Quantificação da Perfusão Cerebral por Laser Speckle Imaging e Volume de Infarto por RM em um Modelo Pré-clínico de AVC de Circulação Posterior

Resumo

Um modelo canino de AVC LVO foi utilizado para desenvolver imagens de speckle a laser para monitorar a perfusão cerebral em tempo real.  A ressonância magnética ponderada em difusão foi otimizada para obter imagens do volume do infarto utilizando um alto valor b, permitindo ADC e MRA, correlacionados com DSA no momento do AVC.  Finalmente, as reconstruções do ADC correlacionaram-se com os achados histológicos.

Resumo

Fundo: A oclusão da artéria basilar (OBA) é um subconjunto do AVC da circulação posterior que acarreta uma mortalidade de até 90%.  O padrão clínico atual para diagnosticar AVC isquêmico inclui tomografia computadorizada (TC), angiografia e perfusão por TC e ressonância magnética (RM). Faltam modelos pré-clínicos de animais grandes para refletir com precisão a doença clínica, bem como métodos para avaliar a carga de AVC e avaliar os tratamentos.

Métodos: Descrevemos um modelo canino de AVC de oclusão de grandes vasos (LVO) na circulação posterior e desenvolvemos um protocolo de imagem de manchas a laser (LSI) para monitorar as alterações de perfusão em tempo real.  Em seguida, utilizamos ressonância magnética DWI de alto valor b (b = 1800s / mm²) para aumentar a sensibilidade de detecção. Também avaliamos a capacidade da angiografia por ressonância magnética (ARM) em avaliar a oclusão arterial e correlacionar com a ADS. Finalmente, verificamos o tamanho do infarto a partir do mapeamento do coeficiente de difusão aparente (ADC) com histologia.

Resultados: A administração de tromboembolismo ocluiu a artéria basilar rastreada pela DSA (n=7).   O LSI correlacionou-se com o DSA, demonstrando uma redução na perfusão após o início do AVC que persistiu ao longo do experimento, permitindo-nos monitorar a perfusão em tempo real.  DWI com um valor b otimizado para cães ilustrou o volume sistólico e nos permitiu derivar imagens de ADC e angiografia por ressonância magnética (MRA). A ARM realizada ao final do experimento correlacionou-se com a ADS realizada após a oclusão. Finalmente, a carga sistálica na ressonância magnética correlacionou-se com a histologia.

Conclusões: Nossos estudos demonstram imagens de perfusão em tempo real usando LSI de um modelo LVO tromboembólico canino de AVC de circulação posterior, que utiliza imagens multimodais importantes no diagnóstico e tratamento de AVC isquêmico.

Introdução

A prevalência de AVC em todo o mundo é de quase 25,7 milhões, sendo a maioria isquêmica¹.  O AVC de circulação posterior é responsável por 20% de todos os AVCs, sendo a oclusão da artéria basilar a mais grave, aproximando-se de 90% de mortalidade ^1,2.  Em 1995, o ativador de plasminogênio tecidual recombinante (rtPA) foi a primeira terapia aguda desenvolvida para AVC isquêmico em pacientes que se apresentaram dentro de 3 horas após o início do AVC³. Mais recentemente, a trombectomia mecânica demonstrou benefício no tratamento do AVC isquêmico agudo em pacientes que apresentam oclusão de grandes vasos (VE), que inclui a porção intracraniana da artéria carótida interna ou o primeiro segmento das artérias cerebrais anterior e média⁴.  Nenhum dos ensaios clínicos recentes incluiu AVC de circulação posterior e seus resultados permanecem sombrios, apesar de utilizarem trombectomia mecânica para oclusão da artéria basilar ^5,6.

Os avanços nas técnicas de avaliação em pacientes com AVC têm impacto na previsão da chance de recuperação funcional e sobrevida⁷. Modelos pré-clínicos de AVC de circulação posterior foram descritos anteriormente ^8,9,10, no entanto, a avaliação da carga de AVC e da revascularização permanece abaixo do ideal.  Espécies menores, como roedores, oferecem várias vantagens, incluindo facilidade de manipulação genética, compra barata de animais e baixos custos de habitação por dia^11,12. No entanto, experimentos com pequenos animais às vezes não representam totalmente a vasculatura de grandes animais e humanos, condições fisiológicas ou respostas inflamatórias relacionadas⁷. Animais grandes imitam mais de perto o derrame humano 2,7,13,14.  Além disso, amostras de sangue seriadas podem ser realizadas para análise de sangue de marcadores trombóticos e inflamatórios.

Neste estudo, descrevemos um modelo canino de oclusão da artéria basilar verificado por angiografia por subtração digital (DSA) desde o início do AVC.  Utilizamos imagens de perfusão a laser (LSI) para monitorar a perfusão em tempo real.  Em seguida, utilizamos um novo algoritmo de aprimoramento microvascular baseado na aquisição de imagens de perfusão de manchas a laser (LSI), bem como uma técnica de ressonância magnética (MRI) de alto valor b para otimizar a imagem do infarto¹⁵. Essas técnicas nos permitem monitorar e quantificar a isquemia local e global. Finalmente, correlacionamos esses achados de imagem com a histologia. Compreender o prognóstico e a necessidade de estudar o AVC da circulação posterior em modelos pré-clínicos é fundamental para melhorar as terapias.

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Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a Lei de Bem-Estar Animal e o Guia para Cuidados e Uso de Animais de Laboratório (NRC 2011), conforme aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Ohio State University (IACUC).

1. Etapa 1: Preparo do Animal e Protocolo Cirúrgico Um modelo canino de AVC de oclusão da artéria basilar (BAO) foi utilizado conforme descrito anteriormente ^9,10.

1. Beagles adultos rápidos (8-13 kg, 14-21 meses) durante a noite com acesso gratuito à água.
2. Injetar, pré-anestésico, uma administração intramuscular de acepromazina (0,2 mg/kg)
3. Introduza um cateter de calibre 20 em uma veia cefálica.
4. Induzir anestesia com administração intravenosa de cetamina (10 mg/kg) e midazolam (0,025 mg/kg).
5. Após a indução anestésica, intubar os cães e ventilar mecanicamente com anestesia inalatória constante (isoflurano a 2-3%).
6. Crie uma janela de craniotomia^{de 1 cm 2} para imagens de manchas a laser.
7. Introduza uma bainha arterial 7F na artéria femoral direita para acesso e medição da pressão arterial.
8. Introduza um angiocateter de calibre 16 na veia femoral direita para coleta de sangue.
9. Prepare tromboembolia (coágulo sanguíneo) conforme descrito anteriormente¹⁶. Resumidamente, retire e misture 5 mL de sangue total canino com 0,5 g de sulfato de bário (Ba₂SO₄) em um tubo plástico de coleta de sangue de soro enquanto rola por 30 segundos. Descanse a mistura sem perturbações por 60 minutos em temperatura ambiente antes da administração do cateter.
10. Comece a registrar a angiografia por subtração digital (DSA) basal antes de acessar a artéria basilar média. Avance um cateter-guia 4F sob orientação fluoroscópica, usando uma abordagem trans-aórtica retrógrada, na bainha arterial 7F previamente colocada na artéria femoral direita através de uma artéria vertebral até a base da artéria basilar. Injete dois mililitros de agente de contraste com solução salina normal para identificar a artéria basilar.
11. Usando um bisturi cirúrgico, ressece o coágulo em pequenos pedaços com camadas ricas em fibrina e eritrócitos¹⁶ para carregar em uma seringa de 3 mL e injetar através do microcateter no meio da artéria basilar. Deixe o coágulo estabilizar por 10 minutos. Realize uma angiografia de acompanhamento para verificar a localização desejada do coágulo. A oclusão arterial pode ser verificada por DSA e a diminuição da perfusão cerebral por laser speckle imaging (LSI).

2. Etapa 2: Imagem de manchas a laser

1. Foque a câmera de imagem de perfusão de manchas a laser (LSI) na janela craniana. Configure o sistema de câmera de imagem de manchas a laser (LSI) de alta resolução conforme descrito anteriormente¹⁵.
2. Registre a perfusão com interrupções durante a realização da angiografia nos momentos desejados. Adquira dados de um campo de visão de 1,5 cm x 1,5 cm usando um comprimento de onda de 785 nm e lasers de 80 mW com uma taxa de amostragem de 60 Hz a uma distância de trabalho de 10 cm neste modelo canino.
3. Nos gráficos de perfusão em tempo real, escolha o tempo de interesse (TOI) para incluir picos mais baixos apenas para excluir os artefatos relacionados ao movimento respiratório. Unidades médias de perfusão relativa durante um período de amostragem de 10 s usando o software PimSoft v1.4. Realize a análise de contraste de manchas a laser (LASCA) conforme descrito anteriormente¹⁵.
4. Para otimizar a quantificação da microvasculatura cerebral neste modelo canino, grave imagens a 15 quadros por segundo e realize cálculos de intensidade e variância com média espaço-temporal em uma área de 5 x 5 pixels com 5 quadros. A taxa de quadros geral para os dados de intensidade e variância foi de 3 quadros por segundo. Escolha o valor médio de perfusão para cada pixel para reduzir os efeitos na média de grandes mudanças repentinas nas leituras de perfusão devido ao movimento da respiração canina. Converta dados brutos em arquivos binários e processe os dados em imagens significativas da vasculatura. Utilize o algoritmo LASCA reformulado pelo programa (rt-LASCA) para usar a variância dos dados de contraste ao longo do tempo para determinar as localizações da vasculatura conforme descrito anteriormente¹⁵.

3. Etapa 3: Ressonância Magnética (MRI) e Angiografia por Ressonância Magnética

1. Realize a ressonância magnética no dia anterior à cirurgia para comparação, se desejar, depois repita para confirmar o BAO e novamente antes do sacrifício, se uma terapêutica for avaliada.
2. Coloque os caninos continuamente anestesiados com a cabeça em decúbito dorsal em decúbito dorsal, conforme descrito anteriormente em um scanner de ressonância magnética Siemens Prisma 3 Tesla de força de campo e furo de 60 cm de diâmetro, incluindo uma bobina de cabeça de 32 canais como receptor com desempenho aprimorado de imagem paralela para obter imagens cerebrais¹⁷.
3. Realize varreduras de localização para adquirir imagens piloto de cada cérebro canino antes do início da imagem anatômica.  O sistema utilizado para obter os dados apresentados possui um sistema de imagem integrado que permite uma varredura mais rápida em resoluções espaciais e temporais ideais. Os gradientes de 80 mT/m geram imagens ponderadas em T2, ponderadas em difusão e angiografias por RM de alta qualidade. A imagem ponderada em difusão (DWI) é sensível o suficiente e pode mostrar mais subestrutura anatômica do que pelos métodos convencionais de ressonância magnética estrutural, como imagens ponderadas em T2. Neste estudo, a RM foi realizada 4h após a OAB.
4. Após a localização adequada, realize a imagem de eco gradiente ponderada em T2 (Parâmetros: FOV = 130 mm, Tamanho da matriz = 320 x 320, Tamanho do pixel = 0,3 x 0,3 mm, Espessura do corte = 3 mm, TR = 4s, FA = 180 graus, BW = 255 Hz/pixel, NEX = 2, TE = 75ms, Resolução = 2,4615 pixels por mm) seguido por uma imagem de recuperação de inversão atenuada por fluxo (FLAIR) para visualizar a estrutura da anatomia cerebral.
5. Realize angiografia por ressonância magnética (ARM) para visualizar a anatomia vascular e a medição da circulação sanguínea. Adquira MRA do cérebro cobrindo a cabeça e o pescoço com uma sequência 3D de tempo de voo (TOF) em vista transversal (Parâmetros: FOV = 129x129 mm, Tamanho da matriz = 768 x 768, tamanho do pixel = 0,3 x 0,3 mm, espessura do corte = 81,59 mm, TR = 25 ms, FA = 18 graus, BW = 185 Hz / pixel, NEX = 1, TE = 4,22 ms, Resolução = 5,91 pixels por mm). Realize projeção de intensidade máxima (MIP) com visualização 3D codificada por cores para maximizar a intensidade do sinal nos vasos sanguíneos.  O pós-processo adquiriu imagens DICOM para visualizar os vasos sanguíneos e confirmar que a artéria basilar estava ocluída.

4. Etapa 4: Imagem ponderada por difusão e cálculo do volume sistólico

1. Realize a sequência de imagem ponderada por difusão para detectar AVCs isquêmicos agudos (Parâmetros: FOV = 149 mm x 149 mm, Tamanho da matriz = 132 x0x0x 100, tamanho do pixel = 0,30 mm x 0,30 mm, espessura do corte = 4 mm, TR = 4,6s, FA = 90 graus, BW = 255 Hz/pixel, NEX = 1, TE = 86ms, Resolução = 0,93 pixels por mm). Transfira imagens DICOM para pós-processamento.
2. Gere mapas de difusão aparente (ADC) a partir de imagens DWI e calcule volumes de infarto usando o software OsiriX MD v.5.0.
3. Trace os hemisférios cerebrais e as áreas de infarto por fatia e multiplique pela espessura da fatia para adquirir volumes de infarto.
4. Converta o volume total absoluto em 100 unidades para calcular a porcentagem do volume sistólico de cada canino.

5. Etapa 5: histologia cerebral da coloração de hematoxilina e eosina

1. No momento do sacrifício em canino anestesiado, colha o cérebro e corte duas seções mediais de 4 mm de espessura com um bisturi afiado, uma seção será usada para coloração TTC abaixo.
2. Fixe a seção de 4 mm em formalina a 10% por um mínimo de 7 dias para permitir a infiltração em toda a seção.
3. Incorpore a seção cerebral fixa em parafina seguindo nosso protocolo¹⁷.
4. Apare e nivele cada bloco de parafina (vários blocos podem ser armazenados e processados ao mesmo tempo).
5. Corte cada bloco de parafina a 4μm e coloque o tecido cortado em uma lâmina de 2 "x 3" polegadas.
6. Processe cada lâmina em Hematoxilina 560 por 8 min, diferencie com álcool ácido a 1% por 1s três vezes com enxágue em água da torneira.
7. Azul cada lâmina com hidróxido de amônio a 1% por 1s e enxágue por 2s com água da torneira.
8. Desidratar em etanol a 70% por 1s doze vezes, contracorado em eosina por 1 min.
9. Desidratar em 95% por 1s doze vezes seguido de etanol 100%.
10. Limpe em xileno e aplique uma lamínula de 2" x 3" polegadas com mídia de montagem, removendo bolhas de ar.

6. Etapa 6 2% 2,3,5-trifeniltetrazólio cloreto de coloração cerebral

1. Colocar a segunda secção de 4 mm que foi colhida ao lado da secção H&E numa solução previamente preparada contendo 100 ml de cloreto de 2,3,5-trifenil-2H-tetrazólio (TTC) a 2% em pH 7,4 PBS aquecido a 37 °C no escuro.
2. Incube no escuro a 37 °C por pelo menos 20 min, virando a seção cerebral suavemente a cada 5 minutos.
3. Quando a seção ficar vermelha cereja em ambos os lados, remova a solução de TTC e substitua por paraformaldeído a 4% em PBS, pH 7,4, para otimizar o contraste durante a noite.
4. Quando o contraste for ideal entre as colorações brancas e vermelhas no cérebro (1-3 dias), coloque entre folhas de plástico transparente, seque o excesso de líquido e digitalize em alta resolução.
5. Trace as regiões isquêmicas e a lâmina de todo o cérebro para obter a porcentagem de infarto em cada seção, conforme descrito anteriormente¹⁷.

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Resultados

Gravação e imagem de perfusão de manchas a laser: O registro da perfusão foi realizado continuamente até que o animal fosse transportado para a RM e novamente no sacrifício (Figura 1A). Os dados mostraram que a perfusão cerebral diminuiu ~ 15% para 83 ± 10% no momento anterior à oclusão da artéria basilar (pré-BAO). Esse declínio nominal é provavelmente o resultado da inserção de um microcateter na artéria vertebral distal. ...

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Discussão

As causas mais comuns de acidente vascular cerebral da circulação posterior incluem embolia, aterosclerose de grandes artérias e doença arterial pequena⁵. A oclusão arterial basilar (OBA) representa um subconjunto de AVCs da circulação posterior, com morbidade e mortalidade^{significativas13}. Nesse contexto, foi utilizado um modelo canino de AVC posterior agudo e desenvolvemos um protocolo LSI para monitorar a perfusão da região oclu...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)	Sigma Aldrich	T8877
EDTA K3 vacutainers	Becton Dickinson	BD455036
Eosin	Surgipath	3801602
Formalin, neutral buffered, 10%	Richard-Allan Scientific	5701
Hematoxylin 560	Surgipath	3801570
HUG-U-VAC positioning system	DRE Veterinary	1320
LabChart Software	ADInstruments Inc.
Laser Speckle Imaging camera	Perimed Inc., Jarfalla, Sweden	PeriCam PSI HR System
Lithium heparin vacutainer, 4.5%	Becton Dickinson	BD 368056
Matlab	The MathWorks, Inc., Natick, MA
OsiriX MD v.5.0 software	Pixmeo Inc, Geneva
Paraformaldehyde 4% in PBS	Alfa Aesar	AAJ61899AP
PimSoft v1.4 software	Perimed Inc.	software that accompanies LSI equipment
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet	Siemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe)	NovaPlus	402525D