología celular de visión general y el número.
  4. Aplique 100 l de suspensión celular a cada uno de los portaobjetos de la cámara de muestra (ver Tabla de materiales)y cargue las cámaras en el Cytospin.
  5. Girar las muestras a 30 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Dibuja un círculo alrededor de la célula con una pluma hidrófoba. Seque los toboganes en el banco del laboratorio durante unos minutos a temperatura ambiente.
  6. Suelte 50 l de PBS en el círculo de la diapositiva y puntee.
  7. Añadir solución de anticuerpos primarios (Diluir anticuerpos primarios con 5% de suero de burro en PBS con 0,02% de polisorbato 20) en el círculo de la diapositiva e incubar a 4 oC durante la noche.
    NOTA: Para juzgar la subsestación de los espermatocitos meóticos, se detectó SYCP3, que es un marcador de ejes cromosómicas meyóticos, y el S2AX, que es un marcador de la respuesta al daño del ADN. (Para conocer la concentración de trabajo de anticuerpos, consulte la Tabla de materiales).
  8. Toque la solución de anticuerpos primarios de las diapositivas.
  9. Suelte 50 l de PBS en el círculo de la diapositiva y puntee. Repite una vez.
  10. Añadir solución secundaria de anticuerpos (diluir anticuerpos secundarios en PBS con 0,02% de polisorbato 20) en el círculo del portaobjetos e incubar a temperatura ambiente durante 1 h en la oscuridad.
  11. Suelte 50 l de PBS en el círculo de la diapositiva y puntee. Repite una vez.
  12. Añadir 50 l de DAPI (la concentración de la población es de 0,1 g/ml) mancha durante 5 min y cortar.
  13. Agregue 1-2 gotas de soporte de montaje en las diapositivas. Cubra cuidadosamente el medio de montaje con un cristal de cubierta y presione suavemente el cristal de la cubierta para eliminar los medios de montaje adicionales y la burbuja de aire. Las diapositivas están listas para la evaluación de la microscopía.

Resultados

Un resultado representativo de este protocolo de clasificación se muestra en la Figura 3. El tiempo total de clasificación de dos testículos (un ratón) suele ser de alrededor de 3 horas, lo que depende de la concentración de la suspensión celular y de la velocidad de clasificación. Después de la clasificación, la pureza de los espermatocitos se confirma mediante la inmunostaining de SYCP3 y de laFigura 3A ( Figura 3A). La pureza representativa de las fr...

Discusión

Aquí presentamos un protocolo práctico y simple para aislar las subpoblaciones de espermatozoides y espermatozoides de un solo ratón macho adulto. Para garantizar la reproducibilidad de este protocolo, hay algunos pasos críticos que necesitan atención. Antes de la digestión enzimática, el paso de lavado tiene como objetivo eliminar las células intersticiales; después de la digestión, este paso ayuda a eliminar los espermatozoides y los desechos. Lavar/centrifugar 3 veces es importante. En nuestra receta de tamp...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros de los laboratorios Namekawa, Yoshida y Maezawa por su ayuda; Katie Gerhardt por editar el manuscrito; Mary Ann Handel por compartir el anticuerpo H1T, el Núcleo de Citometría de Flujo de Investigación del Cincinnati Children's Hospital Medical Center (CCHMC) para compartir el equipo FACS apoyado por NIH S10OD023410; Subvención en Ayuda para la Investigación Científica (KAKENHI; 17K07424) a T.N.; Beca Postdoctoral de la Fundación Lalor a A.S.; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) a S.Y.; la Beca de Proyectos de Investigación de la División de Servicios de Investigación de la Universidad de Azabu, Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología (MEXT)-Programa apoyado para el Proyecto de Marca de Investigación de Universidades Privadas (2016-2019), Grant-in-Aid for Research Activity Start-up (19K21196), Takeda Science Foundation (2019), y la Uehara Memorial Foundation Research Incentive Grant (2018) a S.M;; Instituto Nacional de Salud R01 GM122776 a S.H.N.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubeWatson131-7155C
100 mm Petri dishCorning, Falcon351029
15 mL Centrifuge tubeWatson1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh)Corning, Falcon352235
50 mL Centrifuge tubeWatson1342-050S
60 mm Petri dishCorning, Falcon351007
70 µm nylon meshCorning, Falcon352350
Cell sorterSonySH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-freeFUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation036-23141
Collagenase, Type 1WorthingtonLS004196
Cover glassFisher12-544-G
Cytospin 3Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)FisherD1306working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase ISigmaD5025-150KU
Donkey serumSigmaS30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)Gibco14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11885076
Fetal bovine serum (FBS)Gibco16000044
Histone H1t antibodygift from Mary Ann Handel1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS)Gibco14175095
Hyaluronidase from bovine testesSigmaH3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade MountantFisherP36930
rH2AX antibodyMillipore05-635working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibodyQED Bioscience55101working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope SlidesFisher12-550-15
SYCP3 antibodyAbcamab205846working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20)SigmaP9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)InvitrogenV35003
Water bath

Referencias

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