Cuantificación de la perfusión cerebral mediante láser y del volumen del infarto mediante resonancia magnética en un modelo preclínico de accidente cerebrovascular circulatorio posterior

Resumen

Se utilizó un modelo canino de accidente cerebrovascular de LVO para desarrollar imágenes de moteado láser para monitorear la perfusión cerebral en tiempo real.  La resonancia magnética ponderada por difusión se optimizó para obtener imágenes del volumen del infarto utilizando un valor b alto, lo que permitió la ADC y la ARM, correlacionadas con la DSA en el momento del accidente cerebrovascular.  Finalmente, las reconstrucciones de ADC se correlacionaron con los hallazgos histológicos.

Resumen

Fondo: La oclusión de la arteria basilar (BAO, por sus siglas en inglés) es un subconjunto del accidente cerebrovascular de circulación posterior que conlleva una mortalidad de hasta el 90%.  El estándar clínico actual para diagnosticar el accidente cerebrovascular isquémico incluye la tomografía computarizada (TC), la angiografía por TC y la perfusión y la resonancia magnética (RMN). Faltan modelos preclínicos de animales grandes que reflejen con precisión la enfermedad clínica, así como métodos para evaluar la carga de accidentes cerebrovasculares y evaluar los tratamientos.

Métodos: Describimos un modelo canino de accidente cerebrovascular por oclusión de grandes vasos (LVO) en la circulación posterior y desarrollamos un protocolo de imágenes de moteado láser (LSI) para monitorear los cambios en la perfusión en tiempo real.  A continuación, utilizamos una resonancia magnética DWI de alto valor b (b = 1800 s/mm²) para aumentar la sensibilidad de detección. También evaluamos la capacidad de la angiografía por resonancia magnética (ARM) para evaluar la oclusión arterial y correlacionarla con la DSA. Finalmente, verificamos el tamaño del infarto a partir del mapeo del coeficiente de difusión aparente (CDA) con histología.

Resultados: La administración de tromboembolismo ocluyó la arteria basilar según el seguimiento de la DSA (n = 7).   El ISL se correlacionó con el DSA, demostrando una reducción de la perfusión tras el inicio del ictus que persistió durante todo el experimento, lo que nos permitió monitorizar la perfusión en tiempo real.  El DWI con un valor b optimizado para perros ilustró el volumen sistólico y nos permitió obtener imágenes de ADC y angiografía por resonancia magnética (ARM). La ARM realizada al final del experimento se correlacionó con la DSA realizada después de la oclusión. Por último, la carga de accidente cerebrovascular en la RM se correlacionó con la histología.

Conclusiones: Nuestros estudios demuestran imágenes de perfusión en tiempo real utilizando LSI de un modelo de LVO tromboembólico canino de accidente cerebrovascular de circulación posterior, que utiliza imágenes multimodales importantes en el diagnóstico y tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico.

Introducción

La prevalencia de ictus en todo el mundo es de casi 25,7 millones, la mayoría de los cuales son isquémicos¹.  El accidente cerebrovascular circulante posterior representa el 20% de todos los accidentes cerebrovasculares, de los cuales la oclusión de la arteria basilar es el más grave, acercándose al 90% de mortalidad ^1,2.  En 1995, el activador tisular recombinante del plasminógeno (rtPA) fue la primera terapia aguda desarrollada para el accidente cerebrovascular isquémico en pacientes que se presentaron dentro de las 3 horas posteriores al inicio del accidente cerebrovascular³. Más recientemente, la trombectomía mecánica ha demostrado ser beneficiosa en el tratamiento del accidente cerebrovascular isquémico agudo en pacientes que presentan oclusión de grandes vasos (LVO), que incluye la porción intracraneal de la arteria carótida interna o el primer segmento de las arterias cerebrales anterior y media⁴.  Ninguno de los ensayos clínicos recientes incluyó el accidente cerebrovascular de circulación posterior y sus resultados siguen siendo sombríos a pesar de utilizar la trombectomía mecánica para la oclusión de la arteria basilar ^5,6.

Los avances en las técnicas de evaluación en pacientes con ictus tienen un impacto en la predicción de las posibilidades de recuperación funcional y supervivencia⁷. Se han descrito previamente modelos preclínicos de accidente cerebrovascular de circulación posterior ^8,9,10, sin embargo, la evaluación de la carga de accidente cerebrovascular y la revascularización siguen siendo subóptimas.  Las especies más pequeñas, como los roedores, ofrecen varias ventajas, entre ellas la facilidad de manipulación genética, la compra económica de animales y los bajos costos diarios de alojamiento^11,12. Sin embargo, los experimentos con animales pequeños a veces no representan completamente la vasculatura de animales grandes y humanos, las condiciones fisiológicas o las respuestas inflamatorias relacionadas⁷. Los animales grandes imitan más de cerca el accidente cerebrovascular humano 2,7,13,14.  Además, se pueden realizar muestras de sangre seriadas para el análisis de sangre de marcadores trombóticos e inflamatorios.

En este estudio describimos un modelo canino de oclusión de la arteria basilar verificado por angiografía por sustracción digital (DSA) desde el inicio del ictus.  Utilizamos imágenes de perfusión por láser moteado (LSI) para monitorear la perfusión en tiempo real.  A continuación, utilizamos un novedoso algoritmo de mejora microvascular basado en la adquisición de imágenes de perfusión por moteado láser (LSI), así como una técnica de resonancia magnética (RM) de alto valor b para optimizar las imágenes de infarto¹⁵. Estas técnicas nos permiten monitorizar y cuantificar la isquemia local y global. Finalmente, correlacionamos estos hallazgos imagenológicos con la histología. Comprender el pronóstico y la necesidad de estudiar el accidente cerebrovascular circulatorio posterior en modelos preclínicos es fundamental para mejorar las terapias.

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Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NRC 2011), aprobada por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad Estatal de Ohio.

1. Paso 1: Preparación del animal y protocolo quirúrgico Se utilizó un modelo canino de accidente cerebrovascular por oclusión de la arteria basilar (BAO) como se describió anteriormente ^9,10.

1. Beagles adultos rápidos (8-13 kg, 14-21 meses de edad) durante la noche con libre acceso al agua.
2. Inyectar, antes de la anestesia, una administración intramuscular de acepromazina (0,2 mg/kg)
3. Introducir un catéter de calibre 20 en una vena cefálica.
4. Inducir la anestesia con administración intravenosa de ketamina (10 mg/kg) y midazolam (0,025 mg/kg).
5. Después de la inducción anestésica, intubar a los perros y ventilarlos mecánicamente con anestesia inhalada constante (isoflurano al 2-3%).
6. Cree una ventana de craneotomía de 1 cm² para la obtención de imágenes de moteado láser.
7. Introducir una vaina arterial 7F en la arteria femoral derecha para el acceso y la medición de la presión arterial.
8. Introducir un angiocatéter de calibre 16 en la vena femoral derecha para las extracciones de sangre.
9. Prepare el tromboembolus (coágulo de sangre) como se describió anteriormente¹⁶. Brevemente, extraiga y mezcle 5 ml de sangre entera canina con 0,5 g de sulfato de bario (Ba₂SO₄) en un tubo de extracción de sangre de suero de plástico mientras rueda durante 30 segundos. Deje reposar la mezcla sin tocar durante 60 minutos a temperatura ambiente antes de la administración del catéter.
10. Comience a registrar la angiografía por sustracción digital (DSA) basal antes de acceder a la arteria basilar media. Avance un catéter guía 4F bajo guía fluoroscópica, utilizando un abordaje transaórtico retrógrado, en la vaina arterial 7F previamente colocada en la arteria femoral derecha a través de una arteria vertebral hasta la base de la arteria basilar. Inyecte dos mililitros de agente de contraste con solución salina normal para identificar la arteria basilar.
11. Con un bisturí quirúrgico, resecar el coágulo en pedazos pequeños con capas¹⁶ ricas en fibrina y eritrocitos para cargarlo en una jeringa de 3 ml e inyectarlo a través del microcatéter en el centro de la arteria basilar. Deje que el coágulo se estabilice durante 10 minutos. Realice una angiografía de seguimiento para verificar la ubicación deseada del coágulo. La oclusión arterial puede verificarse mediante DSA y la disminución de la perfusión cerebral mediante imágenes de moteado láser (LSI).

2. Paso 2: Imágenes de moteado láser

1. Enfoque la cámara de imágenes de perfusión por moteado láser (LSI) en la ventana craneal. Configure el sistema de cámara de imágenes de moteado láser (LSI) de alta resolución como se describió anteriormente¹⁵.
2. Registre la perfusión con interrupciones durante la realización de la angiografía en los momentos deseados. Adquiera datos de un campo de visión de 1,5 cm x 1,5 cm utilizando una longitud de onda de 785 nm y láseres de 80 mW con una frecuencia de muestreo de 60 Hz a una distancia de trabajo de 10 cm en este modelo canino.
3. En los gráficos de perfusión en tiempo real, elija el tiempo de interés (TOI) para incluir los picos más bajos solo para excluir los artefactos relacionados con el movimiento respiratorio. Promedio de unidades de perfusión relativa durante un período de muestreo de 10 s utilizando el software PimSoft v1.4. Realice el análisis de contraste de moteado láser (LASCA) como se describió anteriormente¹⁵.
4. Para optimizar la cuantificación de la microvasculatura cerebral en este modelo canino, grabe imágenes a 15 fotogramas por segundo y realice cálculos de intensidad y varianza con un promedio espaciotemporal en un área de 5 x 5 píxeles con 5 fotogramas. La velocidad de fotogramas general para los datos de intensidad y varianza fue de 3 fotogramas por segundo. Elija el valor medio de perfusión para cada píxel para reducir los efectos sobre la media de grandes cambios repentinos en las lecturas de perfusión debido al movimiento de la respiración canina. Convierta los datos sin procesar en archivos binarios y procese los datos en imágenes significativas de la vasculatura. Utilizar el algoritmo LASCA rediseñado por el programa (rt-LASCA) para utilizar la varianza de los datos de contraste a lo largo del tiempo para determinar las ubicaciones de la vasculatura como se describió anteriormente¹⁵.

3. Paso 3: Resonancia magnética (RM) y angiografía por resonancia magnética

1. Realice una resonancia magnética el día antes de la cirugía para compararla si lo desea, luego repita para confirmar la BAO y nuevamente antes del sacrificio si se va a evaluar una terapia.
2. Coloque caninos anestesiados continuamente de cabeza en posición supina como se describió anteriormente en un escáner de resonancia magnética Siemens Prisma 3 Tesla de intensidad de campo y diámetro de 60 cm de diámetro que incluye una bobina de cabeza de 32 canales como receptor con un rendimiento de imagen paralela mejorado para obtener imágenes cerebrales¹⁷.
3. Realice exploraciones con localizadores para adquirir imágenes piloto de cada cerebro canino antes de que comiencen las imágenes anatómicas.  El sistema utilizado para obtener los datos presentados tiene un sistema de imágenes integrado que permite un escaneo más rápido en resoluciones espaciales y temporales óptimas. Los gradientes de 80 mT/m generan imágenes de alta calidad ponderadas en T2 y en difusión, así como angiografías por resonancia magnética. Las imágenes ponderadas por difusión (DWI) son lo suficientemente sensibles y pueden mostrar más subestructuras anatómicas que los métodos convencionales de resonancia magnética estructural, como las imágenes ponderadas en T2. En este estudio, la resonancia magnética se realizó 4 h después de la BAO.
4. Después de una localización adecuada, realice imágenes de eco de gradiente ponderadas en T2 (parámetros: FOV = 130 mm, tamaño de la matriz = 320 x 320, tamaño de píxel = 0,3 x 0,3 mm, grosor de corte = 3 mm, TR = 4s, FA = 180 grados, BW = 255 Hz/píxel, NEX = 2, TE = 75 ms, resolución = 2,4615 píxeles por mm) seguido de una imagen de recuperación de inversión atenuada de flujo (FLAIR) para visualizar la estructura de la anatomía del cerebro.
5. Realizar angiografía por resonancia magnética (ARM) para visualizar la anatomía vascular y la medición de la circulación sanguínea. Adquiera la ARM del cerebro que cubre la cabeza y el cuello con una secuencia 3D de tiempo de vuelo (TOF) en vista transversal (Parámetros: FOV = 129x129 mm, tamaño de la matriz = 768 x 768, tamaño de píxel = 0,3 x 0,3 mm, grosor de corte = 81,59 mm, TR= 25 ms, FA= 18 grados, BW = 185 Hz/píxel, NEX= 1, TE = 4,22 ms, resolución = 5,91 píxeles por mm). Realice una proyección de máxima intensidad (MIP) con visualización 3D codificada por colores para maximizar la intensidad de la señal en los vasos sanguíneos.  Imágenes DICOM adquiridas después del proceso para visualizar los vasos sanguíneos y confirmar que la arteria basilar estaba ocluida.

4. Paso 4: Imágenes ponderadas por difusión y cálculo del volumen sistólico

1. Realice una secuencia de imágenes ponderada por difusión para detectar accidentes cerebrovasculares isquémicos agudos (parámetros: FOV = 149 mm x149 mm, tamaño de la matriz = 132 x0x0x 100, tamaño de píxel = 0,30 mm x 0,30 mm, grosor de corte = 4 mm, TR = 4,6 s, FA = 90 grados, BW = 255 Hz/píxel, NEX = 1, TE = 86 ms, resolución = 0,93 píxeles por mm). Transfiera imágenes DICOM para su posprocesamiento.
2. Genere mapas de difusión aparente (ADC) a partir de imágenes DWI y calcule los volúmenes de infarto utilizando el software OsiriX MD v.5.0.
3. Traza tanto los hemisferios cerebrales como las áreas del infarto por corte y multiplícalo por el grosor del corte para adquirir los volúmenes del infarto.
4. Convierte el volumen total absoluto a 100 unidades para calcular el porcentaje de volumen brazado de cada canino.

5. Paso 5: Histología cerebral con tinción de hematoxilina y eosina

1. En el momento del sacrificio en canino anestesiado, se extrae el cerebro y se cortan dos secciones mediales de 4 mm de grosor con un bisturí afilado, una sección se utilizará para la tinción de TTC debajo.
2. Fije la sección de 4 mm en formol al 10% durante un mínimo de 7 días para permitir la infiltración en toda la sección.
3. Incrustar la sección fija del cerebro en parafina siguiendo nuestro protocolo¹⁷.
4. Recorte y nivele cada bloque de parafina (se pueden almacenar y procesar varios bloques al mismo tiempo).
5. Separe cada bloque de parafina a 4 μm y coloque el tejido cortado en un portaobjetos de 2 "x 3" pulgadas.
6. Procese cada portaobjetos en Hematoxylin 560 durante 8 min, diferencie con alcohol ácido al 1% durante 1 s tres veces con enjuague con agua del grifo.
7. Azule cada portaobjetos con hidróxido de amonio al 1% durante 1 segundo y enjuague durante 2 segundos con agua del grifo.
8. Deshidratar en etanol al 70% durante 1 s doce veces, contrateñido en eosina durante 1 min.
9. Deshidratar al 95% durante 1 segundo doce veces seguido de etanol al 100%.
10. Limpie en xileno y aplique un cubreobjetos de 2" x 3" pulgadas con medios de montaje, eliminando las burbujas de aire.

6. Paso 6: 2% de cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio, tinción cerebral

1. Coloque la segunda sección de 4 mm que se cosechó junto a la sección de H&E en una solución previamente preparada que contenga 100 mL de cloruro de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazolio (TTC) al 2% en pH 7,4 PBS calentado a 37 °C en la oscuridad.
2. Incubar en la oscuridad a 37 °C durante al menos 20 minutos, volteando suavemente la sección del cerebro cada 5 minutos.
3. Cuando la sección se vuelva de color rojo cereza en ambos lados, retire la solución de TTC y reemplácela con paraformaldehído al 4% en PBS, pH 7.4, para optimizar el contraste durante la noche.
4. Cuando el contraste sea óptimo entre la tinción blanca y roja en el cerebro (1-3 días), colóquelo entre láminas de plástico transparente, seque el exceso de líquido y escanee a alta resolución.
5. Trazar las regiones isquémicas y el portaobjetos de todo el cerebro para obtener el porcentaje de infarto en cada sección como se ha descrito anteriormente¹⁷.

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Resultados

Registro e imágenes de perfusión por moteado láser: El registro de la perfusión se realizó de forma continua hasta que el animal fue transportado a la resonancia magnética y nuevamente al sacrificio (Figura 1A). Los datos mostraron que la perfusión cerebral disminuyó en ~15% a 83 ± 10% en el momento antes de la oclusión de la arteria basilar (pre-BAO). Esta disminución nominal es probablemente el resultado de la inserción de un m...

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Discusión

Las causas más comunes de accidente cerebrovascular de circulación posterior incluyen embolia, aterosclerosis de la arteria grande y enfermedad de la arteria pequeña⁵. La oclusión arterial basilar (BAO) representa un subconjunto de accidentes cerebrovasculares de circulación posterior, que conlleva una morbilidad y mortalidad significativas¹³. En este contexto, se utilizó un modelo canino de accidente cerebrovascular agudo posterior y...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)	Sigma Aldrich	T8877
EDTA K3 vacutainers	Becton Dickinson	BD455036
Eosin	Surgipath	3801602
Formalin, neutral buffered, 10%	Richard-Allan Scientific	5701
Hematoxylin 560	Surgipath	3801570
HUG-U-VAC positioning system	DRE Veterinary	1320
LabChart Software	ADInstruments Inc.
Laser Speckle Imaging camera	Perimed Inc., Jarfalla, Sweden	PeriCam PSI HR System
Lithium heparin vacutainer, 4.5%	Becton Dickinson	BD 368056
Matlab	The MathWorks, Inc., Natick, MA
OsiriX MD v.5.0 software	Pixmeo Inc, Geneva
Paraformaldehyde 4% in PBS	Alfa Aesar	AAJ61899AP
PimSoft v1.4 software	Perimed Inc.	software that accompanies LSI equipment
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet	Siemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe)	NovaPlus	402525D