在后循环卒中临床前模型中使用激光散斑成像和使用 MRI 量化脑灌注量

摘要

利用 LVO 卒中的犬模型开发激光斑点成像以实时监测脑灌注。 弥散加权 MRI 经过优化，利用高 b 值对梗死体积进行成像，启用 ADC 和 MRA，与中风时的 DSA 相关。 最后，ADC 重建与组织学发现相关。

摘要

背景： 基底动脉闭塞 （BAO） 是后循环卒中的一个亚型，死亡率高达 90%。 目前诊断缺血性卒中的临床标准包括计算机断层扫描 （CT）、CT 血管造影和灌注以及磁共振成像 （MRI）。缺乏准确反映临床疾病的大型动物临床前模型以及评估卒中负担和评估治疗方法的方法。

方法： 我们描述了后循环中大血管闭塞 （LVO） 中风的犬模型，并开发了一种激光散斑成像 （LSI） 协议来实时监测灌注变化。 然后，我们利用高 b 值 DWI （b=1800s/mm²） MRI 来提高检测灵敏度。我们还评估了磁共振血管造影 （MRA） 评估动脉闭塞并与 DSA 相关的能力。最后，我们通过表观弥散系数 （ADC） 与组织学映射验证了梗死面积。

结果： 血栓栓塞的给药使 DSA 追踪的基底动脉闭塞 （n=7）。  LSI 与 DSA 相关，表明卒中发作后灌注减少在整个实验过程中持续存在，使我们能够实时监测灌注。 具有狗最佳 b 值的 DWI 说明了每搏输出量，并允许我们获得 ADC 和磁共振血管造影 （MRA） 图像。实验结束时进行的 MRA 与闭塞后进行的 DSA 相关。最后，MRI 上的卒中负担与组织学相关。

结论： 我们的研究表明，使用 LSI 对后循环中风的犬血栓栓塞 LVO 模型进行实时灌注成像，该模型利用在缺血性中风的诊断和治疗中很重要的多模式成像。

引言

全球中风的患病率接近 2570 万，其中大多数是缺血性¹。 后循环中风占所有中风的 20%，其中基底动脉闭塞最严重，死亡率接近 90% ^1,2。 1995 年，重组组织纤溶酶原激活剂 （rtPA） 是针对中风发作后 3 小时内就诊的患者开发的首个急性疗法³。最近，机械血栓切除术已被证明对治疗大血管闭塞 （LVO） 患者的急性缺血性中风有益，其中包括颈内动脉的颅内部分或大脑前动脉和中动脉的第一段⁴。 最近的临床试验均未包括后循环卒中，尽管使用机械血栓切除术治疗基底动脉闭塞，但其结果仍然令人沮丧 ^5,6。

中风患者评估技术的进步对预测功能恢复和生存的机会有影响⁷。后循环卒中的临床前模型先前已描述过 ^8,9,10，但评估卒中负荷和血运重建仍然不是最佳选择。 啮齿动物等较小的物种具有多种优势，包括易于基因作、动物购买成本低和每日住房成本低^11,12。然而，小动物实验有时并不能完全代表大型动物和人类脉管系统、生理状况或相关的炎症反应⁷。大型动物更接近于人类中风 ^2,7,13,14。 此外，可以进行连续血液采样以分析血栓形成和炎症标志物的血液。

在这项研究中，我们描述了一个从中风发作开始通过数字减影血管造影 （DSA） 验证的基底动脉闭塞犬模型。 我们利用激光散斑灌注成像 （LSI） 来实时监测灌注。 然后，我们利用一种基于激光散斑灌注成像 （LSI） 采集的新型微血管增强算法以及高 b 值磁共振成像 （MRI） 技术来优化梗塞成像¹⁵。这些技术使我们能够监测和量化局部和整体缺血。最后，我们将这些影像学检查结果与组织学相关联。了解预后和在临床前模型中研究后循环卒中的必要性对于改进治疗至关重要。

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研究方案

所有程序均按照俄亥俄州立大学机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 批准的《动物福利法》和《实验动物护理和使用指南》（NRC 2011） 执行。

1. 第 1 步：动物准备和手术方案 如前所述，使用基底动脉闭塞 （BAO） 中风的犬模型 ^9,10。

1. 快速成年比格犬（8-13 公斤，14-21 个月大）过夜，可免费饮水。
2. 麻醉前注射乙酰丙嗪 （0.2 mg/kg） 肌肉注射
3. 将 20 号导管插入头静脉。
4. 通过静脉内施用氯胺酮 （10 mg/kg） 和咪达唑仑 （0.025 mg/kg） 诱导麻醉。
5. 麻醉诱导后，为狗插管并使用恒定吸入麻醉（2-3% 异氟醚）进行机械通气。
6. 创建一个 1 cm² 的开颅手术窗口，用于激光散斑成像。
7. 将 7F 动脉鞘引入右侧股动脉，用于通路和血压测量。
8. 将 16 号血管导管插入右股静脉进行抽血。
9. 如前所述准备血栓栓塞（血凝块）¹⁶.简而言之，抽取 5 mL 犬全血与 0.5 g 硫酸钡 （Ba₂SO₄） 并在塑料血清采血管中混合，同时滚动 30 秒。导管给药前，将混合物在室温下静置 60 分钟。
10. 在进入基底中动脉之前开始记录基线数字减影血管造影 （DSA）。在透视引导下，使用逆行经主动脉入路将 4F 引导导管推进到先前通过椎动脉到基底动脉底部的 7F 动脉鞘中。注射 2 毫升造影剂和生理盐水以识别基底动脉。
11. 使用手术刀，将凝块切成具有富含纤维蛋白和富含红细胞层¹⁶ 的小块，装入 3 mL 注射器中，并通过微导管注射到基底动脉中间。让凝块稳定 10 分钟。进行后续血管造影以验证您想要的凝块位置。动脉闭塞可以通过 DSA 验证，并通过激光散斑成像 （LSI） 减少脑灌注来验证。

2. Step 2 激光散斑成像

1. 将激光斑点灌注成像 （LSI） 相机对准颅窗。如前所述配置高分辨率激光散斑成像 （LSI） 相机系统¹⁵.
2. 在所需时间点记录血管造影期间中断的灌注。在该犬科模型中，使用 785 nm 波长和 80 mW 激光器以 60 Hz 的采样率在 10 cm 的工作距离下从 1.5 cm x 1.5 cm 的视野中采集数据。
3. 从实时灌注图中，选择感兴趣时间 （TOI） 以仅包含较低的峰，以排除与呼吸运动相关的伪影。使用 PimSoft v1.4 软件在 10 s 采样周期内的平均相对灌注单位。如前所述执行激光散斑对比分析 （LASCA）¹⁵.
4. 为了优化该犬类模型中脑微血管系统的量化，以每秒 15 帧的速度记录图像，并在 5 x 5 像素区域上以 5 帧的时空平均进行强度和方差计算。强度和方差数据的总帧速率为每秒 3 帧。选择每个像素的灌注中值，以减少由于犬呼吸运动导致灌注读数突然大幅变化对平均值的影响。将原始数据转换为二进制文件，并将数据处理成有意义的脉管系统成像。利用程序重新设计的 LASCA 算法 （rt-LASCA） 使用造影剂数据随时间的变化来确定脉管系统的位置，如前所述¹⁵。

3. 第 3 步 磁共振成像 （MRI） 和磁共振血管造影

1. 如果需要，在手术前一天进行 MRI 以进行比较，然后重复以确认 BAO，如果要评估治疗，则在牺牲前再次进行。
2. 如前所述，将连续麻醉的犬齿头先置于仰卧位，如西门子 Prisma 3 特斯拉场强和 60 厘米直径孔径的 MRI 扫描仪（包括一个 32 通道头线圈作为接收器，具有增强的平行成像性能）来获得大脑图像¹⁷。
3. 在解剖成像开始之前，执行定位器扫描以获取每个犬大脑的飞行员图像。 用于获取所呈现数据的系统具有集成的成像系统，可以在最佳空间和时间分辨率下进行更快的扫描。80 mT/m 梯度可生成高质量的 T2 加权、弥散加权图像和 MR 血管造影。弥散加权成像 （DWI） 足够敏感，与传统的结构 MRI 方法（如 T2 加权图像）相比，可以显示更多的解剖亚结构。在本研究中，在 BAO 后 4 小时进行 MRI 检查。
4. 正确定位后，执行 T2 加权梯度回波成像（参数：FOV = 130 毫米，矩阵尺寸 = 320 x 320，像素大小 = 0.3 x 0.3 毫米，切片厚度 =3 毫米，TR= 4s，FA= 180 度，BW =255 Hz/像素，NEX= 2，TE=75 毫秒，分辨率 = 2.4615 像素/毫米），然后进行血流衰减反转恢复 （FLAIR） 成像以可视化大脑解剖结构。
5. 进行磁共振血管造影 （MRA） 以可视化血管解剖结构和血液循环测量。在横向视图中使用飞行时间 3D （TOF） 序列获取覆盖头部和颈部的大脑的 MRA（参数：FOV = 129x129 mm，矩阵尺寸 = 768 x 768，像素大小 = 0.3 x 0.3 mm，切片厚度 = 81.59 mm，TR= 25 ms，FA = 18 度，BW = 185 Hz/像素，NEX= 1，TE=4.22 毫秒，分辨率 = 5.91 像素/毫米）。使用 3D 颜色编码可视化执行最大强度投影 （MIP），以最大限度地提高血管中的信号强度。 对采集的 DICOM 图像进行后处理，以可视化血管并确认基底动脉闭塞。

4. Step 4 弥散加权成像和每搏输出量计算

1. 执行弥散加权成像序列以检测急性缺血性中风（参数：FOV = 149 毫米 x149 毫米，基质尺寸 = 132 x0x0x 100，像素尺寸 = 0.30 毫米 x 0.30 毫米，切片厚度 = 4 毫米，TR = 4.6 秒，FA = 90 度，带宽 = 255 Hz/像素，NEX= 1，TE = 86 毫秒，分辨率 = 0.93 像素/毫米）。传输 DICOM 图像进行后处理。
2. 从 DWI 图像生成表观弥散图 （ADC） 并使用 OsiriX MD v.5.0 软件计算梗死体积。
3. 每个切片描摹脑半球和梗塞区域，并乘以切片厚度以获得梗塞体积。
4. 将绝对整体体积转换为 100 个单位以计算每只犬的每只犬的每程百分比。

5. 第 5 步：苏木精和伊红染色脑组织学

1. 在麻醉犬中处死时，收获大脑并用锋利的手术刀切下两个 4 毫米厚的内侧切片，一个切片将用于下面的 TTC 染色。
2. 将 4 mm 切片用 10% 福尔马林固定至少 7 天，以允许渗透到整个切片中。
3. 按照我们的方案¹⁷ 将固定脑切片嵌入石蜡中。
4. 修整和调平每个石蜡块（可以同时存储和处理多个块）。
5. 将每个石蜡块切成 4 μm 的切片，并将切割的组织放在 2 英寸 x 3 英寸的载玻片上。
6. 在苏木精 560 中处理每张载玻片 8 分钟，用 1% 酸性酒精区分 1 秒 3 次，用自来水冲洗。
7. 用 1% 氢氧化铵使每张玻片蓝色 1 秒，然后用自来水冲洗 2 秒。
8. 在 70% 乙醇中脱水 1 秒 12 次，用伊红复染 1 分钟。
9. 在 95% 中脱水 1 秒 12 次，然后用 100% 乙醇脱水。
10. 用二甲苯清除，并用封固剂贴上 2 英寸 x 3 英寸的盖玻片，去除气泡。

6. 步骤 6 2% 2,3,5-三苯基四唑氯化物脑染色

1. 将 H&E 切片旁收获的第二个 4 mm 切片放入先前制备的溶液中，该溶液含有 100 mL 2% 2,3,5-三苯基-2H-四唑氯化物 （TTC），溶于 pH 7.4 PBS，并在黑暗中加热至 37 °C。
2. 在 37 °C 的黑暗中孵育至少 20 分钟，每 5 分钟轻轻翻转一次脑切片。
3. 当切片两侧变为樱桃红色时，去除 TTC 溶液并用 PBS 中的 4% 多聚甲醛（pH 7.4）替换，以优化过夜的对比度。
4. 当大脑中白色和红色染色的对比度最佳时（1-3 天），放在透明塑料片之间，擦干多余的液体，并以高分辨率扫描。
5. 如前所述，追踪缺血区域和全脑滑片以获得每个部分的梗死百分比¹⁷。

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结果

激光散斑灌注记录和成像： 连续进行灌注记录，直到动物被运送到 MRI，并在处死时再次进行（图 1A）。数据显示，在基底动脉闭塞 （pre-BAO） 之前的时间点，脑灌注下降了 ~15% 至 83 ± 10%。这种名义上的下降可能是由于椎动脉远端插入微导管的结果。注射制剂血栓栓塞后，BAO 后灌注降至平均 33 ± 2.6%，比基线下降了 ~67%（

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讨论

后循环卒中最常见的原因包括栓塞、大动脉粥样硬化和小动脉疾病⁵。基底动脉闭塞 （BAO） 是后循环卒中的一个子集，发病率和死亡率很高¹³。在这种情况下，使用了急性后卒中的犬模型，我们开发了一个 LSI 协议来实时监测闭塞区域的灌注。激光斑点灌注成像通过一个小颅窗进行，提供有关确定感兴趣区域的实时信息。卒中发作后灌?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)	Sigma Aldrich	T8877
EDTA K3 vacutainers	Becton Dickinson	BD455036
Eosin	Surgipath	3801602
Formalin, neutral buffered, 10%	Richard-Allan Scientific	5701
Hematoxylin 560	Surgipath	3801570
HUG-U-VAC positioning system	DRE Veterinary	1320
LabChart Software	ADInstruments Inc.
Laser Speckle Imaging camera	Perimed Inc., Jarfalla, Sweden	PeriCam PSI HR System
Lithium heparin vacutainer, 4.5%	Becton Dickinson	BD 368056
Matlab	The MathWorks, Inc., Natick, MA
OsiriX MD v.5.0 software	Pixmeo Inc, Geneva
Paraformaldehyde 4% in PBS	Alfa Aesar	AAJ61899AP
PimSoft v1.4 software	Perimed Inc.	software that accompanies LSI equipment
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet	Siemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe)	NovaPlus	402525D