バイオレット励起細胞透過性DNA結合色素を用いたマウス精子細胞の分離

要約

ここでは、成人マウス精巣から生の大腸および後の大動脈芽細胞を分離する簡単で効率的な方法を提示する。低細胞毒性、バイオレット励起DNA結合色素および蛍光活性化細胞選別を使用して、多くの下流用途に対して非常に富んだ精子細胞集団を単離することができる。

要約

メオティック精子細胞の単離は、疾患の根底にある分子メカニズムと精子形成を調べる上で不可欠である。蛍光活性化細胞選別と組み合わせてHoechst 33342染色を使用して確立された細胞分離プロトコルがありますが、紫外線レーザーを装備した細胞選別機が必要です。ここでは、ヘヒスト33342と構造的に類似した低細胞毒性DNA結合色素であるDyeCycle Violet(DCV)染色を用いた細胞分離プロトコルについて説明する。DCVは紫外線レーザーと紫レーザーの両方で励起することができ、紫外線レーザーを搭載していないセルソーターを含む機器の選択の柔軟性を向上させます。このプロトコルを使用すると、レプトテン/ジゴテン、パキテン、ジプロテン精子細胞、およびポストマイオティックラウンド精子を含む、マイオティックプロフェイズIの3つの生細胞亜集団を分離することができます。また、マウスの精巣からの単細胞の中断を準備するプロトコルについても述べた。全体的に見て、この手順は、多くの下流のアプリケーションを容易にする(必要な細胞の数に応じて4〜5時間)完了するまでに短い時間を必要とします。

概要

精子形成は、精子幹細胞の小集団が^成人期を通じて多数の精子の連続的産生を^1,2に持続する複雑なプロセスである。精子形成の間に、動的クロマチンリモデリングは、精子原性細胞が子宮内膜を産生するために^、3、4、5を産生するために、ミオサシスを受けたときに起こる。メオティック精子細胞の単離は分子学的調査に不可欠であり、沈め込みベースの分離^6、7、蛍光活性化細胞選別(FACS)8、9、10、11、12、13、14、15、16、17を含む、複数の異なるアプローチが確立されている。ただし、これらの方法には技術的な制限があります。沈下法による分離は^{、5、6、7の細胞を}多数生成する一方で、労働集約的である。確立されたFACSベースの方法は、DNA含有量および光散乱特性に基づいて微量精子細胞を分離するためにHoechst 33342(Ho342)を使用し、紫外線(UV)レーザー^{8、9、10、11}を備えたFACS細胞選別機を必要とする。代替FACSベースの方法は、蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスライン、精子形成¹²の同期、または生細胞¹³の単離と互換性のない細胞固定および抗体標識を必要とする。細胞透過性DNA結合色素を用いた別の方法があるが、DyeCycleグリーン染色^{14、15、16、17}のこの方法は、若年精巣から精子細胞を単離するために推奨される。したがって、任意の年齢の任意のマウス株に適用することができ、任意のFACS細胞選別機を使用して実行することができる生きている病変精子細胞のための単純で堅牢な分離方法を開発することが重要な必要性があります。

ここでは、DyeCycleバイオレット(DCV)染色を用いた、このような長い間求められていた細胞分離プロトコルについて説明する。DCVは、低細胞毒性、細胞透過性DNA結合色素はHo342に構造的に類似しているが、励起スペクトルが紫範囲¹⁸に向かってシフトしている。さらに、DCVはDCGに比べて広い発光スペクトルを有する。したがって、UVと紫の両方のレーザーで励起することができ、それは、UVレーザーを装備していないFACSセルソーターの使用を可能にする、機器の柔軟性を向上させます。ここで示すDCVプロトコルは、DCVブルーとDCVレッドとの2次元分離を使用し、Ho342プロトコルの利点を模倣しています。この利点により、当社のDCVプロトコルは、成人精巣から高度に濃縮された生殖細胞を分離することを可能にします。我々は、1匹のマウスの成体マウス精巣(2つの精巣から)から生きた精子細胞を分離するための詳細な格言プロトコルを提供する。また、この細胞分離に使用できるマウスのテストからの単一細胞の中断を準備するための効率的かつ迅速なプロトコルについても説明します。手順は、完了する短い時間を必要とします (単一細胞の懸濁液の調製 - 1時間、染料染色 - 30分、および細胞のソート - 2-3時間:合計 - 必要な細胞の数に応じて4〜5時間; 図 1)。細胞分離後、RNA-セク、ATAC-セク、ChIP-セク、および細胞培養を含む広範な下流アプリケーションを完了することができます。

プロトコル

このプロトコルは、制度的動物の世話と使用委員会のガイドラインに従います(プロトコルいいえ。IACUC2018-0040)シンシナティ小児病院医療センターで。

精巣細胞懸濁液の調製のための装置および試薬のセットアップ

1. 各酵素ストックを1xハンクスバランスソルト溶液(HBSS)で準備し、-20°C(表1)に保管する。
   注: 実験の前にいつでも準備してください。
2. 実験の1日前:一晩4°Cで胎児ウシ血清(FBS)を用いたチューブ(1.5mLチューブ)をコーティングします。
3. 実験当日:水浴を37°Cに設定します。
4. 37 °Cでプレウォームダルベックの修正イーグルミディアム(DMEM)を調製し、使用前に各サンプルに対して2mLの1x解離バッファーを調製します(表1)を15 mL遠心管に入れます。
   注: 2 つの mL 解離バッファーは、2 つのテスト用に用意されています。解離バッファのレシピについては、 表1を参照してください。

2. 動物の解剖と精巣細胞懸濁液の調製

1. 生後8週間の雄マウスを、二酸化炭素室に少なくとも10分間放置して犠牲にします。
2. 両方の精巣を取り除き、2 mLの氷冷リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含む60 mmのペトリ皿に置きます。
3. 精巣からチュニカアルブギネアを取り除く。鉗子で穏やかに分離することによって、半生管をわずかに分散させます。
4. 半細管を100mmペトリ皿に移し、氷冷PBSを新たに滴下し、半生卵管を鉗子で優しく解き放つ。この洗浄を3回繰り返して、できるだけ間質細胞を取り除きます。
5. 2 mLの解離緩衝液を含む15 mLチューブ内の非タングされた半細管を37°Cで20分間インキュベートします。
6. 1000 μL マイクロピペットを使用して、チューブを 20 回軽くピペットします。
7. 6分間インキュベートします。穏やかなピペットを20回繰り返します。
8. 3分間インキュベートします。目に見えるチャンクが残らないまで、穏やかなピペットを10回繰り返します。
9. 10 mL の FACS バッファをサスペンションに追加します。室温で5分間 300×g の遠心分離機を使用し、上清を捨てます。
10. ステップ2.9を2回繰り返して、精子とできるだけ多くの破片を取り除く。

3. 細胞染色

1. FACSバッファーの3 mLでセルペレットを再懸濁し(表1)、70 μmナイロンセルストレーナーを通して50 mLチューブにセル懸濁液をフィルターします。
   注:予想される細胞収量は、2つの睾丸あたり約1億個の細胞(8週齢のB6野生型マウス由来)です。
2. 細胞数を数え、細胞の10%を新しいチューブに分割し、染色されていない陰性対照として氷の上に残します。
3. DCV染色の6 μL(元の濃度は5mM)を残りの細胞懸濁液に加え、よく混ぜます。最終濃度は10μMで、容量は約1億個の細胞です。
4. 暗闇の中で30分間37°Cでインキュベートします。10分ごとに細胞懸濁液を軽く振ります。
5. インキュベーション後、洗浄工程を行わずに、5 μL の DNase I (ストック濃度は 10 mg/mL)をセルサスペンションに直接加え、35 μm ナイロン メッシュ キャップを通して 5 mL FACS チューブにセルをフィルターします。サンプルは、ソートまで氷の上に保管してください。

4. フローサイトメトリーと実験ゲート

1. FACS セルソーターを準備します。FACS細胞選別機が励起光学を装備していることを確認してください: バイオレット (405 nm) レーザー;検出光学:450/50バンドパスのフィルターの組み合わせ[DCV-青検出のための4′、6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)の同じフィルタセット]と665/30バンドパス[DCV-赤色検出のためのアロフィコシアニン(APC)の同じフィルタセット]。ここでは、例としてソニーSH800Sセルソーターを使用しています。
2. 新しい実験を作成し、最適化するパラメータを表示する作業プロットを設定します: "ワークシートツール" メニューバーの 「新しい密度」 をクリックして、前方散布 - 面積 (FSC-A) と背面散布 - 領域 (BSC-A) 密度プロットを直線スケールで作成します。[新しいヒストグラム] をクリックして、対数スケールの DCV-blue ヒストグラム プロットを作成します。
3. (ステップ3.2から)未染色の陰性コントロールを簡単に渦を出し、サンプルをロードします。
4. [開始] と [レコード] をクリックして、未染色サンプルの処理を開始します。サンプルの実行中に「検出器としきい値の設定」をクリックして、光増倍管(PMT)電圧を上下に調整してFSCとBSCの電圧を最適化し、未染色セルをFSC/BSCプロットのスケールに配置します。
5. サンプルが実行されている間にPMT電圧を上下に調整して、DCV-blue ヒストグラム対数プロットの最初の 10 年間の DCV 負母集団の位置を特定します (図 2A)。PMT 電圧調整が完了したら、"Stop"をクリックして、染色されていないサンプルをアンロードします。
6. サンプルを簡単に渦(ステップ3.5から)、サンプルをロードします。
7. DCV染色サンプル用の新しいワークシートを作成するには、「次のチューブ」をクリックします。DCV染色サンプルを取得するには、「開始」と「レコード」をクリックして、1 x 10⁶のイベント≥記録します。次の作業プロットを追加する:「ワークシートツール」メニューバーの「新しい密度」をクリックして、直線スケールでFSC-H(高さ)とFSC-W(幅)密度プロットを作成します。線形スケールで DCV-blue と DCV-赤色の密度プロットを作成するには、「新しい密度」をクリックします。1 × 10⁶個≥イベントを記録した後、[停止] をクリックしてサンプルをアンロードします。
8. FSC-A と BSC-A 密度プロットで、[ "プロット ツール" メニュー バーの "ポリゴン" をクリックして、大きなゲート "セル" を描画して、ほとんどのセルを含め、小さな破片を除外します (図 2B)。ゲート "セル" を FSC-H と FSC-W 密度プロットに適用します。単一セル以外のセルを除外するには、[四角形] をクリックして "単一セル" のゲートを描画します (図 2C)。
9. 「単一セル」のゲートをDCV-blueとDCV-赤色の密度プロットに適用し、図2Dに示すように拡張プロファイルをキャプチャするようにスケールを調整します。[ プロットツール] メニュー バーの[ ポリゴン] をクリックして 、 "DCV" ゲートを描画し、染色されていないセルとサイドの母集団を除外します (図 2D)。
10. 線形スケールで DCV-青ヒストグラムプロットに"DCV"ゲートを適用します。3つの主要なピークは、異なるDNA含有量を指します: 1C, 2C, 4C (図2E)。
11. 線形スケールで DCV-blue と DCV-赤色の密度プロットを作成し、図2Eからバックゲートを実行して 1C および 4C の母集団を見つけるためにDCVゲートを適用するには、「新しい密度」 をクリックします (図 2F)。「楕円」をクリックして、凝縮されたエリア(ゲート1C)内にある1C集団にゲートを描画します。「ポリゴン」をクリックして、連続した曲線(ゲート4C)である4C集団にゲートを描画します。
12. 線形スケールで DCV-blue と DCV-赤色の密度プロットを作成し、「4C」ゲートを適用するには、「新しい密度」をクリックします。拡大する縮尺を調整し、より正確な選択のために "4C_1" ゲートを描画するには[ポリゴン] をクリックします (図 2G) 。
13. 「新しい密度」をクリックして、新しいFSC-AとBSC-A密度プロットを線形スケールで作成し、「4C_1」ゲートを適用します。レプトテン(L)/ジゴテン(Z)、パキテン(P)、ジプロテン(D)精子に対応するサイズで分離された3つの濃縮集団があります。「多角形」または「楕円」をクリックして、拡大するサイズに基づいて「L/Z」、「P」、および「D」の3つのゲートを描画します(図2H)。
14. 「新しいドットプロット」をクリックして、DCV-blueとDCV-赤色のカラードットプロットを線形スケールで作成してゲートを適用し、3つの母集団が「4C_1」ゲート内の連続した順序であることを確認します(図2I)。
15. 同様に、1C の人口に対しては、新しいFSC-Aと BSC-A 密度プロットを線形スケールで作成し、"1C" ゲートを適用し、細胞の統一されたサイズを純粋な円形の精子集団として選択し、"楕円" をクリックして "RS" ゲート ( 図2J) を描画します。

5. 男性生殖細胞の亜集団を並べ替える

1. 500 μL 50% FBS を含む 1.5 mL チューブをセルコレクション用に準備し、コレクションチューブをコレクターにロードし、「負荷収集」をクリックします。
2. "次のチューブ" をクリックします, " 開始 "レコード" と "並べ替え開始" をクリックします。コレクションデバイスに同時に関心のある2つの集団をソートできる双方向システムを使用する場合は、L/ZおよびPバックゲートに基づくレプトテン(L)/ジゴテン(Z)とパキテン(P)精子細胞のペアワイズの組み合わせに従ってください。RSおよびDバックゲートに基づく円形精子(RS)およびジプロテン(D)精子。
3. サンプルの実行中に、最も効率的な並べ替えを行うために、流量を ~3000 イベント/s に調整します。

6. 並べ替え細胞の純度分析

1. 10,000個のセル/各集団≥収集します。細胞免疫染色を行い、サブステージを確認する。
2. 4°Cで5分間300 x g の遠心分離機を使用し、チューブの底部に約110μLの液体を入れ、上清を慎重に捨てます。
3. 細胞懸濁液を10μL滴で取り、顕微鏡下で観察し、概略細胞の形態と数を評価します。
4. 100 μLのセル懸濁液を各サンプルチャンバースライド( 材料表参照)に塗布し、チャンバーをCytospinにロードします。
5. 室温で5分間、30 x g でサンプルを回転させます。疎水性ペンでセルの周りに円を描きます。実験室のベンチの乾いたスライドは、室温で数分間行います。
6. スライドの円の中にPBSの50 μLをドロップし、タップオフします。
7. スライドの円に一次抗体溶液(PBSに5%ロバ血清を含む希薄な一次抗体、0.02%ポリソルベート20)を加え、一晩4°Cでインキュベートします。
   注:大細胞精子細胞のサブステージを判断するために、SYCP3は、大尾染色体軸のマーカーである、およびDNA損傷応答のマーカーであるγH2AXを検出した。(抗体の働き濃度については、 材料表を参照してください。
8. スライドから一次抗体溶液をタップします。
9. スライドの円の中にPBSの50 μLをドロップし、タップオフします。1 回繰り返します。
10. 二次抗体溶液(0.02%ポリソルベート20のPBSで希薄二次抗体)をスライドの円に加え、暗い1時間室温でインキュベートします。
11. スライドの円の中にPBSの50 μLをドロップし、タップオフします。1 回繰り返します。
12. 50 μL の DAPI(ストック濃度は 0.1 μg/mL)の染色を 5 分間追加し、タップオフします。
13. スライドに1~2滴の取り付けメディアを追加します。取り付けメディアをカバーガラスで慎重に覆い、カバーガラスを軽く押して、余分な取り付けメディアと気泡を取り除きます。スライドは顕微鏡評価の準備ができています。

結果

この分類プロトコルの代表的な結果を図 3に示します。2つの精巣(1つのマウス)の総選別時間は、通常、細胞懸濁液の濃度と並べ替え速度に依存する約3時間である。選別後、SYCP3およびγH2AXの免疫染色により精子細胞の純度が確認される(図3A)。並べ替えられたL/Z、P、D精子の分画の代表純度は、それぞれ約80.4%、90.6%、および87.6%である(

ディスカッション

ここでは、単一の成人男性マウスから精子と精子の亜集団を分離するための実用的で簡単なプロトコルを提示する。このプロトコルの再現性を確保するために、注意が必要な重要な手順がいくつかあります。酵素消化の前に、洗浄ステップは間質細胞を除去することを目的としている。消化後、このステップは精子や破片を除去するのに役立ちます。洗浄/遠心分離3回が重要です。当社の解?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tube	Watson	131-7155C
100 mm Petri dish	Corning, Falcon	351029
15 mL Centrifuge tube	Watson	1332-015S
5 ml polystyrene tube with cell strainer snap cap (35 µm nylon mesh)	Corning, Falcon	352235
50 mL Centrifuge tube	Watson	1342-050S
60 mm Petri dish	Corning, Falcon	351007
70 µm nylon mesh	Corning, Falcon	352350
Cell sorter	Sony	SH800S
Centrifuge
Collagenase, recombinant, Animal-derived-free	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-23141
Collagenase, Type 1	Worthington	LS004196
Cover glass	Fisher	12-544-G
Cytospin 3	Shandon
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	Fisher	D1306	working concentration: 0.1 μg/mL
Dnase I	Sigma	D5025-150KU
Donkey serum	Sigma	S30-M
Dulbecco’s phosphate-buffered saline (DPBS)	Gibco	14190144
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11885076
Fetal bovine serum (FBS)	Gibco	16000044
Histone H1t antibody	gift from Mary Ann Handel		1/2000 diluted
Hank’s balanced salt solution (HBSS)	Gibco	14175095
Hyaluronidase from bovine testes	Sigma	H3506-1G
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P5493-4L
Pipettemen
ProLong Gold Antifade Mountant	Fisher	P36930
rH2AX antibody	Millipore	05-635	working concentration: 2 μg/mL
Sperm Fertilization Protein 56 (Sp56) antibody	QED Bioscience	55101	working concentration: 0.5 μg/mL
Sterilized forceps and scissors
Superfrost /Plus Microscope Slides	Fisher	12-550-15
SYCP3 antibody	Abcam	ab205846	working concentration: 5 μg/mL
TWEEN 20 (Polysorbate 20)	Sigma	P9416
Vybrant DyeCycle Violet Stain (DCV)	Invitrogen	V35003
Water bath