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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Ein Hundemodell des LVO-Schlaganfalls wurde verwendet, um eine Laser-Speckle-Bildgebung zur Überwachung der zerebralen Perfusion in Echtzeit zu entwickeln.  Die diffusionsgewichtete MRT wurde optimiert, um das Infarktvolumen unter Verwendung eines hohen b-Werts abzubilden, was ADC und MRA ermöglichte, die zum Zeitpunkt des Schlaganfalls mit der DSA korrelierten.  Schließlich korrelierten die ADC-Rekonstruktionen mit den histologischen Befunden.

Zusammenfassung

Hintergrund: Der Verschluss der Arteria basilaris (BAO) ist eine Untergruppe des posterioren Zirkulationsschlaganfalls, die eine Mortalität von bis zu 90 % aufweist.  Zu den aktuellen klinischen Standards zur Diagnose eines ischämischen Schlaganfalls gehören die Computertomographie (CT), die CT-Angiographie sowie die Perfusion sowie die Magnetresonanztomographie (MRT). Es fehlen präklinische Großtiermodelle, um die klinische Erkrankung genau abzubilden, sowie Methoden zur Beurteilung der Schlaganfallbelastung und zur Bewertung von Behandlungen.

Methodik: Wir beschreiben ein Hundemodell für einen Schlaganfall durch einen Verschluss großer Gefäße (LVO) im posterioren Kreislauf und haben ein Laser Speckle Imaging (LSI)-Protokoll entwickelt, um Perfusionsänderungen in Echtzeit zu überwachen.  Anschließend verwendeten wir eine MRT mit hohem b-Wert DWI (b=1800s/mm2), um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Wir untersuchten auch die Fähigkeit der Magnetresonanzangiographie (MRA), den arteriellen Verschluss zu beurteilen und mit DSA zu korrelieren. Schließlich haben wir die Infarktgröße anhand der Kartierung des scheinbaren Diffusionskoeffizienten (ADC) mit der Histologie verifiziert.

Befund: Die Verabreichung von Thromboembolien verschloss die Arteria basilaris, wie durch DSA verfolgt (n=7).   LSI korrelierte mit DSA und zeigte eine Verringerung der Perfusion nach Schlaganfallbeginn, die während des gesamten Experiments anhielt und es uns ermöglichte, die Perfusion in Echtzeit zu überwachen.  DWI mit einem optimierten b-Wert für Hunde veranschaulichte das Schlagvolumen und ermöglichte es uns, ADC- und Magnetresonanzangiographie (MRA)-Bilder abzuleiten. Die MRA, die am Ende des Experiments durchgeführt wurde, korrelierte mit der DSA, die nach der Okklusion durchgeführt wurde. Schließlich korrelierte die Schlaganfallbelastung in der MRT mit der Histologie.

Schlüsse: Unsere Studien zeigen die Echtzeit-Perfusionsbildgebung mittels LSI eines thromboembolischen LVO-Modells des posterioren Kreislaufschlaganfalls, das eine multimodale Bildgebung verwendet, die für die Diagnose und Behandlung eines ischämischen Schlaganfalls wichtig ist.

Einleitung

Die Prävalenz von Schlaganfällen liegt weltweit bei fast 25,7 Millionen, von denen die meisten ischämisch sind1.  Der posteriore Zirkulationsschlag macht 20 % aller Schlaganfälle aus, wobei der Verschluss der Arteria basilaris mit einer Mortalität von fast 90 % am schwerwiegendsten ist 1,2.  Im Jahr 1995 war der rekombinante Gewebeplasminogenaktivator (rtPA) die erste Akuttherapie, die für ischämische Schlaganfälle bei Patienten entwickelt wurde, die sich innerhalb von 3 Stunden nach Schlaganfallbeginn vorstellten3. In jüngerer Zeit hat sich die mechanische Thrombektomie bei der Behandlung eines akuten ischämischen Schlaganfalls bei Patienten mit einem Verschluss großer Gefäße (LVO) gezeigt, der den intrakraniellen Teil der Arteria carotis interna oder das erste Segment der vorderen und mittleren Hirnarterien umfasst4.  Keine der jüngsten klinischen Studien umfasste einen Schlaganfall im hinteren Kreislauf, und seine Ergebnisse bleiben trotz mechanischer Thrombektomie bei einem Verschluss der Arteria basilaris düster 5,6.

Fortschritte bei den Beurteilungstechniken bei Schlaganfallpatienten haben einen Einfluss auf die Vorhersage der Chance auf funktionelle Erholung und Überleben7. Präklinische Modelle des Schlaganfalls im hinteren Kreislauf wurden bereits beschrieben 8,9,10, die Beurteilung der Schlaganfallbelastung und der Revaskularisation sind jedoch nach wie vor suboptimal.  Kleinere Arten wie Nagetiere bieten mehrere Vorteile, darunter eine einfache genetische Manipulation, einen günstigen Tierkauf und niedrige Haltungskostenpro Tag 11,12. Kleintierversuche repräsentieren jedoch manchmal große Gefäße von Tieren und Menschen, physiologische Zustände oder damit verbundene Entzündungsreaktionen nicht vollständig7. Große Tiere ahmen den menschlichen Schlaganfall besser nach 2,7,13,14.  Darüber hinaus kann eine serielle Blutentnahme zur Blutanalyse von thrombotischen und entzündlichen Markern durchgeführt werden.

In dieser Studie beschreiben wir ein Hundemodell des Verschlusses der Arteria basilaris, das durch digitale Subtraktionsangiographie (DSA) ab Beginn des Schlaganfalls verifiziert wurde.  Wir verwenden Laser Speckle Perfusion Imaging (LSI), um die Perfusion in Echtzeit zu überwachen.  Anschließend verwenden wir einen neuartigen mikrovaskulären Enhancement-Algorithmus, der auf der Erfassung von Laser-Speckle-Perfusionsbildgebung (LSI) basiert, sowie eine Hoch-B-Wert-Magnetresonanztomographie (MRT)-Technik, um die Infarktbildgebungzu optimieren 15. Diese Techniken ermöglichen es uns, lokale und globale Ischämie zu überwachen und zu quantifizieren. Schließlich korrelieren wir diese bildgebenden Befunde mit der Histologie. Das Verständnis der Prognose und der Notwendigkeit, den Schlaganfall im hinteren Kreislauf in präklinischen Modellen zu untersuchen, ist entscheidend, um die Therapien zu verbessern.

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Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Animal Welfare Act und dem Guide for Care and Use of Laboratory Animals (NRC 2011) durchgeführt, der vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der Ohio State University genehmigt wurde.

1. Schritt 1: Vorbereitung des Tieres und chirurgisches Protokoll Wie zuvor beschrieben wurde ein Hundemodell für einen Schlaganfall der Basilararterie (BAO) verwendet 9,10.

  1. Schnelle erwachsene Beagles (8-13 kg, 14-21 Monate alt) über Nacht mit freiem Zugang zum Wasser.
  2. Injizieren Sie vor der Anästhesie eine intramuskuläre Verabreichung von Acepromazin (0,2 mg/kg)
  3. Führen Sie einen 20-Gauge-Katheter in eine Kopfvene ein.
  4. Induzieren Sie eine Anästhesie mit intravenöser Verabreichung von Ketamin (10 mg/kg) und Midazolam (0,025 mg/kg).
  5. Nach der Narkoseeinleitung den Hund intubieren und unter ständiger Inhalationsanästhesie (2-3 % Isofluran) mechanisch beatmet.
  6. Erstellen Sie ein 1 cm2 Kraniotomiefenster für die Laser-Speckle-Bildgebung.
  7. Führen Sie eine arterielle Schleuse 7F in die rechte Oberschenkelarterie ein, um Zugang zu erhalten und den Blutdruck zu messen.
  8. Führen Sie einen 16-Gauge-Angiokatheter in die rechte Oberschenkelvene ein, um Blut abzunehmen.
  9. Bereiten Sie den Thromboembolus (Blutgerinnsel) wie zuvor beschriebenvor 16. Ziehen und mischen Sie kurz 5 ml Vollblut von Hunden mit 0,5 g Bariumsulfat (Ba2SO4) in einem Kunststoff-Serumblutentnahmeröhrchen, während Sie 30 Sekunden lang rollen. Lassen Sie die Mischung vor der Katheterverabreichung 60 Minuten lang ungestört bei Raumtemperatur ruhen.
  10. Beginnen Sie mit der Aufzeichnung der digitalen Subtraktionsangiographie (DSA) der Grundlinie, bevor Sie auf die mittlere Basilararterie zugreifen. Schieben Sie einen 4F-Führungskatheter unter fluoroskopischer Kontrolle unter Verwendung eines retrograden transaortalen Zugangs in die Arterienscheide 7F vor, die zuvor in die rechte Oberschenkelarterie durch eine Wirbelarterie bis zur Basis der Arteria basilaris eingeführt wurde. Injizieren Sie zwei Milliliter Kontrastmittel mit normaler Kochsalzlösung, um die Arteria basilaris zu identifizieren.
  11. Mit einem chirurgischen Skalpell wird das Gerinnsel in kleine Stücke mit sowohl fibrinreichen als auch erythrozytenreichen Schichten16 reseziert, um es in eine 3-ml-Spritze zu laden und durch den Mikrokatheter in die Mitte der Arteria basilaris zu injizieren. Lassen Sie das Gerinnsel 10 Minuten lang stabilisieren. Führen Sie ein Follow-up-Angiogramm durch, um die gewünschte Position des Gerinnsels zu überprüfen. Ein arterieller Verschluss kann durch DSA und eine abnehmende zerebrale Perfusion durch Laser Speckle Imaging (LSI) nachgewiesen werden.

2. Schritt 2 Laser Speckle Imaging

  1. Fokussieren Sie die LSI-Kamera (Laser Speckle Perfusion Imaging) auf das Schädelfenster. Konfigurieren Sie das hochauflösende Laser-Speckle-Imaging-Kamerasystem (LSI) wie zuvor beschrieben15.
  2. Aufzeichnung der Perfusion mit Unterbrechungen während der Durchführung des Angiogramms zu den gewünschten Zeitpunkten. Erfassen Sie Daten aus einem Sichtfeld von 1,5 cm x 1,5 cm mit einer Wellenlänge von 785 nm und 80 mW Lasern mit einer Abtastrate von 60 Hz bei einem Arbeitsabstand von 10 cm in diesem Hundemodell.
  3. Wählen Sie in den Echtzeit-Perfusionsdiagrammen den Time-of-Interest (TOI) aus, um nur niedrigere Peaks einzubeziehen und die Artefakte im Zusammenhang mit der Atembewegung auszuschließen. Durchschnittliche relative Perfusionseinheiten über einen Probenahmezeitraum von 10 s mit der Software PimSoft v1.4. Führen Sie die Laser-Speckle-Kontrastanalyse (LASCA) durch, wie zuvor beschrieben15.
  4. Um die Quantifizierung der Mikrovaskulatur des Gehirns in diesem Hundemodell zu optimieren, nehmen Sie Bilder mit 15 Bildern pro Sekunde auf und führen Sie Intensitäts- und Varianzberechnungen mit raumzeitlicher Mittelung über einen Bereich von 5 x 5 Pixeln mit 5 Bildern durch. Die Gesamtbildrate für die Intensitäts- und Varianzdaten betrug 3 Bilder pro Sekunde. Wählen Sie den Medianwert der Perfusion für jedes Pixel, um die Auswirkungen großer plötzlicher Änderungen der Perfusionsmesswerte aufgrund der Bewegung der Hundeatmung auf den Mittelwert zu reduzieren. Konvertieren Sie Rohdaten in Binärdateien und verarbeiten Sie die Daten zu einer aussagekräftigen Abbildung des Gefäßsystems. Verwenden Sie den programmumgerüsteten LASCA-Algorithmus (rt-LASCA), um die Varianz der Kontrastdaten im Laufe der Zeit zu verwenden, um die Positionen des Gefäßsystems zu bestimmen, wie zuvor beschrieben15.

3. Schritt 3 Magnetresonanztomographie (MRT) und Magnetresonanzangiographie

  1. Führen Sie die MRT am Tag vor der Operation durch, um sie zu vergleichen, falls gewünscht, und wiederholen Sie sie dann, um die BAO zu bestätigen, und erneut vor der Opferung, wenn ein Therapeutikum evaluiert werden soll.
  2. Platzieren Sie kontinuierlich anästhesierte Eckzähne kopfüber in Rückenlage, wie zuvor in einem Siemens Prisma 3 Tesla-MRT-Scanner mit Feldstärke und 60 cm Durchmesser beschrieben, einschließlich einer 32-Kanal-Kopfspule als Empfänger mit verbesserter paralleler Bildgebungsleistung, um Gehirnbilder zu erhalten17.
  3. Führen Sie Lokalisierungsscans durch, um Pilotenbilder von jedem Hundegehirn zu erhalten, bevor die anatomische Bildgebung beginnt.  Das System, das zur Gewinnung der präsentierten Daten verwendet wird, verfügt über ein integriertes Bildgebungssystem, das ein schnelleres Scannen in optimaler räumlicher und zeitlicher Auflösung ermöglicht. Die 80 mT/m Gradienten erzeugen qualitativ hochwertige T2-gewichtete, diffusionsgewichtete Bilder und MR-Angiogramme. Die diffusionsgewichtete Bildgebung (DWI) ist empfindlich genug und kann mehr anatomische Unterstruktur aufweisen als herkömmliche strukturelle MRT-Methoden, wie z. B. T2-gewichtete Bilder. In dieser Studie wurde die MRT 4 Stunden nach der BAO durchgeführt.
  4. Nach korrekter Lokalisierung führen Sie eine T2-gewichtete Gradientenecho-Bildgebung durch (Parameter: FOV = 130 mm, Matrixgröße = 320 x 320, Pixelgröße = 0,3 x 0,3 mm, Schichtdicke = 3 mm, TR= 4s, FA= 180 Grad, BW = 255 Hz/Pixel, NEX= 2, TE=75ms, Auflösung = 2,4615 Pixel pro mm), gefolgt von einer FLAIR-Bildgebung (Flow Absorbated Inversion Recovery), um die Struktur der Gehirnanatomie zu visualisieren.
  5. Führen Sie eine Magnetresonanzangiographie (MRA) durch, um die Gefäßanatomie und die Durchblutungsmessung zu visualisieren. Erfassen Sie die MRA des Gehirns, das den Kopf und Hals bedeckt, mit einer Time-of-Flight-3D (TOF)-Sequenz in Queransicht (Parameter: FOV = 129x129 mm, Matrixgröße = 768 x 768, Pixelgröße = 0,3 x 0,3 mm, Schichtdicke = 81,59 mm, TR= 25 ms, FA= 18 Grad, SW = 185 Hz/Pixel, NEX= 1, TE=4,22 ms, Auflösung = 5,91 Pixel pro mm). Führen Sie eine maximale Intensitätsprojektion (MIP) mit farbcodierter 3D-Visualisierung durch, um die Signalintensität in den Blutgefäßen zu maximieren.  Post-Process aufgenommene DICOM-Bilder, um die Blutgefäße sichtbar zu machen und zu bestätigen, dass die Arteria basilaris verschlossen war.

4. Schritt 4 Diffusionsgewichtete Bildgebung und Berechnung des Schlagvolumens

  1. Durchführung einer diffusionsgewichteten Bildgebungssequenz zur Erkennung akuter ischämischer Schlaganfälle (Parameter: FOV = 149 mm x 149 mm, Matrixgröße = 132 x0x0x 100, Pixelgröße = 0,30 mm x 0,30 mm, Schichtdicke = 4 mm, TR = 4,6 s, FA = 90 Grad, SW = 255 Hz/Pixel, NEX= 1, TE = 86 ms, Auflösung = 0,93 Pixel pro mm). Übertragen Sie DICOM-Bilder zur Nachbearbeitung.
  2. Generieren Sie scheinbare Diffusionskarten (ADC) aus DWI-Bildern und berechnen Sie Infarktvolumina mit der Software OsiriX MD v.5.0.
  3. Verfolgen Sie sowohl die Gehirnhälften als auch die Infarktbereiche pro Schicht und multiplizieren Sie sie mit der Schichtdicke, um das Infarktvolumen zu erhalten.
  4. Rechnen Sie das absolute Gesamtvolumen in 100 Einheiten um, um das prozentuale Schlagvolumen jedes Eckzahns zu berechnen.

5. Schritt 5: Histologie der Hämatoxylin- und Eosin-Färbung des Gehirns

  1. Zum Zeitpunkt der Tötung bei einem anästhesierten Eckzahn entnehmen Sie das Gehirn und schneiden Sie mit einem scharfen Skalpell zwei 4 mm dicke mediale Abschnitte, ein Abschnitt wird unten für die TTC-Färbung verwendet.
  2. Fixieren Sie den 4-mm-Abschnitt mindestens 7 Tage lang in 10 % Formalin, um eine Infiltration im gesamten Abschnitt zu ermöglichen.
  3. Betten Sie den fixierten Hirnabschnitt in Paraffin ein, gemäß unserem Protokoll17.
  4. Trimmen und nivellieren Sie jeden Paraffinblock (mehrere Blöcke können gleichzeitig gelagert und verarbeitet werden).
  5. Schneiden Sie jeden Paraffinblock bei 4 μm und legen Sie das geschnittene Gewebe auf einen 2" x 3" großen Objektträger.
  6. Jeden Objektträger 8 min lang in Hämatoxylin 560 verarbeiten, dreimal mit 1% saurem Alkohol für 1s differenzieren und in Leitungswasser spülen.
  7. Jede Schiene 1s lang mit 1% Ammoniumhydroxid blau machen und 2s mit Leitungswasser spülen.
  8. Zwölfmal in 70% Ethanol für 1s dehydrieren, 1 min in Eosin gegenfärben.
  9. Dehydrieren Sie zwölfmal in 95% für 1s, gefolgt von 100% Ethanol.
  10. In Xylol eincremen und ein 2" x 3" Zoll-Deckglas mit Eindeckmedium auftragen, um Luftblasen zu entfernen.

6. Schritt 6: 2 % 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid-Färbung des Gehirns

  1. Der zweite 4-mm-Abschnitt, der neben dem H&E-Schnitt geerntet wurde, wird in eine zuvor vorbereitete Lösung gegeben, die mit 100 mL 2 % 2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazoliumchlorid (TTC) bei einem pH-Wert von 7,4 PBS enthält und im Dunkeln auf 37 °C erwärmt wird.
  2. Inkubieren Sie im Dunkeln bei 37 °C für mindestens 20 Minuten, wobei Sie den Gehirnteil alle 5 Minuten vorsichtig umdrehen.
  3. Wenn sich der Abschnitt auf beiden Seiten kirschrot verfärbt, entfernen Sie die TTC-Lösung und ersetzen Sie sie durch 4 % Paraformaldehyd in PBS, pH 7,4, um den Kontrast über Nacht zu optimieren.
  4. Wenn der Kontrast zwischen weißer und roter Färbung im Gehirn optimal ist (1-3 Tage), zwischen durchsichtige Plastikfolien legen, überschüssige Flüssigkeit trocknen und mit hoher Auflösung scannen.
  5. Verfolgen Sie die ischämischen Regionen und den gesamten Hirnschnitt, um in jedem Abschnitt einen prozentualen Infarkt zu erhalten, wie zuvor beschrieben17.

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Ergebnisse

Laser-Speckle-Perfusionsaufzeichnung und Bildgebung: Die Perfusionsaufzeichnung wurde kontinuierlich durchgeführt, bis das Tier zum MRT transportiert wurde, und erneut bei der Tötung (Abbildung 1A). Die Daten zeigten, dass die zerebrale Perfusion zum Zeitpunkt vor dem Verschluss der Arteria basilaris (vor BAO) um ~15% auf 83 ± 10% abnahm. Dieser nominelle Rückgang ist wahrscheinlich die Folge einer Mikrokathetereinführung in die distale...

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Diskussion

Zu den häufigsten Ursachen für einen Schlaganfall im hinteren Kreislauf gehören Embolie, Atherosklerose der großen Arterien und Erkrankungen der kleinen Arterien5. Der basiläre arterielle Verschluss (BAO) stellt eine Untergruppe der posterioren Zirkulationsschlaganfälle dar, die eine signifikante Morbidität und Mortalität mit sich bringen13. In diesem Zusammenhang wurde ein Hundemodell des akuten posterioren Schlaganfalls verwendet ...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen

Danksagungen

Diese Arbeit wurde teilweise durch das Stipendium der Mayfield Education and Research Foundation #GRT00049047 und den Accelerator Award des Ohio Department of Services Agency #TECG20180269 an SMN unterstützt.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)Sigma AldrichT8877
EDTA K3 vacutainersBecton DickinsonBD455036
EosinSurgipath3801602
Formalin, neutral buffered, 10%Richard-Allan Scientific5701
Hematoxylin 560Surgipath3801570
HUG-U-VAC positioning system  DRE Veterinary1320
LabChart SoftwareADInstruments Inc.
Laser Speckle Imaging cameraPerimed Inc., Jarfalla, SwedenPeriCam PSI HR System
Lithium heparin vacutainer, 4.5%Becton DickinsonBD 368056
MatlabThe MathWorks, Inc., Natick, MA
OsiriX MD v.5.0 softwarePixmeo Inc, Geneva
Paraformaldehyde 4% in PBSAlfa AesarAAJ61899AP
PimSoft v1.4 softwarePerimed Inc.software that accompanies LSI equipment
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnetSiemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe)NovaPlus402525D

Referenzen

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