Quantification de la perfusion cérébrale à l’aide de l’imagerie par chatoiement laser et du volume de l’infarctus à l’aide de l’IRM dans un modèle préclinique d’AVC de circulation postérieure

Résumé

Un modèle canin d’AVC LVO a été utilisé pour développer l’imagerie laser du chatoiement afin de surveiller la perfusion cérébrale en temps réel.  L’IRM pondérée en diffusion a été optimisée pour imager le volume de l’infarctus en utilisant une valeur b élevée, permettant l’ADC et l’ARM, corrélés avec l’ASD au moment de l’AVC.  Enfin, les reconstructions de l’ADC étaient corrélées avec les résultats histologiques.

Résumé

Arrière-plan: L’occlusion de l’artère basilaire (BAO) est un sous-ensemble de l’AVC de la circulation postérieure qui entraîne une mortalité pouvant atteindre 90 %.  La norme clinique actuelle pour diagnostiquer l’AVC ischémique comprend la tomodensitométrie (TDM), l’angiographie par TDM et l’imagerie de perfusion et de résonance magnétique (IRM). Il n’existe pas de modèles précliniques sur de grands animaux pour refléter avec précision la maladie clinique, ni de méthodes permettant d’évaluer le fardeau de l’AVC et d’évaluer les traitements.

Méthode: Nous décrivons un modèle canin d’AVC d’occlusion des gros vaisseaux (LVO) dans la circulation postérieure, et développons un protocole d’imagerie laser du chatoiement (LSI) pour surveiller les changements de perfusion en temps réel.  Nous avons ensuite utilisé l’IRM DWI à valeur b élevée (b = 1800 s/mm²) pour augmenter la sensibilité de détection. Nous avons également évalué la capacité de l’angiographie par résonance magnétique (ARM) à évaluer l’occlusion artérielle et à établir une corrélation avec l’ASD. Enfin, nous avons vérifié la taille de l’infarctus à partir de la cartographie du coefficient de diffusion apparent (ADC) avec l’histologie.

Résultats: L’administration d’une thromboembolie a obstrué l’artère basilaire comme l’a suivi l’ASD (n = 7).   La LSI est corrélée avec la DSA, démontrant une réduction de la perfusion après le début de l’AVC qui a persisté tout au long de l’expérience, ce qui nous a permis de surveiller la perfusion en temps réel.  La DWI avec une valeur b optimisée pour les chiens a illustré le volume systolique et nous a permis de dériver des images ADC et d’angiographie par résonance magnétique (ARM). L’ARM réalisée à la fin de l’expérience était corrélée avec l’ARM réalisée après l’occlusion. Enfin, le fardeau de l’AVC à l’IRM était corrélé à l’histologie.

Conclusions: Nos études démontrent l’imagerie de perfusion en temps réel à l’aide de l’LSI d’un modèle LVO thromboembolique canin d’un AVC de circulation postérieure, qui utilise l’imagerie multimodale importante dans le diagnostic et le traitement de l’AVC ischémique.

Introduction

La prévalence des accidents vasculaires cérébraux dans le monde est de près de 25,7 millions, dont la majorité sont ischémiques¹.  L’AVC de la circulation postérieure représente 20 % de tous les AVC, dont l’occlusion de l’artère basilaire est la plus grave, approchant les 90 % de mortalité ^1,2.  En 1995, l’activateur tissulaire recombinant du plasminogène (rtPA) a été le premier traitement aigu développé pour l’AVC ischémique chez les patients qui se présentaient dans les 3 heures suivant le début de l’AVC³. Plus récemment, la thrombectomie mécanique a démontré un bénéfice dans le traitement de l’AVC ischémique aigu chez les patients qui présentent une occlusion des gros vaisseaux (OVL), qui comprend la partie intracrânienne de l’artère carotide interne ou le premier segment des artères cérébrales antérieures et moyennes⁴.  Aucun des essais cliniques récents n’a inclus l’AVC de la circulation postérieure et ses résultats restent lamentables malgré l’utilisation de la thrombectomie mécanique pour l’occlusion de l’artère basilaire ^5,6.

Les progrès des techniques d’évaluation chez les patients victimes d’un AVC ont un impact sur la prédiction des chances de récupération fonctionnelle et de survie⁷. Des modèles précliniques d’AVC de la circulation postérieure ont déjà été décrits ^8,9,10, mais l’évaluation du fardeau de l’AVC et de la revascularisation reste sous-optimale.  Les espèces plus petites telles que les rongeurs offrent plusieurs avantages, notamment la facilité de manipulation génétique, l’achat d’animaux peu coûteux et de faibles coûts de logement journaliers^11,12. Cependant, les expériences sur les petits animaux ne représentent parfois pas entièrement le système vasculaire des grands animaux et des humains, les conditions physiologiques ou les réponses inflammatoires associées⁷. Les grands animaux imitent plus fidèlement l’AVC^humain 2,7,13,14.  De plus, des prélèvements sanguins en série peuvent être effectués pour l’analyse sanguine des marqueurs thrombotiques et inflammatoires.

Dans cette étude, nous décrivons un modèle canin d’occlusion de l’artère basilaire vérifié par angiographie par soustraction numérique (DSA) dès le début de l’AVC.  Nous utilisons l’imagerie de perfusion de chatoiement laser (LSI) pour surveiller la perfusion en temps réel.  Nous utilisons ensuite un nouvel algorithme d’amélioration microvasculaire basé sur l’acquisition de l’imagerie de perfusion de chatoiement laser (LSI) ainsi qu’une technique d’imagerie par résonance magnétique (IRM) à valeur b élevée pour optimiser l’imagerie de l’infarctus¹⁵. Ces techniques nous permettent de suivre et de quantifier l’ischémie locale et globale. Enfin, nous corrélons ces résultats d’imagerie à l’histologie. Comprendre le pronostic et la nécessité d’étudier l’AVC de la circulation postérieure dans des modèles précliniques est essentiel pour améliorer les thérapies.

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Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées conformément à l’Animal Welfare Act et au Guide for Care and Use of Laboratory Animals (NRC 2011), tels qu’approuvés par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université d’État de l’Ohio.

1. Étape 1 : Préparation de l’animal et protocole chirurgical Un modèle canin d’accident vasculaire cérébral d’occlusion de l’artère basilaire (BAO) a été utilisé comme décrit précédemment ^9,10.

1. Beagles adultes rapides (8-13 kg, 14-21 mois) pendant la nuit avec accès libre à l’eau.
2. Injecter, pré-anesthésique, une administration intramusculaire d’acépromazine (0,2 mg/kg)
3. Introduisez un cathéter de calibre 20 dans une veine céphalique.
4. Induire l’anesthésie par l’administration intraveineuse de kétamine (10 mg/kg) et de midazolam (0,025 mg/kg).
5. Après l’induction anesthésique, intubez les chiens et ventilez mécaniquement en utilisant une anesthésie inhalée constante (2-3 % d’isoflurane).
6. Créez une fenêtre de craniotomie de 1 cm² pour l’imagerie du chatoiement laser.
7. Introduisez une gaine artérielle 7F dans l’artère fémorale droite pour l’accès et la mesure de la pression artérielle.
8. Introduisez un angiocathéter de calibre 16 dans la veine fémorale droite pour les prises de sang.
9. Préparez une thromboembole (caillot sanguin) comme décrit précédemment¹⁶. Brièvement, prélevez et mélangez 5 ml de sang total canin avec 0,5 g de sulfate de baryum (Ba₂SO₄) dans un tube de prélèvement de sérum sanguin en plastique tout en roulant pendant 30 secondes. Laissez reposer le mélange sans le déranger pendant 60 minutes à température ambiante avant l’administration du cathéter.
10. Commencer l’enregistrement de l’angiographie par soustraction numérique (ASD) de base avant d’accéder à l’artère basilaire moyenne. Avancez un cathéter de guidage 4F sous guidage fluoroscopique, en utilisant une approche trans-aortique rétrograde, dans la gaine artérielle 7F précédemment placée dans l’artère fémorale droite à travers une artère vertébrale jusqu’à la base de l’artère basilaire. Injectez deux millilitres d’agent de contraste avec une solution saline normale pour identifier l’artère basilaire.
11. À l’aide d’un scalpel chirurgical, réséquez le caillot en petits morceaux avec les couches¹⁶ riches en fibrine et en érythrocytes pour les charger dans une seringue de 3 ml et les injecter par le microcathéter au milieu de l’artère basilaire. Laissez le caillot se stabiliser pendant 10 minutes. Effectuez une angiographie de suivi pour vérifier l’emplacement souhaité du caillot. L’occlusion artérielle peut être vérifiée par DSA et la diminution de la perfusion cérébrale par imagerie laser du chatoiement (LSI).

2. Étape 2 : Imagerie laser Speckle

1. Concentrez la caméra d’imagerie de perfusion de chatoiement laser (LSI) sur la fenêtre crânienne. Configurez le système de caméra LSI (High Resolution Laser Speckle Imaging) comme décrit précédemment¹⁵.
2. Enregistrer la perfusion avec interruptions pendant la réalisation de l’angiographie aux moments souhaités. Acquérez des données à partir d’un champ de vision de 1,5 cm x 1,5 cm à l’aide d’une longueur d’onde de 785 nm et de lasers de 80 mW avec une fréquence d’échantillonnage de 60 Hz à une distance de travail de 10 cm dans ce modèle canin.
3. À partir des graphiques de perfusion en temps réel, choisissez le temps d’intérêt (TOI) pour inclure les pics inférieurs uniquement afin d’exclure les artefacts liés au mouvement respiratoire. Unités de perfusion relatives moyennes sur une période d’échantillonnage de 10 s à l’aide du logiciel PimSoft v1.4. Effectuez l’analyse du contraste du chatoiement laser (LASCA) comme décrit précédemment¹⁵.
4. Pour optimiser la quantification de la microvascularisation cérébrale dans ce modèle canin, enregistrez des images à 15 images par seconde et effectuez des calculs d’intensité et de variance avec une moyenne spatio-temporelle sur une zone de 5 x 5 pixels avec 5 images. La fréquence d’images globale pour les données d’intensité et de variance était de 3 images par seconde. Choisissez la valeur médiane de la perfusion pour chaque pixel afin de réduire les effets sur la moyenne des changements soudains importants des lectures de perfusion dus au mouvement de la respiration canine. Convertissez les données brutes en fichiers binaires et transformez les données en imagerie significative du système vasculaire. Utilisez l’algorithme LASCA remanié (rt-LASCA) pour utiliser la variance des données de contraste au fil du temps afin de déterminer les emplacements de la vascularisation, comme décrit précédemment¹⁵.

3. Étape 3 : Imagerie par résonance magnétique (IRM) et angiographie par résonance magnétique

1. Effectuez l’IRM la veille de l’intervention chirurgicale à des fins de comparaison si vous le souhaitez, puis répétez l’opération pour confirmer l’AOB et à nouveau avant le sacrifice si un traitement doit être évalué.
2. Placez les chiens anesthésiés en continu, la tête la première, en position couchée, comme décrit précédemment dans un scanner IRM Siemens Prisma 3 Tesla d’intensité de champ et d’alésage de 60 cm de diamètre, y compris une bobine de tête à 32 canaux comme récepteur avec des performances d’imagerie parallèle améliorées pour obtenir des images cérébrales¹⁷.
3. Effectuez des balayages d’alignement de piste pour acquérir des images pilotes de chaque cerveau canin avant le début de l’imagerie anatomique.  Le système utilisé pour obtenir les données présentées dispose d’un système d’imagerie intégré qui permet un balayage plus rapide dans des résolutions spatiales et temporelles optimales. Les gradients de 80 mT/m génèrent des images de haute qualité pondérées en T2 et en diffusion, ainsi que des angiographies IRM. L’imagerie pondérée en diffusion (DWI) est suffisamment sensible et peut montrer plus de sous-structure anatomique que les méthodes d’IRM structurales conventionnelles telles que les images pondérées en T2. Dans cette étude, l’IRM a été réalisée 4h après BAO.
4. Après une localisation correcte, effectuez une imagerie par écho de gradient pondéré T2 (paramètres : FOV = 130 mm, taille de la matrice = 320 x 320, taille de pixel = 0,3 x 0,3 mm, épaisseur de la tranche = 3 mm, TR = 4s, FA = 180 degrés, BW = 255 Hz/pixel, NEX = 2, TE = 75 ms, résolution = 2,4615 pixels par mm) suivie d’une imagerie FLAIR (récupération d’inversion atténuée par flux) pour visualiser la structure de l’anatomie du cerveau.
5. Effectuer une angiographie par résonance magnétique (ARM) pour visualiser l’anatomie vasculaire et la mesure de la circulation sanguine. Acquisition de l’ARM du cerveau couvrant la tête et le cou avec une séquence 3D à temps de vol (TOF) en vue transversale (Paramètres : FOV = 129x129 mm, taille de la matrice = 768 x 768, taille de pixel = 0,3 x 0,3 mm, épaisseur de la tranche = 81,59 mm, TR = 25 ms, FA = 18 degrés, BW = 185 Hz/pixel, NEX = 1, TE = 4,22 ms, résolution = 5,91 pixels par mm). Effectuez une projection d’intensité maximale (MIP) avec une visualisation 3D codée en couleur pour maximiser l’intensité du signal dans les vaisseaux sanguins.  Après le processus, j’ai acquis des images DICOM pour visualiser les vaisseaux sanguins et confirmer que l’artère basilaire était occluse.

4. Étape 4 : Imagerie pondérée en diffusion et calcul du volume de course

1. Effectuez une séquence d’imagerie pondérée en diffusion pour détecter les accidents vasculaires cérébraux ischémiques aigus (paramètres : FOV = 149 mm x 149 mm, taille de la matrice = 132 x 0x0x 100, taille de pixel = 0,30 mm x 0,30 mm, épaisseur de la tranche = 4 mm, TR = 4,6 s, FA = 90 degrés, BW = 255 Hz/pixel, NEX = 1, TE = 86 ms, résolution = 0,93 pixels par mm). Transférez des images DICOM pour le post-traitement.
2. Générez des cartes de diffusion apparente (ADC) à partir d’images DWI et calculez les volumes d’infarctus à l’aide du logiciel OsiriX MD v.5.0.
3. Tracez à la fois les hémisphères cérébraux et les zones d’infarctus par tranche et multipliez par l’épaisseur de la tranche pour obtenir les volumes d’infarctus.
4. Convertissez le volume entier absolu en 100 unités pour calculer le pourcentage de volume systolique de chaque chien.

5. Étape 5 : Histologie cérébrale de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine

1. Au moment du sacrifice chez la canine anesthésiée, prélevez le cerveau et coupez deux sections médiales de 4 mm d’épaisseur avec un scalpel bien aiguisé, une section sera utilisée pour la coloration TTC ci-dessous.
2. Fixez la section de 4 mm dans du formol à 10 % pendant un minimum de 7 jours pour permettre l’infiltration sur toute la section.
3. Intégrez la section du cerveau fixe dans de la paraffine en suivant notre protocole¹⁷.
4. Coupez et nivelez chaque bloc de paraffine (plusieurs blocs peuvent être stockés et traités en même temps).
5. Sectionnez chaque bloc de paraffine à 4 m et placez le tissu coupé sur une lame de 2 po x 3 po.
6. Traitez chaque lame avec de l’hématoxyline 560 pendant 8 min, différenciez avec de l’alcool acide à 1 % pendant 1 s trois fois avec un rinçage à l’eau du robinet.
7. Bleuissez chaque lame avec de l’hydroxyde d’ammonium à 1 % pendant 1 s et rincez-les pendant 2 secondes à l’eau du robinet.
8. Déshydrater dans de l’éthanol à 70 % pendant 1s douze fois, contre-coloré dans de l’éosine pendant 1 min.
9. Déshydrater à 95 % pendant 1s douze fois suivi de 100 % d’éthanol.
10. Nettoyer dans du xylène et appliquer une lamelle de 2 po x 3 po avec un support de montage, en éliminant les bulles d’air.

6. Étape 6 Coloration cérébrale au chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium à 2 %

1. Placer la deuxième section de 4 mm qui a été récoltée à côté de la section H&E dans une solution préalablement préparée contenant 100 mL de chlorure de 2,3,5-triphényl-2H-tétrazolium (TTC) à 2 % de pH 7,4 PBS chauffé à 37 °C dans l’obscurité.
2. Incuber dans l’obscurité à 37 °C pendant au moins 20 min, en retournant doucement la partie du cerveau toutes les 5 minutes.
3. Lorsque la section devient rouge cerise des deux côtés, retirer la solution de TTC et la remplacer par du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS, pH 7,4, pour optimiser le contraste pendant la nuit.
4. Lorsque le contraste est optimal entre les taches blanches et rouges dans le cerveau (1 à 3 jours), placez-le entre des feuilles de plastique transparentes, séchez l’excès de liquide et numérisez à haute résolution.
5. Tracez les régions ischémiques et le glissement cérébral entier pour obtenir le pourcentage d’infarctus dans chaque section, comme décrit précédemment¹⁷.

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Résultats

Enregistrement et imagerie de la perfusion de mouchetures laser : L’enregistrement de la perfusion a été effectué en continu jusqu’à ce que l’animal soit transporté à l’IRM, puis de nouveau au moment du sacrifice (figure 1A). Les données ont montré que la perfusion cérébrale a diminué de ~15 % à 83 ± 10 % au moment précédant l’occlusion de l’artère basilaire (pré-BAO). Ce déclin nominal est probablement le ré...

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Discussion

Les causes les plus courantes d’accident vasculaire cérébral de la circulation postérieure comprennent l’embolie, l’athérosclérose des grosses artères et la maladie des petites artères⁵. L’occlusion artérielle basilaire (BAO) représente un sous-ensemble de coups de circulation postérieure, entraînant une morbidité et une mortalité significatives¹³. Dans ce contexte, un modèle canin d’AVC postérieur aigu a été util...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2% 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (TTC in PBS, pH 7.4)	Sigma Aldrich	T8877
EDTA K3 vacutainers	Becton Dickinson	BD455036
Eosin	Surgipath	3801602
Formalin, neutral buffered, 10%	Richard-Allan Scientific	5701
Hematoxylin 560	Surgipath	3801570
HUG-U-VAC positioning system	DRE Veterinary	1320
LabChart Software	ADInstruments Inc.
Laser Speckle Imaging camera	Perimed Inc., Jarfalla, Sweden	PeriCam PSI HR System
Lithium heparin vacutainer, 4.5%	Becton Dickinson	BD 368056
Matlab	The MathWorks, Inc., Natick, MA
OsiriX MD v.5.0 software	Pixmeo Inc, Geneva
Paraformaldehyde 4% in PBS	Alfa Aesar	AAJ61899AP
PimSoft v1.4 software	Perimed Inc.	software that accompanies LSI equipment
Prisma Fit 3 tesla (3T) magnet	Siemen's Diagnostics
Sodium heparin for injection (to coat blood gas syringe)	NovaPlus	402525D