鼠脑水平海马片

摘要

本文旨在描述一个系统的协议，以获得水平海马脑片在小鼠。这种方法的目的是保持海马纤维通路的完整性，如穿孔路径和青苔纤维道，以评估凹痕陀螺相关的神经过程。

摘要

海马是大脑中高度有组织的结构，是边缘系统的一部分，参与记忆的形成和巩固，以及严重脑部疾病的表现，包括阿尔茨海默氏症和癫痫。海马获得高度的内部和相互连接，确保与内部和外部大脑结构的适当沟通。这种连接是通过纤维通路形式的不同信息流实现的。在探索海马的神经生理功能时，大脑切片是一种常用的方法。海马脑片可用于几个不同的应用，包括电生理记录，光显微测量以及一些分子生物学和组织化学技术。因此，大脑切片是评估蛋白质功能、研究神经系统疾病的病理生理过程以及药物发现的理想模型系统。

切片制备有几种不同的方法。脑切片制剂与颤音可以更好地保存组织结构，并保证在切片过程中有足够的氧气供应，这比传统使用组织切片机具有优势。此外，不同的切割平面可用于振动切除脑切片制剂。在这里，提供了一个详细的协议，成功地准备振动切水平海马片小鼠的大脑。与其他切片制剂相比，水平切片允许将海马输入路径（穿孔路径）的纤维保持在切片内完全完好无损的状态，从而有助于研究内皮-海马相互作用。在这里，我们为穆林大脑的解剖、提取和急性水平切片提供了一个彻底的协议，并讨论了这项技术的挑战和潜在缺陷。最后，我们将展示一些例子，用于进一步的应用大脑切片。

引言

对海马的广泛探索开始于斯科维尔和米尔纳报告一个病人（H.M.）在手术切除海马和附近的时间叶结构后无法形成新的，声明性的记忆，作为治疗严重癫痫^1。从那一刻起，海马从一般神经元特性和功能到严重的脑部疾病的发展，如癫痫和阿尔茨海默病2，3，4，5，进行了广泛的研究。海马是边缘系统的一部分，由一组参与情感和记忆形成的相关大脑结构^组成。由多个纤维通路组成的密集网络实现了海马与内部和外部大脑结构的紧密连接。这些通路包括中线和横向穿孔路径（凹痕陀螺的内皮层，CA3 - CA1 和子^）8，青苔纤维路径（凹痕陀螺到 CA3）⁹和沙弗抵押品/关联通路 （CA3 到 CA1）¹⁰ （图 1）。海马是迄今为止探索最广泛的大脑区域之一，因为它的神经元层形成高度保守的层压组织，并有可能获得重要的神经元文化和大脑切片相对容易^5。

图1：卡通说明不同的海马区和主要纤维路径。不同的海马区域由实心色线表示：内皮层（EC;黑色）、凹痕陀螺（DG;橙色）、 科努阿莫尼斯 （CA）3（青色）、2（黄色）和1（洋红色）以及亚晶（绿色）。纤维通路以彩色虚线显示：介质（MPP，红色）和横穿孔路径（LPP，蓝色）（从内皮层到凹痕陀螺， CA3、CA1 和亚丘鲁姆）、青苔纤维通路（MF、紫罗兰色）（从凹痕陀螺到 CA3）和沙弗抵押品（SC、棕色）（从 CA3 到 CA1 的紫外线）/关联通路（AC，浅绿色）（从 CA3 到 CA1 的相对）。 请点击这里查看此数字的较大版本。

大脑切片协议经常导致从更遥远的大脑区域到感兴趣的区域⁵失去连接。此外，毛细血管不再功能⁵和血液循环被剥夺^11。尽管有这些限制，大脑切片仍然主要用于研究海马的神经生理功能，由于一些优点。首先，海马的提取速度很快^，不需要很多材料。唯一的基本仪器包括解剖包，实验室水浴，获得碳水化合物和振动微切除术（颤音^）13。大脑切片技术的其他资产是绕过血脑屏障（BBB）和在实验⁵开始前洗掉内源释放的分子，这使得研究药物的效果具有相对精确的剂量控制^14。此外，大脑切片保留了海马^15、16号内部的细胞结构和突触回路，其中神经解剖学和具有神经元连接和复杂神经元-胶质相互作用的局部环境保存了^{4、11、17。}此外，海马纤维连接主要是单向的，海马神经元具有很高的突触可塑性，这极大地简化了高质量电生理记录的收集和解释，以便了解神经过程^18，19。重要的是，大脑切片是适用于各种不同科学技术的宝贵资产，从分子生物技术到成像记录，一直到电生理测量12、20、21、22、23、24、25、26。

如上所述，海马脑切片是研究突触连接结构和功能特征的有力实验工具。这提供了评估化学物质或突变对神经元兴奋性和可塑性的影响^的机会。

急性脑切片制剂呈现一种相对敏感的技术，最佳切片质量高度取决于理想的实验条件，包括动物的年龄、安乐死的方法、解剖和切片的速度、切片溶液和参数（如切片速度）以及切片恢复的条件^4。因此，设计精良的协议是最重要的，并确保在不同的研究单位¹³的可重复性。

在这里，我们提供了急性水平海马切片制剂的详细协议，旨在保持海马横穿路和中穿孔路径和青苔纤维通路的完整性，允许研究凹痕陀螺相关过程^9。我们将详细描述解剖、提取和水平切片 Murine 大脑的关键步骤，然后是钙微氟化记录和在基线条件下和在野生类型 C57BL/6J 小鼠大脑切片中的 LTP 诱导协议期间的现场兴奋性后潜在记录 （fEPSP） 的代表性结果。

研究方案

这项研究的所有动物实验都得到了KU Leuven（比利时）伦理审查委员会（P021/2012）的批准。

1. 制备高蔗糖片溶液和人工脑脊液（ACSF）

1. 在实验日之前
   1. 准备 1 L 的 10x 切片预溶液与实验室级 1 型水包含 （在 mM）： 25 KCl， 20 CaCl_2，10 MgSO_4，12.5 KH₂PO₄ （表 1）.为了防止磷酸钙沉淀，在预先装满800毫升_H2O的烧杯中慢慢混合化学物质，同时不断用磁搅拌器搅拌。将解决方案存储在 4 °C 或室温 （RT）。
2. 在实验日
   1. 准备 1 L 的 1x ACSF 与实验室级 1 类含水 （在 mM）： 125 纳克， 2.5 KCl， 2 CaCl_2，1 MgSO_4，1.25 纳赫₂PO_4，26 纳霍_3，25 葡萄糖 （表 2）.使用蒸汽压力渗透计验证 305-315 mOsm （pH = 7.55-7.6） 之间的渗透度。
      注意：为了防止磷酸钙沉淀，在预先装满800_毫升H2O的烧杯中慢慢混合所有固体化学物质，同时不断用磁性搅拌器搅拌。在末端添加MgSO₄ 和CaCl_2， 从1M库存解决方案中慢慢滴入所需量。
   2. 在RT中连续冒泡1x ACSF解决方案，用碳水化合物将pH定在7.3-7.4之间。
      注意：如果pH值略高或过低，则对碳水化合物强度的微小调整就足够了。如果 pH 高于 7.45 与碳水化合物， 调整它通过添加 1 M Nah₂PO₄ 溶液的几滴。
   3. 在含有 25 mL 10 倍切片预溶液的烧杯中准备 250 mL（每个大脑）的 1 倍高蔗糖切片溶液，并在 mM 中：252 蔗糖、26 NaHCO₃和 10 葡萄糖（表 3）。验证渗透度在 320-325 mOsm 之间（pH = 7.55-7.6）。
   4. 用碳水化合物将高蔗糖切片溶液泡10-15分钟，以控制7.3-7.4之间的pH。
      注：如果pH高于7.45与碳水化合物，调整它通过添加几滴1 M KH₂PO₄ 溶液。
   5. 将高蔗糖切片溶液存放在超冰柜（-80°C）中20-30分钟，直到部分冷冻。

2. 为大脑解剖准备工作空间

1. 在高蔗糖切片溶液冷却期间，准备以下。
   1. 将水浴加热至32°C。
   2. 用碳化ACSF溶液填充回收室（图2A），并将回收室放在水浴中。在回收室中将碳水化合物持续应用于主ACSF瓶和ACSF。
   3. 把动物带到实验室。
      注：动物的年龄、性别和体型必须由个体实验者确定，并取决于具体的研究问题。但是，动物的参数应在一项研究中保持不变，以保证不同实验天之间的可比性。该协议旨在用于在2-6周时使用C57BL/6J雄性小鼠。如果使用较老的动物，切片和恢复解决方案可能需要相应地调整^4，27（例如，NMDG+基于解决方案23，28），以保持急性切片的大脑健康。
   4. 准备麻醉室。
   5. 布置纸巾，塑料巴斯德移液器与宽开（切开），90毫米培养皿充满冰， 冰镇文化盘顶部的过滤纸方，用于斩首的强剪刀，解剖剪刀，弯曲的钳子，铲子，35毫米培养盘，细刷，刀片，标本板（带有颤音），超级胶水，移液器尖端，四带滤纸（约2厘米×0.5厘米）（图2A）。
   6. 设置振动图：首先，为正确的设置编程振动（刀片行驶速度：0.08 mm/s，切割振幅：1.4 毫米，切割频率：85 Hz），并将碳水化合物线连接在切片室中。接下来，将切片室放在支架中，用冰填充切片室周围的支架，并将所有内容连接到振动体上。最后，将剃须刀刀片放在振动刀片支架（图2B）中。
2. 冷冻高蔗糖溶液后执行以下步骤。
   1. 20-30分钟后，将高蔗糖切片溶液从-80°C超冰柜中取出，将烧杯放在冰上。
   2. 将高糖溶液放在长凳上的振动切除术旁边，将部分冷冻的溶液与铲子粉碎并混合，以获得一个漂亮的泥浆，并开始与碳水化合物冒泡。
   3. 用塑料巴斯德移液器吸收一些高蔗糖切片溶液，将方形滤纸浸泡在冰镇的 90 mm 培养盘上。
   4. 用高蔗糖切片溶液（足以覆盖整个大脑）填充 35 mm 培养盘（或任何适合存储整个大脑的等效小容器），并在冰上用溶液的其余部分冷却放在烧杯旁边的培养盘。在 35 mm 培养盘中生成溶液。

3. 穆林大脑的解剖和定位

1. 用5%的异氟化麻醉动物。通过捏爪子确定麻醉的适当深度。不应发生爪子取款反射。
2. 将动物转移到纸巾上，用强剪刀或小动物断头台斩首。
3. 用解剖剪刀切开头皮。
4. 沿着下垂缝合线切开钙化物，在弯曲钳子的帮助下将其取出，直到整个大脑，包括嗅球，可见。
   注意：小心不要用钙化物或钳子的锐利边缘损伤大脑。
5. 用铲子小心地挖出大脑（嗅球应该保持连接）。
6. 在冰镇的35毫米培养皿中转移大脑，用充满ACSF的巴斯德移液器轻轻清洗大脑，去除组织中的所有头发或血液颗粒（血液对脑组织有细胞毒性作用^29）。
7. 在冰镇90毫米培养盘（图2A）上浸泡的滤纸上的铲子的帮助下转移大脑。
8. 使用刀片将大脑切成两半，将两个半球分开，并将两个半球放在刚切割的中位侧。
9. 使用刀片去除主体部分（5%-10%）大脑从每个半球与平行切到正交顶部 （图2C）^30， 并将两个半球放在新鲜切割的一侧，大脑的腹腔部分朝上。
10. 将一滴超级胶水放在标本板上，用移液器尖端正确摊开，以适应两个半球。
11. 使用滤纸带用毛细细的力拿起一个半球，用滤纸带触摸腹侧，从而不会损坏组织。
12. 使用另一个滤纸带小心地半干大脑的背侧，然后将半球定位在标本板上的胶水上。与第二个半球重复相同的程序。
    注：半球应以镜像的方式定位在振动板上，球体侧朝外，腹地两侧朝（但不接触）在中间。两个半球的中侧应指向振动刀片，侧面指向实验者（图2D）。
13. 将样品板放在切片室中，快速但小心地用冰冷的高蔗糖片溶液覆盖。一旦溶液接触胶水，它就会凝固并正确地将半球粘合到标本板上。
14. 确保半球正确覆盖高蔗糖切片溶液，并确认溶液与碳水化合物冒泡。
    注：应尽快执行整个解剖程序。请确保大脑不会长时间没有氧气供应。从斩首到大脑浸入高蔗糖片溶液泥中，只需要大约1-1.5分钟。这是急性脑切片制剂的最关键要求，以保证切片的高质量。

4. 大脑水平切片

1. 将振动刀片放置在半球的中侧前面，并将其降低到与现在朝上的半球腹侧相同的高度。在振动控制的帮助下将刀片降低到 600μm 进一步在指端方向，并开始切片。刀片应击中组织（如果没有，则反向刀片并降低一点）。切片，直到前两个切片完全从两个半球分离。
2. 倒转刀片，再降低 300μm 并再次切片。
3. 当海马变得可见（必要时使用鼠标³¹ 脑图集寻求帮助）（图2E）用加宽的塑料巴斯德移液器收集切片。收集切片，直到海马旁边可以看到牛皮。通常，小鼠大脑可以收集8-12片300微米（每个半球4-6）。
4. 使用塑料巴斯德移液器收集切片并将其转移到水浴中的回收室（图 2F）（每次切片后收集切片以防止它们漂浮在切片室中）。
   注意：尽可能快地工作，并确保高蔗糖切片溶液在整个过程中结冰和碳水化合物。如有必要，重新填充切片室周围的冰。

5. 恢复用于电生理记录的大脑切片

1. 将切片留在 32 °C 水浴中充满 ACSF 的回收室中 1 小时。
   注：回收室也可在商业上使用。
2. 把回收室从水浴中取出来。
3. 在开始任何进一步应用之前，将切片放置在 RT 中至少再恢复 30 分钟。

6. 海马体中穿孔路径 （MPP） 的 fepsp 录音

1. 将录音移液器从带水平移液器的玻璃毛细管中拉出，在充满ACSF溶液并浸入充满ACSF的录音室时，可接收+2 MΩ大小的移液器。
2. 在与录音室相连的重力控制多管灌注系统中填充ACSF沐浴液和含有适当化学物质（例如双管素）的ACSF溶液和ACSF溶液。不断地对所有解决方案进行碳水化合物生成。
3. 打开连接到录音室中灌注线对面的吸管或真空泵。打开充满ACSF的桶，开始建立连续流量（每秒1-2滴）。验证参照电极是否淹没在ACSF解决方案中。
4. 打开设置计算机、放大器、微操纵器、刺激器、显微镜灯、照相机和显示器（如果适用）。
5. 打开适合电生理记录的软件（存在几个不同的电子生理设备硬件和软件提供商）。
6. 将一个大脑切片半球从恢复室转移到切片设置的记录室，并将其定位在正确的方向，与凹痕陀螺颗粒细胞层和视野中的分子层。确保刺激电极可以从内皮层方向到达切片中的 MPP，并且记录电极可以从 CA3 方向的完全相反的一侧访问 MPP。
7. 用回形针（图3A）或市售的脑片网格稳定录音室中的切片。
   注意：在切片转移和定位过程中关闭注水是很有帮助的。然而，这不应该花太长时间，以保证大脑切片的质量。
8. 将 MPP 中的记录和刺激电极放在靠近颗粒细胞层（图 3B）的分子层的下三分之一中，彼此朝向大约 100-150μm。刺激电极应最小接触表面，而记录电极应稍微渗透到上切片层。
9. 将低强度刺激（30-50 μA 0.1 毫秒）应用到大脑切片上，以获得 fEPSP 信号。如有必要，调整电极的位置（例如，低或非典型形状的fEPSP信号）。
10. 开始记录输入输出曲线：每隔30s在大脑切片上应用增加的刺激强度。
11. 将刺激强度设置为最大 fEPSP 响应的 50%，并启动将 50% 刺激强度在 30 秒间隔内应用于大脑切片的基线 fEPSP 记录。
12. 如果基线看起来稳定，请继续进行其他录制（例如，LTP/LTD 协议和/或药物应用）。（对于 MPP 中的 LTP 感应，这里使用了由 5 分钟间隔内应用的 4 倍 1 s 100 Hz 脉冲组成的协议。在调理阶段前和调理阶段前 10 分钟应用双管素。
    注：所有录音应在当前夹子模式下进行，并具有适当的低通过过滤（+lt;5 kHz）和采样速率（+10 kHz）。
13. 以适当的文件格式提取数据，并分析 fEPSP 参数，如光纤排球、fEPSP 振幅和 fEPSP 斜率。

7. 脑片钙成像记录

1. 在12口井室中转移一个大脑切片半球，用适当的钙染料加载30分钟至1小时。通过在 12 井板的盖子中插入自制孔（带热 18G 针头）将碳水化合物管插入，从而持续生成装载解决方案。
   注：这一步骤是没有必要的，从转基因动物的大脑切片制剂，内源性地表达荧光记者，如GCaMP。
2. 准备步骤 6.2-6.5 中描述的录制设置。
   注：微氟成像实验不需要放大器或微操纵器。使用兴奋剂是实验所依赖的。荧光成像实验的特定软件是必不可少的。
3. 将软件调整到正确的成像设置：这包括相机放大器和装箱设置、波长设置、曝光时间和定时协议。设置可能因确切的实验而异。（例如，在实验期间，每 500 毫秒重复一次 1 x 1 装箱、2.4 倍放大器前增益、300 EM 摄像机增益、488 nm 下 50 毫秒的曝光。
4. 在装载钙染料后，将大脑切片半球从12口井转移到录音室，并将其放置在显微镜阶段。
5. 用回形针（图3A）或类似于第6.7步描述的市售脑切片网格稳定录音室中的切片。
6. 确保感兴趣的领域在正确的微观领域和焦点。
7. 使用荧光成像软件在切片上选择几个感兴趣的区域 （ROI）。
   注：选择整个视场以跟踪亮度因光亮度波动而出现的一般波动是有用的。
8. 开始录制，并在选定的时间点应用实验测试药物。
   注：建议在每个实验结束时应用高^K+ 溶液来验证细胞的神经元特征和切片质量。
9. 以适当的文件格式提取数据，并在整个测量中分析 ROI 中发生的荧光信号变化。在离线分析期间，也可以调整投资回报率。
   注：其他描述脑片中fEPSP记录和钙微氟测序的方案在文献^{24、32、33、34、35}中可用。

结果

协议所需的工具和关键步骤的一般概述
图 2提供了本协议中描述的水平急性海马脑切片制备的所有必要工具和关键步骤。一般来说，需要数量有限的关键仪器，包括一些解剖工具和切片恢复室（图2A）、实验室水浴和振动（图2B）。图2C-E可视化切片准备过程中大脑和半球的重要步骤和方向。图2F是水平脑切片预期结果的例证。

介质穿孔路径中的 fepsp 录音
恢复期后，脑片可用于fEPSP的电生理记录。在这里，我们使用直立显微镜，配备多通道重力控制输液系统（图3A和图3B）。玻璃微点 （+ 2 MΩ） 填充了 ACSF 溶液，并附着在氯化物涂层的银电极上，该电极安装在带氯化浴电极的电路中可操作放大器上。通过将玻璃微刺插入大脑切片上层海马的 MPP 中，使用放大器和适当的录制软件记录和可视化 fEPSP。fEPSP 是由用 2 接触聚类微电极刺激引起的，将不同的电流强度施加到记录电极上游的 MPP 上。请注意，此协议的目的不是要解释如何获得 MPP 录制，而只是以 MPP 中的录制作为示例来演示此处描述的切片准备协议的成功。如果有人试图执行MPP录音，某些控制（如配对脉冲录音）可能是必要的，以确保适当的录音网站和区分MPP与LPP 8，36，37。

图 3C 说明了 fEPSP 录制的负值（左面板、低质量切片）和正（右面板、高质量切片）示例。负示例跟踪显示大纤维排球 （FV） 振幅，甚至高于实际 fEPSP 振幅 （≈0.5 mV）。相比之下，高品质的切片示例（右面板）显示了小 FV 到 fEPSP 比率和高 fEPSP 振幅（+0.5 mV）。纤维排球是受刺激的神经元纤维去极化时产生的信号，因此在先于先天性强效 （fEPSP） 之前发生。FV 与 fEPSP 属性的关系提供了有关保存轴突突触属性的重要信息。具有完整神经纤维的高质量切片应显示高fEPSP振幅与FV比。相反，传导性能受损的低质量切片的 fEPSP 与 FV 比率将降低。同样，通过绘制fEPSP坡度与纤维电容振幅（图3D），可以分析大脑切片的可行性。

此外，输入输出曲线（fEPSP 坡度和 FV 振幅超过刺激强度）被标准使用，以确定切片质量。这种曲线是通过在大脑切片上应用增加电流刺激和监测随后的fEPSP反应获得的。低质量的脑切片显示，由于保存不良的脑组织（图3E，F）的次优传导特性，输入输出曲线减少。此外，输入输出曲线对于确定突触过程研究的理想刺激强度范围是必要的。理想情况下，刺激强度应设定在最大响应强度的 50% 左右。在这个选择的刺激强度，fEPSP的反应是非常敏感的突触可塑性的任何变化，这提供了机会，以调查长期效力（LTP）和长期抑郁症（LTD）。

为了研究突触可塑性，在选定的50%刺激强度下，大脑切片（fEPSP坡度）的突触传输在调理阶段之前被监测较长时间（通常在20-40分钟之间）。可行的大脑切片将有稳定的基线，而具有不稳定基线的大脑切片不能用于进一步的调理方案，以研究大脑电路的突触可塑性（图3G，上面板）。fEPSP基线录音也可以是有用的，以监测药物对突触传播本身的影响（图3G，下面板）。记录的 fEPSP 基线信号的平均值通常用于使 fEPSP 时间过程正常化，并且标准设置为 100%。

通过在大脑切片上应用特定的调理方案，可以研究突触可塑性。这些协议取决于被调查的大脑回路和利益机制（例如LTP或LTD）。为了诱导LTP在MPP的凹痕陀螺，一个强大的调理方案是必要的，由于强大的GABAErgic抑制存在于MPP突触^38。据报道，GABAergic抑制在用高蔗糖切片溶液³⁹制备的大脑切片中更为明显。在这里，我们使用一个协议，包括四个刺激1 s长100赫兹脉冲应用在5分钟的间隔，而治疗与GABA_A 受体拮据双管素（图3H）。在调理期间共同添加 NMDA 和双管素可导致 LTP 增加（图 3H）。切片质量低和突触传输不稳定（fEPSP基线）可能导致 LTP 和 LTD 感应发生改变或不成功。因此，使用高质量的切片制剂并采用严格的排除标准（低 fEPSP 振幅与纤维排球比（+lt;3）、小 fEPSP 斜度（+lt;0.5 mV/ms）或振幅（+lt;0.5 mV）和不稳定的 fEPSP 基线（变化超过 5%） 非常重要用于研究突触过程时的不可行的切片。

凹痕陀螺的颗粒细胞层中的钙微氟测量
恢复后，脑片在室温下孵化，在碳水化合物ASCF中用2微米钙敏感染料孵育1小时，免受光线照射。切片被转移到一个记录室（图3A）的直立荧光显微镜上配备了多通道重力控制的敷液系统。荧光发射图像在488nm（图4A，B）照明后每500毫秒获得一次。兴奋是用Xenon灯和扫描仪安装的衍射光栅单色和图像采集用计算机控制的CCD相机进行的。在测量过程中，切片用NMDA受体拮据APV处理，导致细胞内钙浓度下降。由于神经元去极化和电压门离子通道（图4C）的打开，用含有高钾浓度（50 mM）的细胞外溶液刺激切片导致细胞外钙大量涌入。

复合	浓度（米）	分子量（克/摩尔）	金额 （g）
氯化钾	25	74.55	1.86
卡克2*2H2O	20	147.01	2.94
姆格索4*7H2O	10	246.48	2.46
KH2PO4	12.5	136.08	1.7

表1：10 x 切片预解决方案（1 L）。

复合	浓度（米）	分子量（克/摩尔）	金额 （g）
纳克	125	58.44	7.3
氯化钾	2.5	74.55	0.19
卡克2*2H2O	2	从1 M卡Cl2 解决方案	2 mL
姆格索4*7H2O	1	从1 M毫克索4 解决方案	1 mL
纳赫2PO4*2H 2O	1.25	156.02	0.2
纳科3	26	84.01	2.18
葡萄糖*H2O	25	198.17	4.95

表2：1x ACSF （1 L） （305-315 mOsm 之间的渗透度）。

复合	浓度（米）	分子量（克/摩尔）	金额 （g）
10倍切片预解	不适用	不适用	25 mL
蔗糖	252	342.3	21.57
纳科3	26	84.01	0.55
葡萄糖*H2O	10	198.17	0.49

表3：1倍高蔗糖切片溶液（250 mL）（320-325 mOsm之间的渗透度）。

图2：关于水平海马脑片制备的详细信息。（A） 啮齿动物大脑解剖和切片所需的工具图像：（a） 长±2厘米，±0.5厘米宽的滤纸带（如413级）：（b） 刀片：（c） 超级胶水：（d） 移液器提示：（e） 标本板（带有颤音）：（f） 35毫米文化菜：（g） 细刷子：（h） 铲子：（i） 弯曲的钳子：（j） 解剖剪刀：（k） 强剪刀（刀片长度超过 10 厘米）：（l） 开口宽的塑料巴斯德移液器（直径在0.6至0.8厘米之间）：（m） 回收室（自制 250 mL 烧杯、塑料环、尼龙网、10 mL 血清移液器片）：（n） 90 毫米文化菜，上面装满了冰和 （o） 方形滤纸。（B） 带有（a）充满冰的切片室的振动图：（b） 切片室;（c） 碳水化合物线和 （d） 切片剃须刀刀片。（C） 卡通说明一个半球的底面切口的方向，以便大脑为水平切片做好准备（见步骤3.9）。（D） 振动体标本板上大脑方向的等轴测投影。（E） 卡通说明标本板上两个半球位置的顶部视图。（F） 卡通显示海马在水平大脑切片中的位置。表示海马体的凹痕陀螺 （DG） 和科努艾莫尼斯（CA） - 苏比库勒姆 （SB） 区域。（G） 带有碳水化合物ACSF的恢复室图片，其中含有十块刚切好的水平脑片。请点击这里查看此数字的较大版本。

图3：海马脑切片的电生理记录。（A） 在直立显微镜下使用的浸注和吸气录音室的图像。大脑切片将被放置在室内，并在录音开始前用一块回形针固定。（B） 直立显微镜下海马脑切片的明亮场图（10倍目标）。凹痕陀螺 （DG） 和 CA3 区域被指示，以及刺激（左下角）和记录（右下）电极，针对 fEPSP 录制过程中的中穿孔路径。（C） 左： 表示具有强健纤维排球和小振幅的 fEPSP 记录的低质量切片示例。右图：fEPSP录制的高质量切片示例。灰色线表示基线水平。虚线指出了 0.5 mV 的截断振幅。（D） fEPSP 坡度与 FV 振幅的绘图，用于高质量（黑色：n=10）和低质量脑片（灰色：n=4）。数据表示平均± SEM.（E） 输入输出图 （fEPSP 斜坡），用于高质量切片（黑色;n = 10）和低质量切片（灰色：n = 4）的不同刺激强度 （μA）。（F） 与在 （E） 相同， 但对于 Fv 振幅与刺激强度。（G） 三种不同基线 fEPSP 记录的时间过程（fEPSP 的斜率百分比：正常化到前 5 分钟的平均 fEPSP 坡度）。上面板代表正（黑色）和负（红色）示例，后者由于在录制过程中遗漏了碳水化合物而具有不稳定的基线。下面板显示两个稳定的基线记录在处理（在20分钟的稳定基线后，AMPA受体被AMPA受体拮据剂DNQX（10 μM）（蓝色）和未经治疗的条件（黑色）的应用阻止。（H） 针对不同治疗条件的 LTP 录音的时间过程（在下面板中表示）。调理期间双管素 （20 μM） 的黑色和调理期间共同应用双管素 （20 μM） 和 NMDA （10 μM） 的蓝色。上面板中的箭头表示应用高频刺激的时间点（100Hz 的 4 x 1s）。下面板中的条形图表示平均 fEPSP 斜坡 （%）在上面板中显示的实验的 LTP 上岗后 50-60 分钟（每个条件的单一代表记录）。 请点击这里查看此数字的较大版本。

图4：海马脑切片的钙微氟度。（A和B） 老鼠大脑水平海马脑片的荧光图像 （兴奋在 488 nm） （A） 和相应的热图（B） 。凹痕陀螺 （DG）， CA3 区域， 与 NMDA 受体拮抗剂 APV （50 Mμ） 和含有高细胞外钾 （K⁺） （50 mM） 的溶液一起治疗期间，来自急性海马脑切片凹痕陀螺的 ROI 的钙反应时间过程 （F_{488 nm）}中指出了感兴趣区域 （ROI） 的示例。该微量在高 K⁺注水期间标准化为最高钙反应，并纠正为光漂白的基线。请点击这里查看此数字的较大版本。

讨论

虽然在神经科学界很普遍，但大脑切片制剂也面临着几个缺点。例如，与大脑感兴趣区域的输入和输出连接不再连接在大脑切片中。此外，一旦分离，组织开始逐渐退化，这个过程可能会改变大脑切片的生理条件。这个主题尤其令人关注，因为大多数脑切片记录需要几分钟到几个小时，这导致长时间的实验日，在实验开始前被分离到6-8小时的组织上进行录音。此外，脑脊液和血液循环在切片准备过程中中断，这可能导致大脑切片内缺乏重要的内源性化合物。最明显的是，切片过程本身可能会导致机械组织损伤，从而损害获得的结果。然而，大脑切片制剂的实际益处仍然大于其缺点，这就是为什么他们在神经科学研究中提出了一种备受重视和采用的技术。

急性海马脑切片是一种强大的，因此广泛使用的技术，以研究神经元过程从分子水平到复杂的脑回路研究。这是基于海马的理想神经解剖，可以很容易地保存在切片准备^18。因此，海马脑片用于各种科学研究项目，包括药物筛选^17，神经元和突触特性研究涉及认知功能40，41，和病理大脑状况研究^{14，42，43。}但是，广泛的不同应用还会导致各种可用的切片制备方案，这些协议在各种参数（如解剖条件和切割平面方向等）上可能有所不同。因此，必须确定科学项目的确切研究问题，以便选择适当的切片制备方案。

组织直升机提出了最古老的使用技术之一，以准备海马脑切片^44，45。这种制备方法的主要优点包括直升机成本低，使用方便快^捷。然而，组织斩波器引起机械应力，导致形态改变和细胞死亡^47。相比之下，振动切除术是一台相当昂贵的机器，切片制备的时间显著增加，这可能会对切片的质量产生影响。然而，振动切除术通常提供一种更温和的方式从组织中分离切片，并允许保持大脑很好地冷却和氧气在整个隔离过程，从而改善切片属性^46。因此，几个小组正在标准地采用这项技术，并提出了使用颤音^16，30，48制备急性海马脑切片的协议。虽然有些协议只提供了切片本身的一些细节，而是侧重于这种切片准备⁴⁸的具体应用，其他协议提供了详细的切片协议，不同的切割平面或其他协议细节（如，agarose嵌入或切片/恢复解决方案）在本条^27，30。

这里描述的协议提出了一个简单的方法，以准备高质量的急性水平海马鼠脑切片从年轻的动物。该协议是特别有用的，以保持穿孔路径（中等和横向），呈现海马输入路径，其中项目从内皮层到海马^{8，49，50。}射手座，冠状体，以及孤立的海马横向切片制剂不能适当保存穿孔路径，这主要源于内皮层的第二层和V层和项目到海马^体18内的几个区域。由于内皮层相对于海马体的解剖定位，水平脑切片是必要的，以保持切片准备³¹内完全完整的穿孔路径纤维。此外，水平切片理想地保留了从凹痕陀螺投射到海马^9，30，50内的CA3神经元的青苔纤维。因此，这种制备方法对于研究海马输入途径和DG相关过程的研究具有很高的价值。此外，该协议允许调查沙弗抵押途径^50。然而，在研究CA3到CA1纤维投影时，下垂和日冕脑切片制剂更常用，大概是因为它们的制备时间稍快，可以增加获得高质量切片的机会。然而，水平海马切片制剂是一个强大的研究工具，因为它允许保存和研究一个切片半球内的所有海马纤维通路。例如，在多极测定录音中，当电路响应被研究时，这尤其有用。

准备脑切片时，一个主要问题是适当保存脑组织。这是通过我们的协议中的几个关键步骤来实现的，包括快速解剖，连续和足够的氧气和冷却的组织，并通过使用低钠，高糖切片溶液^39，51的保护性切割方法保护脑组织。尽管此处描述的协议成功率约为 90%，但与来自较老或遗传多样性动物的组织合作或试图保护特定细胞群时，可能需要可能需要额外的保护步骤。据报道，已经有几种方法可以保护敏感的脑组织制剂。这些方法包括使用基于NMDG的切片溶液来减少钠渗透^52，在切片溶液中使用高镁水平来阻止NMDA受体活性^53，以及在恢复期²³期间长期使用保护性溶液。所有这些措施都将导致兴奋中毒程度的降低。此外，在与年龄较大的动物²⁷工作时，经常使用带有冰冷保护ACSF溶液的转心输液。"

急性海马脑片非常适合和广泛用于电生理学研究的原因，如高振幅信号，可以从相对厚（300-500 μm）急性脑切片获得，这保证了高信号与噪声比^11。标准使用的电生理应用包括细胞外场记录和电压或电流夹模式下的细胞内全细胞录音。为了获得高质量的电生理数据，切片健康是首要问题，可以通过严格遵循所提交的协议来保证。但是，由于切片制剂是一种高度敏感的技术，因此应在每个实验开始前定期进行质量检查。几个参数可以用作切片的质量检查，并通过输入输出曲线和基线 fEPSP 或 EPSC 记录¹⁹进行标准评估。然而，应当指出，次优电生理特性可能产生于实验错误，如电极定位、方向甚至损坏，并不仅仅代表制备切片的健康。因此，建议执行额外的质量控制，例如在 40 倍目标下对细胞进行简单的可视化和评估，或 DAPI 细胞核染色。这种质量检查可用于在几次切片准备会话中确认不断的切片健康。

钙微氟学是研究海马脑切片的一种不太常用的技术。然而，这项技术对标准的细胞外和细胞内电极记录具有附加价值，因为它允许可视化和量化细胞内钙通量，这在神经元和突触信号中非常重要。细胞内钙浓度的变化涉及神经递质囊泡释放，先知后潜在生成，突触可塑性和轴神经传导的调节54，55，56。作为这项技术的例证（图4），我们使用了一种市售的钙染料。无可辩辩地，用钙染料治疗组织切片会产生困难，例如增加实验时间框架以及低位神经元细胞的低效负荷。然而，这种技术的变化可以用来规避这些技术挑战。例如，可以将钙测量和海马片中的贴片夹录音相结合。通过这种方式，钙荧光染料可以通过贴片移液器加载到特定的细胞中，从而可以在一个感兴趣的特定细胞中测量钙动力学^。或者，基因工程动物表达钙指标，GCaMP^58，无论是在整个大脑，或由细胞特异性促进运动驱动，可以使用。有趣的是，GCaMP动物的脑组织与感兴趣的蛋白质有直接联系，可以提供机会来确定神经元表达模式或研究钙火花和波的参与。

总之，我们为成功从小鼠身上制备健康可行的水平海马脑片提供指南，用于电生理和成像记录。这种方法对于获取在凹痕陀螺中描述的大脑病理学中发生的神经变化是非常有用的。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anesthesia chamber	home made - Generic	N/A	plexiglas
Anesthesia vaporizer	Dräger & MSS International Ltd	Isoflurane Vapor 19.3 & MSS Isoflurane	to vaporize isoflurane for rodent anesthetization
Barrels for the perfusion system	TERUMO	Hypodermic syringes without needle	https://www.terumotmp.com/products/hypodermics/terumo-hypodermic-syringes-without-needle.html
Bicuculline methiodide	hellobio	HB0893	https://www.hellobio.com/bicuculline-methiodide.html
Borosilcate glass capillaries	Science Products	GB150F-8P	https://science-products.com/en/shop/micropipette-fabrication-1/capillary-glass-for-micropipette-pullers/borosilicate-glass-capillaries/borosilicate-filament-polished
Calcium chlorid dihydrate	Merck	102382	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Calcium-chloride-dihydrate,MDA_CHEM-102382?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Calcium Imaging software	Till Photonics	LiveAcquisition v2.3.0.18
Carbogen tank	Air Liquide	Alphagaz mix B50	Gasmixture CO2/O2: 5/95, purity 5
Cluster microelectrode	FHC	CE2C55	https://www.fh-co.com/product/cluster-microelectrodes/
Culture dish (35 mm)	Corning Life Sciences	353001	https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2c/US/en/Cell-Culture/Cell-Culture-Vessels/Dishes%2C-Culture/Falcon®-Cell-Culture-Dishes/p/353001
Culture dish (90 mm)	Thermo Fisher Scientific	101VR20	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/101R20#/101R20
Curved forceps	Fine Science tools	11270-20	https://www.finescience.de/de-DE/Products/Forceps-Hemostats/Dumont-Forceps/Dumont-7b-Forceps/11270-20
D-AP5	hellobio	HB0225	https://www.hellobio.com/dap5.html
D-(+)-Glucose monohydrate	Sigma Aldrich	16301	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/16301?lang=en&region=BE
Digital CMOS camera	HAMAMATSU	ORCA-spark C11440-36U	https://www.hamamatsu.com/eu/en/product/type/C11440-36U/index.html
Dissection scissors	Fine Science tools	14058-09	https://www.finescience.de/de-DE/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-ToughCut®/14058-09
DNQX	hellobio	HB0262	https://www.hellobio.com/dnqx-disodium-salt.html
EMCCD camera	Andor	iXon TM + DU-897E-CSO-#BV	https://andor.oxinst.com/products/ixon-emccd-cameras?gclid=CjwKCAjw97P5BRBQEiwAGflV6ULsKjXfhN2YZxtvsWAmF4QghyXZKuqYHVMa6KU9JyS80ATQkSKeBBoCIM0QAvD_BwE
EPC10 USB Double Patch Clamp Amplifier	HEKA Elektronik	895278	https://www.heka.com/sales/brochures_down/bro_epc10usb.pdf
Filter paper	VWR	516-0818	grade 413
Fine brush	Raphael Kaerell	8204	Size #1
18G needle	Henke Sass Wolf Fine-Ject	18G X 1 1/2" 4710012040	https://www.henkesasswolf.de/cms/de/veterinaer_produkte/produkte_vet/einmalkanuelen/hsw_henke_ject_einmalkanuelen/
Isoflurane	Dechra Veterinary Products	Iso-Vet 1000mg/g	250 ml bottle
Loctite 406	Henkel Adhesive technologies	Loctite 406	Super glue
Magnesium sulfate heptahydrate	Merck	105886	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Magnesium-sulfate-heptahydrate,MDA_CHEM-105886?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Micromanipulator	Luigs & Neumann	SM-10 with SM-7 remote control system	https://www.luigs-neumann.org
Microscope (for calcium imaging)	Olympus	BX51WI	https://www.olympus-lifescience.com/de/microscopes/upright/bx61wi/
Microscope (for ephys recordings)	Zeiss	Axio Examiner.A1	https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/axio+examiner-axio+examiner.a1-aufrechte+mikroskope/10185/
Microscope light source	CAIRN Research	dual OptoLed power supply	https://www.cairn-research.co.uk/product/optoled/
Monochromator	Till Photonics	Polychrome V
N-Methyl-D-aspartic acid (NMDA)	Sigma Aldrich	M3262	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m3262?lang=en&region=BE
Oregon Green® 488 BAPTA-1	Invitrogen Molecular Probes	#06807	10x50ug
Osmometer	Wescor	5500 vapor pressure osmometer	to verify osmolarity of salt solutions
Peristaltic pump	Thermo Fisher Scientific	Masterflex C/L 77120-62	https://www.fishersci.be/shop/products/masterflex-peristaltic-c-l-dual-channel-pump-2/p-8004229
pH meter	WTW	inoLab series pH 720	https://www.geminibv.nl/wp-content/uploads/manuals/wtw-720-ph-meter/wtw-inolab-ph-720-manual-eng.pdf
Pipette puller	Sutter Instrument	P-1000	https://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-1000.html
Potassium chlorid	Chem-lab	CL00.1133	https://www.chem-lab.be/#/en-gb/prod/1393528
Potassium dihydrogen phosphate	Merck	104873	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Potassium-dihydrogen-phosphate,MDA_CHEM-104873?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Razor blade to prepare hemispheres	SPI supplies	Safety Cartridge Dispenser - Pkg/10	GEM Scientific Single Edge Razor Blades
Razor blade for vibratome	Ted Pella Inc	121-6	double edge breakable style razor blades (PTFE-coated stainless steel)
Recovery chamber	home made - Generic	N/A	to collect and store brain slices in (see details in manuscript)
Scissors	Any company	N/A	Blade should be well sharpened and at least 15 cm long for easy decapitation
Silver electrode wire	Any company		for recording and reference electrodes
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate	Merck	106342	https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Sodium-dihydrogen-phosphate-dihydrate,MDA_CHEM-106342?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Sodium hydrogen carbonate	Alfa Aesar	14707	https://www.alfa.com/en/catalog/014707/
Sodium chlorid	Fisher Scientific	S/3160/60	https://www.fishersci.co.uk/shop/products/sodium-chloride-certified-ar-analysis-meets-analytical-specification-ph-eur/10428420
Software for field recordings	HEKA Elektronik	PatchMaster	https://www.heka.com/downloads/software/manual/m_patchmaster.pdf
Spatula	Sigma Aldrich	S9147-12EA	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s9147?lang=en&region=BE
Stimulator	A.M.P.I	ISO-FLEX	http://www.ampi.co.il/isoflex.html
Sucrose	VWR International Ltd.	102745C	https://es.vwr-cmd.com/ex/downloads/magazine/lupc_userguide_uk.pdf
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 1	Warner Instruments	64-0167	Tygon tubing (TY-50) for standard valve systems
Tubing for carbogen, perfusion and suction lines 2	Fisher Scientific	800/100/200 & 800/100/280	Smiths Medical Portex Fine Bore LDPE Tubing
Vacuum pump	home made - Generic	N/A
8 valve multi-barrel perfusion system	home made	N/A	consists of barrels, tubing and a self-made automated valve control (specifications of all purchased parts can be found in this Table)
Magnetic valves (to control the perfusion lines)	NResearch Inc.	p/n 161P011	https://nresearch.com/
Vibratome	Leica	14912000001	Semi-automatic vibrating blade microomei VT1200
Water bath	Memmert	WNB 7	https://www.memmert.be/wp-content/uploads/2019/09/Memmert-Waterbath-WNB-7.en_.pdf
Water purification system	Merck	Synergy millipore	to obtain highly purified water
12-well plates	Greiner Bio-One	CELLSTAR, 665180	http://www.greinerbioone.com/UserFiles/File/Catalogue%202010_11/UK/3680_005-Kapitel1_UK.pdf