中子大分子晶体学晶体生长优化

摘要

通过晶体学对生物分子进行结构研究需要高质量的晶体。在这里，我们演示了 OptiCrys（在我们的实验室中开发的全自动仪器）和/或微透析按钮可用于基于结晶相图知识种植大型高质量晶体的协议。

摘要

中子大分子晶体学 （NMX） 的使用正在迅速扩大，由于新建了 NMX 光束线并增加了结构优化软件的可用性，大多数结构在过去十年中已确定。然而，目前可用于NMX的中子源明显弱于X射线晶体学的等效源。尽管这一领域取得了进展，但中子衍射研究始终需要更大的晶体，特别是研究更大的大分子和复合物的倾向。因此，为了扩大使用NMX，有必要进一步改进适合种植大型晶体的方法和仪器。

在这项工作中，我们引入了合理的策略和在实验室中开发的晶体生长台（OptiCrys），通过显微镜安装的摄像机将实时观测与晶体溶液的精确自动控制（例如沉淀物浓度、pH、添加剂、温度）相结合。然后，我们演示了这种对温度和化学成分的控制如何促进使用模型可溶性蛋白质寻找最佳结晶条件。对结晶相图的透彻了解对于选择任何结晶实验的起点和动能路径至关重要。我们展示了一种理性的方法如何控制基于多维相位图知识生成的晶体的大小和数量。

引言

了解蛋白质的结构-功能关系和生理通路的机制往往取决于了解氢原子（H）的位置以及电荷在蛋白质^1、2中的转移方式。由于氢原子散射X射线微弱，它们的位置只能用非常高分辨率的X射线衍射数据（+>1+）3，4来确定。相反，中子晶体学可以用来获得氢原子在生物大分子中的准确位置，因为氢原子和铀（H^2，氢同位素）原子的散射长度与氧、氮和碳⁵的散射长度大致相当。然而，来自可用中子源的中子通量比X射线束弱，因此这通常必须补偿^2，3。这可以通过与 H²和/或增加晶体体积交换来实现，以减少氢气的不连贯散射，并提高衍射图像的信号与噪声比。

有各种结晶方法（相应的示意图显示在图1）为X射线和中子生物巨分子晶体^学6获得大和高质量的晶体。在蒸汽扩散中，通过蒸发水或其他挥发性物种，从蛋白质和结晶溶液混合物中制备的液滴随着时间的推移而平衡在含有相同结晶溶液沉淀物浓度较高的储液层上。蛋白质和沉淀物在液滴中的浓度增加，导致自发核所需的超饱和，随后这些核^6，7的晶体生长。虽然蒸汽扩散是生长晶体⁴最常用的技术，但结晶过程不能精确控制^8。在自由接口扩散法中，结晶溶液扩散成浓缩蛋白溶液，非常缓慢地引导系统走向超饱和。此方法可视为具有慢速混合率^{6、9、10、11、12}的批处理方法。在批量方法中，蛋白质与结晶溶液快速混合，导致快速超饱和，进而与许多晶体^3、7统一核。此方法约占目前存放在蛋白质数据库中的所有结构的三分之一。透析方法还用于生长高质量和高差异的蛋白质晶体。在透析方法中，沉淀物分子通过半透膜从储层扩散到与蛋白质溶液的单独腔室中。平衡的动力学取决于各种因素，如温度、膜孔径、蛋白质样品和结晶剂的体积和浓度^等。

结晶相图可用于描述蛋白质的不同状态作为不同物理或化学变量³的函数。如图1所示，每个结晶技术都可以被形象化为使用不同的动能轨迹到达这样一个图^6，10，13的原子核和可转移区域。这提供了有关蛋白质溶解度和蛋白质浓度的信息，其中观察到晶体和溶液之间的热力学平衡，从而找到细胞核和生长^{的最佳条件3，14。}在二维相图中，蛋白质浓度被绘制为一个变量的函数，其他变量保持不变^15。在这样的相位图中，当蛋白质浓度低于溶解曲线时，溶液处于饱和区域，并且不发生核或晶体生长。这条曲线上方是蛋白质浓度高于溶解限值^3，14的超饱和区。这进一步分为三个区域:可转移区、自发核区和降水区。在可转移区域，超饱和度不足以使核在合理时间内发生，但种子晶体的生长可能发生。在降水区，超饱和量过高的^14、15日，降水量^和降水量比较多。

当实现足够的超饱和自体核时，第一个核将出现¹⁰个。晶体的生长导致蛋白质浓度的降低，直到达到溶解性的极限。只要超饱和度停留在溶解曲线附近，晶体的大小不会有显著变化。然而，已经表明，结晶溶液的温度和化学成分的变化（例如沉淀物的浓度）会影响蛋白质溶解性，并可能导致进一步晶体生长^{8，13，16。}

由于透析有利于优质晶体生长， 图2所示的OptiCrys结晶台在我们的实验室中设计和开发，以全自动的方式控制结晶^8。为此目的，使用 LabVIEW 编写了软件，允许通过电子控制器和冷水机组控制和监控与 Peltier 元素接触的流动储层透析设置的温度。同一软件还使用多通道流体系统自动调节结晶溶液的化学成分（例如结晶剂的交换）。此外，数码相机和倒置显微镜用于可视化和记录结晶过程。两个具有 15 μL 和 250 μL 体积的结晶室可用于用于不同用途的生长晶体。由于结晶过程是可逆的，只要样品不损坏^8，只需用蛋白质溶液的几微升就可以对不同情况进行筛选。因此，使用这种方法可以最大限度地减少使用蛋白质材料的数量。

从以往的工作^8，很明显，在晶体生长过程中， 现场 观测需要定期进行。这些范围从几秒钟到几天不等，具体取决于观测到的事件（沉淀、核或晶体生长）。

OptiCrys晶体生长的优化基于温度沉淀浓度相图。在含有溶解性作为温度直接功能的蛋白质的情况下，可以利用盐化机制^18。这是增加溶液的离子强度，可以使用蛋白质沉淀相图可视化，降低蛋白质的溶解性。同样，具有反溶解性的蛋白质可以利用盐化机制^18。核发生于可转移区域附近的核区，然后晶体生长在相图的可转移区域，直到蛋白质浓度达到溶解极限。如图3A所示，在恒定的化学成分温度下，可以降低结晶溶液在可转移区域，以防止新的核化。晶体生长，直到达到第二个晶体/溶液平衡，之后，没有观察到晶体大小的进一步增加。温度降低数倍，直到晶体达到所需的大小。在图 3B中，在恒定温度下，增加沉淀浓度可使溶液保持在可转移区域。然后，这个过程可以重复几次，以获得大晶体。改变温度和操纵结晶溶液条件，通过控制超饱和水平，是两个强大的工具，分离晶体的核化和生长，由OptiCrys^5，8，14精确和自动控制。

文献和PDB中提供了由温度控制或温度和沉淀浓度控制结晶生长的蛋白质晶体的例子，以及获得的相对衍射数据。其中有人类γ晶蛋白E、PA-IIL叶酸、酵母无机热磷酸酶、尿酸氧化酶、人碳水合物II、YchB激酶和乳酸脱氢酶^{5、14、17、18。}

虽然 OptiCrys 由 NatX 射线商业化，但有许多实验室无法访问此仪器或它提供的序列方法。该技术的替代方案是使用具有不同体积的市售塑料微透析按钮。使用这些，温度和化学成分可以手动调整和变化。微透析按钮的检查不能就地进行，而必须用光学显微镜手动完成。通过将样品保存在无振动温度控制的孵化器中，可以实现温度控制。必须保持温度恒定，以确保结晶实验是可重复的。温度的显著变化也可能导致晶体的损坏或破坏^。

在这里，我们提供了一个详细的协议，描述样品准备和控制软件的使用，用于生长大型，高品质的晶体适合中子蛋白晶体学。此分步过程旨在利用结晶相图来选择起始位置和动能路径，以控制生成的晶体的大小和质量。此外，还介绍了使用微透析按钮种植晶体的详细协议，该方案使用相同的原理来获取大型高质量晶体。

研究方案

1. 微透析按钮透析方法

1. 样品制备
   1. 通过溶解30毫克的鸡蛋清溶酶作为亲血粉在1 mL的CH₃COONa缓冲液（100米醋酸钠，pH 4）中准备蛋白质溶液，以获得最终浓度为30毫克-mL-1的溶液。
   2. 将样品在 13，000 × 克 中离心 10 分钟，在 277 K。此过程有助于在开始结晶过程之前移除任何聚合物。
   3. 检查样品在280nm的吸收量，并使用啤酒-兰伯特方程（A=εcl）计算蛋白质浓度。
      注:根据啤酒-兰伯特方程，电子吸收（A）与吸收物种的浓度（c，mg=mL-1）成正比，因为吸收物种的光学路径长（l，cm）是恒定的。这种线性关系的梯度是摩尔灭绝系数（ε，280nm的酶为2.64 mL+mg⁺¹+cm^+1）19。芳香氨基酸（酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸）和细胞素残留物之间的脱硫键的侧链具有很强的吸收力，在+280 nm由光谱允许的π-π*过渡产生。由于大多数蛋白质都含有这些残留物，因此，鉴于对灭绝系数的了解，蛋白质浓度通常可以通过测量280nm的吸收量来轻松计算。
   4. 准备 图 4中显示的结晶解决方案。在准备结晶溶液之前，使用 0.22 μm 毫pore 过滤器过滤所有库存解决方案。
2. 晶体生长
   1. 切一个纤维素透析膜与适当的分子重量截止（6-8 kDa），并浸泡在蒸馏水中。
      注:透析膜盘在商业上可用于微透析按钮，但如果使用透析管，不要忘记切割边缘，以便将两层膜从管子中分离出，只有单层膜。
   2. 以图 4 中显示的相同顺序，用 2 mL 的结晶溶液填充 24井托盘的井。
      注:如果使用体积较大的按钮（例如 200 μL），则用至少 5 mL 结晶溶液填充 50 mL 管，以确保高效交换。
   3. 在微透析按钮的腔室中添加/派珀特 35 μL 溶液， 如图 5A所示。
      注:为了避免在关闭时在 30 μL 透析按钮中形成气泡，必须添加额外的 5 μL 额外蛋白质体积（死体积），这意味着蛋白质样本总共为 35μL。这个额外的蛋白质样本在腔室顶部形成一个略带圆顶的形状，如 图5B所示，它防止气泡的形成。
   4. 取一个适当大小的施用器，将弹性O型环放在其四肢（图5C）。然后将以前使用一张无纤维纸轻轻擦拭/排干的膜放在透析按钮的腔室顶部。涂纸时要小心不要在室内放灰尘。通过将弹性 O 形环从施用器转移到透析按钮的凹槽（图 5C）来设置透析膜。
      注:处理的关键时刻是通过将弹性 O 形环从施用器转移到透析按钮的凹槽中，将透析膜固定在腔室顶部。所有运动必须完全同步，以避免将气泡与蛋白质室中的样品封闭。在应用前练习拉伸弹性O-环，了解其刚性，在应用过程中使用钳子保持部分膜，并用模型蛋白进行首次测试实验是有用的。
   5. 使用钳子（图5D）将按钮转移到井或50 mL管。
   6. 用盖子盖住油井，轻轻压在油脂上密封油井（图5E）。
      注意:如果油井顶部没有油脂，请务必在开始实验前添加此油脂，或使用胶带而不是玻璃盖片。使用微透析按钮的蛋白质结晶原理如 图5所示。
   7. 将样品保持在 293 K 的热调节孵化器中。根据所使用的蛋白质和结晶条件，可能需要不同的温度。
      注: 图 4 中显示的相同结晶条件网格（允许沉淀物浓度变化）可以筛选为温度函数。在这种情况下，必须复制相同的结晶板，并且每个拷贝必须放置在不同温度下调节的孵化器中。这需要有几个无振动的热调节孵化器可用。
   8. 检查托盘或管子是否有晶体（图4），并定期（通常每天）做笔记，以区分每个托盘中的内容。良好的音符对于避免误报结果和区分晶体的灰尘至关重要。

2. 使用 OptiCrys 的晶体生长过程

1. 样品制备
   1. 准备蛋白质溶液和透析膜，如第1.1节所述。
   2. 准备 NaCl （4 M） 和 CH₃COONa pH 4 （1 M） 的库存解决方案，并将其过滤成 50 mL 管。
   3. 将蛋白质溶液（15 μL的溶酶与30mg=mL-1）添加到温度控制的流动储层透析设置的透析室中。有关温度控制流动储层透析设置的详细信息，请参阅图 6。OptiCrys 有两个透析室，最小体积为 15 μL，最大体积为 250μL。
   4. 用透析膜盖住过腔膜，用弹性O型环（图6B）固定膜。
      注:此设置不同于微透析按钮，其中每个腔室由透析膜直接密封。在流动细胞中，透析膜被固定在过腔腔上，允许在不去除的情况下安装晶体。为此，过蓄水池可以简单地从水库拧开。
   5. 翻转过腔，放在透析室的顶部。缓慢而轻轻地按下它，以消除被困在两块之间的所有空气，并避免在室内的气泡（图6C）。在训练时使用模型蛋白质进行练习，以避免气泡和样品流失，是有利的。
   6. 修复水库的位置，轻轻地拧在过蓄水池的顶部，再次注意避免捕获气泡。水库的过度拧紧也会在结晶室（图6D）中形成气泡。
   7. 加入结晶溶液，盖上密闭的储层。（图6G）。水库的最大容量为1mL。
   8. 转移此组件并将其插入黄铜支部。此支持与用于控制温度的佩尔蒂埃元素保持接触。
   9. 如图 6所示，气密盖配有光学窗口，允许透析室的顶部照明。将光源（图2）放在窗户上，让光线穿过房间。
   10. 储层室可以连接到泵，使其能够作为连续流动单元发挥作用。将包含库存溶液和蒸馏水的 50 mL 管顶部的管子连接到旋转阀，如 图 7所示。
       注:如果实验期间不需要自动制备和更换结晶溶液，请省略步骤 2.1.10。在这种情况下，必须准备结晶溶液，并手动预填充储层。
2. 软件
   1. 打开计算机并启动软件 克罗伊萨斯纵横交错[水晶生长]。此控制软件使用 LabVIEW（http://www.ni.com/labview/）编写，并提供用户友好的图形界面。它包括 4 个不同的图形界面（Accueil [欢迎]， 帕拉梅特拉格 [设置]， Essai [测试]， 和 维护 [维护]（图 8） 。
      注:法语翻译在括号内。
   2. 单击图 8中所示的按钮，选择维护视图。此视图是当前最常用的视图，允许用户在实验期间控制大多数参数。
      注:单击 维护 视图后，将出现具有不同部分以控制温度或光线等参数的新窗口。在 图 8 中，此视图的不同部分以箭头和帧显示。在以下步骤中，我们演示如何使用软件控制每个参数。
   3. 温度控制器（温度控制器）部分允许控制和监测温度。单击图 8中的头号（1）按钮以打开它。
      注:奥普蒂克里斯的温度范围为233.0-353.0±0.1 K。
   4. 设置 托运人 [设置点] 部分的温度，然后按输入 （图 8（2）。在此按钮下方，有一个带有 2 个痕迹的图形（红色和黄色）。红色痕迹显示最终（有序）温度，黄色痕迹显示当前温度。如图 8（2）所示，温度设置为 20 °C。
      注:为了生长晶体，正如晶体生长部分所解释的，需要选择许多温度。要更改温度，在 托运人 [设置点] 部分添加每个新温度，然后按键盘上的"输入"按钮。
   5. 通过增加图 8中的Lumiéres [灯]部分的亮度来打开灯。亮度范围从 0 到 100，"0"表示光关闭，在"100"时，光设置为最大强度和亮度。通过增加光线，在显微镜部分，人们可以看到透析室内。在实验过程中，细胞的亮度可能会有所不同:调整参数以清楚地显示透析室内部。也可以通过使用"缩放"前的+和–按钮来增加或减少放大倍率，以便更好地查看。
   6. 在显微镜部分的右侧，有几个部分用于存储每个结晶实验的相关信息。每个用户可以创建一个文件夹来存储有关所用透析膜的结晶条件、蛋白质名称和分子重量截止的信息（图 8（3）。
   7. 用户只需在名号[文件夹名称]上键入实验名称即可定义该实验的名称。点击档案[文件夹按钮]（图8中的绿色框架显示）打开一个新的窗口。在此窗口中，将有一个文本文件，其中包含为实验定义的所有信息。此外，此文件夹中还保存了时间戳图像，以供将来处理。
   8. 从 NB 图像 部分， 选择在实验过程中应拍摄的图像数量。指定右侧面板中的图像数量以及它们之间的所需时间间隔（例如，最小、小时、一天）。 图 8 显示软件设置，在一分钟内记录零图像。
      注:使用庞培 [泵]部分混合库存溶液，并将结晶溶液注入储层腔室。有关流体混合系统原理的解释，请参阅第2.1.10 节和图 7。
   9. Etape 1 [步骤 1]中库存解决方案的输入浓度:解决方案库存。对于下一节的结晶实验，将使用 NaCl 4 M 和 CH₃COONa 1 M pH 4。
      注:库存溶液的浓度在摩尔单元中。
   10. 定义每个解决方案的最终浓度。例如，NaCl 为 0.75 M，CH₃COONa pH 4 为 0.1 M。将这些输入到 Etape 2 [步骤 2]中的最后浓度部分 （图8）:解决方案 [ 准备的解决方案] 。按下微积分 [计算]按钮，该按钮在图 8中显示红色帧。用于混合的每个库存解决方案的最终体积将显示在每个集中面板前的音量面板中。
   11. 按 下兰瑟（启动准备） 按钮（图8）。如 图7所示，旋转阀需要每个库存溶液，并通过开关将其注入搅拌管。
   12. 在准备结晶解决方案后，单击 Etape 3 中的 Entrée 解决方案 [解决方案条目] 按钮 [步骤 3]: 泵部分的通量（ 图 8中的黄色框架）。开关改变，将新的结晶溶液从混合管注入储层腔室。要停止交换过程，请按 Arrét 分发 [分发停止] 按钮。
       注:在实验过程中观察结晶过程，并在监理软件的相应图形界面中修改温度、结晶溶液和缩放等参数。通过使用该软件，无需在实验过程中拆下密闭的上限或流动单元，因此唯一的变量将是用户通过软件更改的变量。
3. 大晶体生长
   1. 在透析室（图6A）中加入浓度为30毫克^-mL-1的15微升溶酶。
      注:准备第1.1节所述的蛋白质样本。
   2. 组装第2.1节和 图6中描述的温度控制流动水库透析设置。
   3. 准备结晶溶液。不要忘记在用 0.22 μm 过滤器进行样品准备之前过滤所有库存解决方案。对于此实验，结晶溶液包含 0.75 M NaCl 和 0.1 M CH₃COONa pH 4。这可以通过手动添加，也可以使用第 2.2.10 至 2.2.12 节中描述的储层室和泵送系统。
   4. 将温度设置为 2.2.3 节和 2.2.4 节中解释的 295 K，并显示在图像 8 中。在初始条件下，透析室和储层之间的平衡将在大约90分钟后达到，第一个可见的核将在22小时后出现。
   5. 允许晶体生长，直到观察到晶体大小不再明显变化（图9，面板1）。
      注:为了确定原子核时间并测量晶体大小的变化，每 15 或 20 分钟记录一次图像，NB 图像部分每小时分别记录 4 或 3 张图像 。对于蛋白质去自然、聚集和沉淀或晶体溶解或核化的 现场 观察，通常需要几秒钟到几十分钟。然而，对于晶体生长，这个范围在几分钟到几个小时之间。
   6. 三天后，将温度降低到291K，以重新启动晶体生长。保持温度恒定，让晶体发育（图9，面板2）。对于实验的这个阶段，每2小时记录一次图像，每10到12小时检查一次晶体大小的任何变化。如果观察到晶体大小没有变化，实验可以继续进行。
      注:根据结晶溶液中的蛋白质和沉淀物浓度以及所使用的蛋白质量，达到每个步骤的平衡所需的时间可能会有所不同。
   7. 将温度降低到288K以重新启动晶体生长。在此处介绍的案例的实验条件下，一天就足以达到平衡（图9，面板3）。
   8. 检查晶体的大小，并保持恒定的温度，只要晶体继续生长。
   9. 4天后，将温度降低到275K，以重新启动晶体生长（图9，面板4）。
      –在所展示的案例的实验条件下，大约10天后，将获得一个尺寸为500μm的晶体（图9）。
4. 控制晶体尺寸
   1. 准备蛋白质溶液和温度控制的流动储层透析，如第 2.3.1 节和第 2.3.2 节所述。
   2. 使用 0.9 M NaCl 和 0.1 M CH₃COONa pH 4 准备结晶解决方案。
   3. 将温度设置为 291 K，并允许晶体生长。在初始条件下，第一个核事件将在大约一小时后开始，许多晶体将在透析室中生长三个小时（图10，步骤:1和2）。每 20 分钟记录一次图像，以检查晶体在生长过程中的大小。
      注:晶体条件的优化对于控制生成晶体的大部分最终特性至关重要。结晶溶液的温度和化学成分可以改为溶解和重新生长均匀大小的晶体。还应指出，在这样的实验中不消耗蛋白质样本，因为只要样品不变自然，就可以逆转以重新溶解样品的条件。通过改变温度和保持恒定的化学成分溶解晶体时，请继续以下实验:
   4. 一旦晶体以291K的速度生长，这些晶体就可以溶解，以重新生长更少、更大的晶体。温度逐渐升高超过20分钟，达到313K。溶解透析室内的所有晶体大约需要一个小时（图10，步骤:3-5）。每 5 到 15 分钟记录一次图像，以监控解散过程。
      注意:许多蛋白质对高温很敏感。请务必在蛋白质稳定的温度范围内工作，以避免任何损伤/自然。除了蛋白质溶解性，温度也影响缓冲液。例如，缓冲器的 pH 度会随着温度的变化而变化，尤其是在 Tris 缓冲区。在这种情况下，根据实验进行¹⁸的温度设置 pH 至关重要。还应指出，与蛋白质晶体生长（从几个小时到几天）相比，蛋白质溶解所需的时间（从几分钟到几个小时）要少得多。一般来说，在晶体溶解期间，温度逐渐缓慢上升（尊重总溶解时间短），主要是在晶体部分溶解的情况下，以避免晶体马赛克的增加。当晶体生长时，温度会迅速（在不到一分钟内）降低到设定的温度（尊重漫长的总生长时间）。通过记录图像定期监测结晶室是可取的，以防止对蛋白质的损害，并帮助确定每个研究的蛋白质的晶体溶解或生长的最佳时间。
   5. 在所有的晶体溶解后，将温度设置为295K，以启动第二个核事件（图10，步骤:6，7）。每5分钟记录一次图像，以监控第二次核过程。在此步骤中，第一个核在大约 18 分钟后出现。
      注:在此温度下，溶液将位于可转移区域附近的核区。因此，只有少数核会出现在结晶室中。
   6. 继续实验，重复第 2.3 节中描述的用于生长较大晶体的优化工作流程。 图 10 中表示的实验的总持续时间只有几天。
      注:如果在原子核阶段，晶体在不同时间出现，则不同尺寸的晶体在结晶室中获得。在这种情况下，温度的升高（在具有直接溶解性的蛋白质的情况下）将导致更小的晶体更快地溶解。根据动能成熟效果，额外的蛋白质（从溶解中获得）可用于较大的晶体的生长。
      通过改变结晶溶液的化学成分在恒温下溶解晶体时，请继续以下实验:
      在实验中改变结晶溶液的化学成分，以在新的条件下重新生长一定大小的晶体，也有可能溶解以前生长的晶体。
   7. 准备蛋白质溶液（2.3.1）、温度控制的流动储层透析设置（2.1）和结晶溶液（2.4.2），如上文所述。在远离可转移区域的核区的初始条件下，许多小晶体将出现在结晶室中并开始生长（图11，步骤:1，2）。
   8. 三个小时后，当许多中型晶体在结晶室（图11，步骤:3）中可见时，逐渐降低NaCl浓度（0.9M），达到零。为此，准备一个新的结晶溶液，仅包含缓冲液与0.1M CH₃COONa pH 4。使用抽水系统与储层室中的结晶溶液交换。按照步骤 2.2.10 到 2.2.12 准备和注入新的解决方案到储层室。有了这个新的解决方案，当解决方案交换时，NaCl浓度在储藏室中降低，直到储层室中的最终解决方案包含不超过0.1M的CH₃COONa pH 4和没有NaCl。每 10 分钟拍摄一次图像，以记录解散过程。
   9. 让晶体完全溶解（图11，步骤:4，5）。这个实验的解散时间大约是两个小时。如前所述，溶解时间取决于所使用的蛋白质系统、结晶条件和透析室体积。在实验期间定期观察结晶室（见 显微镜 部分）并记录图像和笔记至关重要。
   10. 当腔室内的所有晶体溶解时（图 11，步骤:5），再次使用抽水系统准备新的结晶溶液，将 NaCl 的浓度低于前一个晶体（0.75 M NaCl 在 0.1 M CH₃COONa pH 4 中）。
   11. 将新溶液注入储层室（图 11，步骤:6，7），并重复第 2.3 节中描述的结晶生长优化工作流程。将产生一个更大的晶体的均匀种群。 图 11 中显示的结果是在几天后得出的。

结果

在第 2.3 节和第 2.4 节中，介绍了优化晶体生长的三个示例，显示了仪器的使用和种植大型晶体的实验设计。对于这个演示，我们已经使用酶作为模型蛋白质，虽然晶体生长实验已经成功地与许多其他蛋白质系统使用这种方法（见上文）。通过使用和掌握此处提出的协议，可以针对其他蛋白质候选者进行调整。

在第2.3节中，我们证明，建立合理的结晶策略可以有利于培育具有足够散射体积的中子蛋白晶体的晶体。在这里，我们表明，建议的合理优化战略也允许产生一个统一的晶体种群，任何特定大小所需的下游结构确定方法。

这两个实验旨在强调相位图在控制晶体核化和生长方面的重要性。在这里，控制结晶溶液的温度和化学成分，结合实时监测结晶过程，用于研究定性相图。使用这种方法，可以以可逆的方式合理优化核和晶体生长。使用这种连续方法还可以减少蛋白质的数量和控制晶体大小和质量所需的时间。

在透析方法中，蛋白质溶液通过半透膜^6（图5）从结晶溶液中分离出来。这种透析膜允许小分子，如添加剂，缓冲液和离子通过膜，但不是大分子，如蛋白质^6，20。此功能允许在实验⁶过程中修改结晶溶液。交换解决方案可以手动完成，例如在微透析按钮中，或使用为此目的开发的仪器 OptiCrys⁸以自动方式进行。

在第一组实验中，微透析按钮用于鸡蛋清溶酶的结晶。微透析按钮浸入不同盐浓度的结晶溶液中。在这个简单的结晶网格实验中，唯一的变量是沉淀浓度，而温度保持不变（293 K）。如 图4所示，盐浓度的微小变化导致观察到的晶体大小和数量发生变化，从而可以研究结晶相图。在 图 4中，面板 1 中，结晶溶液包含 0.7 M NaCl，按钮中出现了数量有限的较大晶体。通过将盐浓度从0.7米提高到1.2米，超饱和度增加，核区的溶液从可转移区域移开（图4，面板1至6）。因此，晶体的数量增加，其大小减少。

在第一个全自动仪器的实验，使温度控制透析结晶，OptiCrys（图9），晶体生长实验是量身定做的，以产生较大的晶体生长。实验在295K的初始温度下启动，结晶溶液含有0.75M NaCl和0.1M纳醋酸盐缓冲液pH4。在这些实验条件下，结晶溶液到达相图可转移区域附近的核区（图9，箭头1）。因此，在实验的第一阶段只生成了几个核。为了进一步培育选定的晶体（ 如图9所示），晶体生长优化工作流程在达到晶体溶液平衡后，通过不同的温度向可转移区域驱动。

每次达到晶体和溶液之间的平衡时，温度都会降低，首先降至291K，然后降至288K，最后降至275K，以将结晶溶液保持在可转移区域。本实验的结果是单个大型晶体，适用于大分子X射线和中子晶体学。

对于大多数蛋白质来说，由于在结晶实验¹⁸中缺乏能够准确测量蛋白质浓度（或只是实时观察/检测结晶过程）的实验设备，因此尚未获得精确的定量相图（或只是一个定性图）。因此，通常无法设计实验的方式，使结晶从相图的最佳区域开始，在可转移区域附近。

因此，在进行大体积晶体生长实验之前，必须进行结晶优化研究。在这项研究中，一方面使用温度变化（以恒定的化学成分）和化学成分的变化（在恒定的温度下），确定可转移区域并确定启动大型晶体生长实验的最佳条件。

为此，还进行了另外两项实验，这些实验是经过量身定做的，以证明利用 OptiCrys 进行温度控制透析结晶实验的可逆性，用于核化、晶体生长、溶解和再生长。控制晶体生长优化工作流程，利用温度变化或沉淀浓度，培育出数量较少、较大的淋酶晶体。

在 OptiCrys 的第二次实验中，结晶溶液的化学成分在整个实验中保持不变（0.9 M NaCl 在 0.1 M CH₃COONa pH 4 中），温度变化。初始温度设定为 291 K。这个实验的结果总结在 图10中。由于超饱和性高，结晶室中出现了大量小晶体（图10、面板1和2）。按照直接蛋白质溶解的概念，通过逐渐将温度提高到313K，所有的晶体都溶解了（图10，面板3，4和5）。最后，通过将温度降低到295K，第二个核在可转移区域附近启动，并允许控制形成数量较低的核。进一步的晶体生长导致大晶体的均匀生成（图10，面板7）。

如 图11所示，结晶溶液的化学成分变化，在291K的恒温下，同样可用于获得更大的晶体的均匀种群。与之前的实验类似，初始条件为 0.9 M NaCl 在 0.1 M CH₃COONa pH 4 中。然后，NaCl浓度从0.9米逐渐降低到零，以溶解晶体（图11，面板4和5）。此时，NaCl 完全被 0.1 M CH₃COONa pH 4 的缓冲液所取代。降低盐浓度使溶液保持在相图的饱和区，导致晶体溶解。然后，在0.1 M CH₃COONa pH 4中注入了离子强度较低的新型结晶溶液，在0.75 M NaCl下注入储层室。在这个沉淀的浓度下，第一个核在90分钟后出现（图11，面板6）。生成的晶体数量比以前更低，晶体体积更大（图11，面板7）。

图1:示意图相图。三种结晶技术的动能轨迹表现在盐化机制中。每种方法都以不同的方式实现核和结晶，通过相图通过不同的动能通路进行可视化，以到达原子核和可转移区域。溶解曲线将饱和度和超饱和区域分开。超饱和分为三个区域:可转移、核和降水。在核区，自发核发生，而在可转移区域晶体生长发生。此图改编自朱纽斯 等人。⁸请点击这里查看此数字的较大版本。

图2:结晶台（OptiCrys）的示意图表示。LED光源位于温度控制透析流体的顶部。倒置显微镜和数码相机用红色箭头显示在图像的右上角。红色圆圈表示冷水机组管的位置。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图3:示意图二维蛋白质结晶相图作为温度 （A） 和沉淀浓度 （B） 的函数。（A） 如果蛋白质具有直接溶解性，降低温度可使结晶溶液保持在可转移区域。温度变化可以重复几次，以控制晶体的生长过程，直到获得具有所需体积的晶体。（B） 改变沉淀溶液的浓度也可用于将结晶溶液保存在可转移区域，用于种植晶体。此图改编自朱纽斯 等人。⁸请点击这里查看此数字的较大版本。

图4:利用透析方法获得的溶酶晶体。此实验是在 0.1 M 醋酸钠缓冲 pH4 中恒温 293 K 进行的。将NaCl浓度从0.7M提高到1.2M会提高核率，并导致更多的晶体。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图5:透析方法对蛋白质结晶过程的概述。（A） 通过将蛋白质添加到透析按钮的腔室中，（B） 在腔室顶部创建一个圆顶形状。（C） 使用施用器将 O 环转移到透析按钮的凹槽中，以便修复透析膜的位置。（D） 透析按钮已准备好浸入储层溶液中。（E） 结晶溶液穿过半透膜，晶体开始在腔内形成。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图6:温度控制流动透析设置的示意图视图。（A） 蛋白质样本添加到透析室。（B） 透析膜使用施用器固定在带 O 形环的过腔器上。（C） 过度的隔膜被打开并固定在透析室的顶部。白色箭头指示螺钉放置在过仓上的位置。（D） 储层室顺时针转动 （E），并固定在过蓄水池的顶部。（F） 储层腔室被密闭的盖子覆盖，与抽水系统的连接器相连，（G） 流动电池放置在黄铜支架中。此图改编自朱纽斯 等人。⁸请点击这里查看此数字的较大版本。

图7:由流体系统（A）在储层中制备和注入结晶溶液。含有盐和水的管子连接到压力/真空控制器 （B） 和旋转阀 （C）。通过使用压力，压力/真空控制器创建液体从管子到旋转阀的恒定流动。每个液体通过流量计 （D） 和开关被注入混合管 （F）。一旦所有液体都添加到搅拌管中，通过一些修改的开关将最终溶液从搅拌管注入储层 （G）。液体以按升序标记的图表中箭头的方向流过系统（从 1 到 6）。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图8:监督软件的维护视图。此视图用于控制不同的参数，如温度、光线、结晶溶液和变焦。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图9:相位图作为温度函数（选定的图像将按上升顺序进行跟踪）。单个大型酶晶体通过系统地将温度从295K变为275K而获得。在每一步，晶体生长在到达溶解曲线时停止。通过将溶液保持在可转移区域来降低温度，可重新启动晶体生长。图像具有不同程度的放大倍率。此图改编自朱纽斯 等人。^8，18请点击这里查看此图的较大版本。

图10:使用温度控制在恒定的化学成分下优化晶体生长（选定的图像将按上升顺序进行跟踪）。在距离可转移区域较远的291K核区启动核过程，导致许多晶体的形成。将温度提高到313K，然后溶解晶体，直到透析室中看不到可见的核。最后，将温度降低到295K会第二次重启核过程，导致数量有限的大型晶体。此图改编自朱纽斯 等人。^8，18请点击这里查看此图的较大版本。

图11:利用沉淀浓度的变化，在恒定温度下优化晶体生长（选定的图像将按上升顺序进行跟踪）。将沉淀浓度从0.9M降低到0M会溶解在第一次核事件中获得的晶体。结晶过程通过注射相同的沉淀物重新启动，但离子强度较低，0.75 M，导致形成几个较大的晶体。此图改编自朱纽斯 等人。^8，18请点击这里查看此图的较大版本。

讨论

不同的物理、化学和生物变量影响蛋白质结晶，影响蛋白质溶解性^21。在这些变量中，结晶溶液的温度和化学成分与透析技术相结合，用于改进和培育大型优质生物分子晶体，用于中子衍射研究。通过使用相位图的知识，结晶变得更加可预测。虽然也可以以连续方法筛选不同的结晶条件，但使用所呈现的合理方法的主要目的是分离和控制晶体核和生长的动能。

与所有结晶研究类似，高质量的纯同质蛋白样品和无尘结晶溶液提高了实验的成功率。解决方案的过滤和离心是上述议定书中的重要步骤。了解所研究的蛋白质的物理化学特性，如分子量（选择适当的透析膜）、等电点和蛋白质溶解性，对于设计最佳晶体生长实验至关重要。此外，必须考虑在不同温度或不同化学品下的蛋白质稳定性，以防止样品流失并增加成功的可能性。考虑到 OptiCrys （233.0-353.0 ± 0.1 K） 的温度范围，可以使用它结晶多种蛋白质。但值得强调的是，在该仪器提供的温度控制的大体积晶体生长实验中，主要具有热稳定性的蛋白质（如来自热友源的蛋白质）将受益最大。

使用小容量透析室（使用 OptiCrys 时）或微透析按钮并筛选多个温度和结晶条件（例如沉淀浓度或 pH 值网格），可以获取有关可转移区域限制位置的信息（原子和可转移区域之间的动能平衡）。这是宝贵的，当设计一个成功的晶体生长实验，特别是为新的蛋白质候选在结晶。没有这些信息实验可以从具有高超饱和度的相位图区域开始，离可转移区域的极限太远，无法轻松控制晶体核。虽然可以尝试溶解蛋白质沉淀物，例如，在直接溶解的情况下提高温度，对于热不稳定性降低的蛋白质，将样品保持在高温下较长时间可能会使蛋白质沉淀不可逆转。因此，最佳策略包括使用位于元稳定极限附近的低超饱和度的初始条件，在那里可以控制核，避免蛋白质沉淀。与此相一致，结晶预筛选可降低透析室中蛋白质沉淀的几率，并提高实验的成功率。

在设计实验后，准备透析室（OptiCrys）或微透析按钮是另一个重要步骤。防止透析室/按钮中形成气泡会增加成功结晶的机会，尤其是在使用小体积时。透析室中气泡的存在也可能改变结晶过程的动能，减少实验的可重复性（因为蛋白质/溶液接触表面已被修改）。不仅蛋白质，而且结晶溶液也会影响实验的成功。每次使用新的50 mL管泵送系统，每次想开始一个新的实验和洗涤管后，每个实验减少污染的机会，并避免在仪器中产生盐晶体。

当 OptiCrys 不可用时，使用微透析按钮是另一种选择。优化结晶和监测晶体生长的战略必须手动执行。通常，这需要在热调节的孵化器之外，当温度调节是描述方法的关键一步时，这可能会有问题。这不利于改变结晶溶液的化学成分，也不利于通过成像监测晶体生长，因此晶体生长过程无法实时控制。

阶段图的知识是使用结晶台OptiCrys系统地以自动化方式种植大型高质量晶体的基础。在结晶过程中控制温度、沉淀浓度和pH值等物理化学参数，在整个相图中以明确定义的动能轨迹移动蛋白质溶液平衡。此外，还使用透析膜来调节质量传输，并在结晶室中创建一个受控的梯度，从而影响晶体的大小和质量。因此，使用热力学数据和动能轨迹对于控制结晶过程以生长高质量的晶体至关重要。得益于 OptiCrys，可以使用比以前少得多的材料的序列方法来研究多维空间中的系统相位图。为了证明这种方法，我们在这里提供了一个案例研究与模型蛋白质，鸡蛋清酶。通过使用和掌握这里提出的协议，人们可以适应它的真实蛋白质系统^{5，14，17，18。}

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µl Dialysis Button	Hampton Research	HR3-330	Dialysis button
24 well plates	Jena Bioscience	CPL-132	Crystallization plate
2-Switch	FLUIGENT	2SW001	Switch
30 μl Dialysis Button	Hampton Research	HR3-324	Dialysis button
50 mL Corning Centrifuge tubes	Sigma-Aldrich	CLS430828-500EA	Centrifuge tubes
Acetic acid	Sigma-Aldrich	S2889	Chemical
Chicken Egg White Lysozyme	Sigma-Aldrich	L6876	Lyophilized protein powder
Dialysis Membrane Discs 6-8 kDa MWCO	Spectrum	132478	Dialysis membrane
Dialysis Membrane Tubing 6-8 kDa MWCO	Spectrum	132650T	Dialysis membrane
Microcentrifuge	Eppendorf	Minispin	Bench-top centrifuge
Flow Unit	FLUIGENT	FLU-XL	Flow meter
Flowboard	FLUIGENT	FLB	Flowboard
Microfluidic Flow Control System EZ	FLUIGENT	EZ-01000002	Pressure/vacuum controller
MilliporeSigma 0.22 µm syringe Filters	Millipore	GSWP04700	0.22 μm pore size filter
M-Switch	FLUIGENT	MSW002	Rotary valve
Opticrys	NatX-ray	PRT008	Crystallization bench
Siliconized circle cover slides	Hampton Research	HR3-231	Glass slides
Sodium Chloride ≥ 99%	Sigma-Aldrich	746398	Chemical
Switchboard	FLUIGENT	SWB002	Switchboard
Thermoregulated incubator	Memmert	IPP30	Thermoregulated incubator