使用卡诺哈布迪炎埃莱甘斯识别 EGFR 和 RAS 抑制剂

摘要

基因可处理的线虫 卡诺哈布迪炎的叶原体 可以用作药物发现一个简单和廉价的模型。这里描述的是一个协议，以确定抗癌治疗，抑制RAS和EGFR蛋白的下游信号。

摘要

表皮生长因子受体（EGFR）及其下游效应器RAS的血浆膜定位变化与包括癌症在内的多种疾病有关。自由活的线虫 C.elegans 具有进化和功能保存的EGFR-RAS-ERK MAP信号级联，是外阴发育的核心。RAS同源LET-60和EGFR同源LET-23功能突变的增益诱导这些蠕虫的腹壁产生可见的非功能性异位伪外阴。以前，这些蠕虫中的多外阴（Muv）表型已被小化学分子抑制。在这里，我们描述了在液体基检测中使用蠕虫来识别消除EGFR和RAS蛋白活动的抑制剂的协议。通过此检测，我们显示 K-RAS 的间接抑制剂 R-fendiline 抑制 了在 let-60 （n1046） 和 让-23 （sa62） 突变蠕虫中表达的 Muv 表型。检测简单、价格低廉，设置不费时，可作为发现抗癌治疗的初始平台。

引言

调节生物体内发育事件的细胞通路在所有元子中都得到了高度保护。其中一个途径是EGFR-RAS-ERK线粒体活性蛋白激酶（MAPK）信号级联，这是控制细胞增殖、分化、迁移和生存^{的关键途径1，2。}此信号通路中的缺陷可能导致病理或疾病状态，如癌症。表皮生长因子受体（EGFR）在人类肿瘤中表现出高度表达，包括50%的口腔鳞状细胞癌，并有助于恶性肿瘤^3、4、5的发展。而三个RAS同位素H-，K-和N-RAS的突变是多种人类癌症恶性转化的主要驱动因素。在这三种RAS同位素中，K-RAS的致癌突变最为普遍，^{为6、7、8。}要使EGFR和RAS发挥作用，它们必须定位到等离子膜（PM）。防止这些分子的本地化到PM可以完全废除这个信号通路^9，10的生物活性。因此，抑制这些蛋白质的本地化到PM是一种治疗策略，以阻止下游信号和由此产生的不良后果。使用高含量筛选检测，芬迪林，L型钙通道阻滞剂，被确定为K-RAS活性的抑制剂^11。在芬迪林的存在下，K-RAS 到 PM 内部传单的纳米集群显著减少。此外，K-RAS从等离子体膜重新分配到内质视网膜（ER）、高尔吉仪器、内分泌体和细胞溶胶。更重要的是，胰腺癌、结肠癌、肺癌和子宫内膜癌细胞系的增殖被芬迪林¹¹抑制下游信号所阻断。这些数据表明，芬迪林作为一种特定的K-RAS抗癌疗法，导致RAS蛋白对PM的误定位。

线虫 卡诺哈布德炎埃莱甘斯 已在发展的背景下进行了广泛的研究。许多控制蠕虫发展的信号通路都是进化的，在功能上是保守的。例如，EGFR 介解 RAS 激活和随后激活的 ERK MAPK 信号级联在蠕虫¹²中保存。级联由以下蛋白质表示:LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 >MPK-1。LET-60 与 RAS 同源，而 LET-23 与 EGFR 同源。在蠕虫中，这种途径调节外阴¹³的发育。外阴是蠕虫腹壁上的上皮孔径，允许产卵。蠕虫外阴的形成取决于外阴前体细胞 （VPC） 暴露在 EGFR-RAS-MAPK 信号级联激活梯度下。在正常发育过程中，近亲VC从淋瑙锚细胞接收强信号，以分化成1°和2°细胞的命运，从而产生功能性外阴^12。而离散性VC区分成3°细胞的命运，融合到皮下同步，不会形成外阴由于耗尽的信号。在没有信号的情况下，所有 VPC 都区分为 3° 细胞命运，从而形成无外阴。然而，构成信号导致形成一个或多个非功能性外阴，由于所有VPC的诱导，以承担1°和2°细胞的命运。

导致外阴诱导缺陷或过度的突变已经为代表该通路的蛋白质编码的许多基因被识别出来。有缺陷的外阴诱导导致无外阴（Vul）表型，而过度的外阴诱导导致多外阴（Muv）表型，其表现是在整个心室壁上出现大量非功能性异位伪外阴。让-60（n1046）菌株表达的Muv表型是由于RAS功能突变的增加，而在让-23（sa62）菌株中，它是由于EGFR^14，15的激活突变。这些突变菌株中的强Muv表型已被药理干预所困扰，通过MEK-1抑制剂U0126 16、17治疗让-60（n1046）蠕虫就证明了这一^点。有趣的是，我们已经表明，R-芬迪林和抑制剂，影响苯丙胺代谢抑制在蠕虫¹⁸的Muv表型。为了证明这些抑制剂块让60信号在RAS的水平，林-1空菌株已被使用^17。Lin-1是一种类似Ets的抑制转录因子，在外阴¹⁹的发育中起到抑制作用。在让-60（n1046）蠕虫中，Muv表型的强烈回归，对lin-1空蠕虫没有影响，这表明这些抑制发生在RAS的水平。

在此协议中，我们演示了使用C. elegans作为模型来识别 RAS 和 EGFR 蛋白的抑制剂。使用液体基检测，我们通过抑制让-60（n1046）和让-23（sa62）突变菌株的C.elegans的Muv表型来证明R-芬迪林的抑制作用。这种检测验证了在抗癌治疗药物发现初始阶段使用C.elegans作为工具。

研究方案

1. 线虫生长介质 （NGM） 板准备

1. 在 2 L 埃伦迈尔烧瓶中加入 2.5 克辣椒和 3 克 NaCl 到 970 mL 的去离子水。使用磁搅拌棒搅拌内容。此后，在烧瓶中加入20克醋。在 121 °C 和 15 磅/在² 的压力下将烧瓶的含量高压 30 分钟。消毒后，将烧瓶放在搅拌盘上，让中等温度冷却至 50 °C。
2. 要准备 NGM 板，请在冷却介质中添加以下试剂:25 mL 的 1 M 磷酸钾缓冲器 （pH = 6.0），1 mL 的 1 M MgSO_4，1mL 的 1 M CaCl_2，1 mL （5 毫克/毫升在 95% 乙醇） 胆固醇， 1 mL（乙醇中10%v/w）尼他汀，1 mL 25毫克/mL链霉素。
3. 在层压流下，将冷却的介质倒入 60 mm x 15 mm 无菌培养皿中。让板凝固 2 小时。这些板可以在4°C下保存1个月。

2. 传播 C.埃莱根斯

1. 将 100 μL 隔夜生长的 大肠杆菌 OP50 点到每个 NGM 板的中心，让板在层压罩中干燥 24 小时。随后，这些板可以储存在聚苯乙烯容器中。
   注: 大肠杆菌 OP50培养在板播种前生长在卢里亚-贝尔塔尼 （LB）介质的37°C介质中。培养植物可以在4°C下储存1~2个月，用于板的定期播种。
2. 使用无菌蠕虫采摘，在解剖显微镜下从以前生长的盘子中收集 10/12 重力成年蠕虫。将这些蠕虫转移到新鲜的 NGM 板中，用 大肠杆菌 OP50 播种，并在 20 °C 下孵育板 24 小时。
3. 24小时后，使用无菌蠕虫采摘从板中去除成年蠕虫。在 20 °C 下孵育板 3 天。胚胎会发育成重力成年蠕虫。

3. 准备同步 的 C. 埃莱根斯 文化

1. 通过用 M9W 清洗 2 到 4 个盘子，将重力成年蠕虫收集到 15 mL 圆锥管中。
   1. M9W 的准备:溶解 5 克 NaCl，6 克 Na₂HPO_4，3克 KH₂PO₄在去离子水中溶解到最终体积为 1 L. 自动清洁溶液在 121 °C 在 15 磅/在²的压力 30 分钟。在冷却溶液中加入 1 mL 的 1 M MgSO_4。
2. 通过在 450 x g 下离心 1 分钟来对蠕虫进行离心。在不干扰蠕虫颗粒的情况下对超强的超强体进行排泄。
3. 将 400 μL 的 8.25% 次氯酸钠（家用漂白剂）和 5 N NaOH 的 100 μL 组合在一起，准备蠕虫裂解溶液。将此溶液添加到蠕虫颗粒中，然后轻拂管子以混合管子中的内容。通过在解剖显微镜下观察蠕虫的裂解，防止管内胚胎过度出血。
4. 在锥形管中加入 10 mL 的 M9W，当 70% 的成年蠕虫裂解时稀释裂解混合物。
5. 以 450 x g 离心管 1 分钟。用 10 mL 的 M9W 替换超高纳特。
6. 重复步骤 3.5 两次。
7. 完成洗涤步骤后，加入 3/5 mL 的 M9W 以重新悬念蛋丸。在室温下（RT）以18转速在管旋转器上旋转管子过夜。
8. 过夜孵化后，从旋转器中取出管子，以 450 x g 离心 1 分钟离心将 L1 幼虫颗粒化。将 M9W 吸气至 250 μL 留在管中。
9. 摇动管子以重新使用幼虫。将三滴含有幼虫的 5 微升滴加入培养皿盖上。使用解剖显微镜计算每滴蠕虫的数量，并确定 1 μL 中的蠕虫数量。

4. 药物检测的准备

注:此检测中的步骤显示在 图 1中。

1. 在 50 mL 圆锥形管中生长 30 mL 大肠杆 菌 OP50，在 150 rpm 的轨道摇床中在 37 °C 的夜间生长。
2. 旋转一夜之间生长 大肠杆菌 OP50培养在4000 x g 10分钟颗粒细胞。取出超高颗粒，在 M9W 的 3 mL 中重新使用颗粒以集中培养物。
3. 在为药物检测准备工作解决方案之前，在 100 mL 的 M9W 中加入 0.1 mL（95% 乙醇中的 5 毫克/毫升）胆固醇。
4. 通过稀释每种药物加车辆（二甲基硫氧化物）来准备每个实验药物的工作解决方案:DMSO）在4.8ml M9W补充胆固醇，以获得适当的浓度。溶解 DMSO 在 4.8 mL 的 M9W 补充胆固醇，以准备车辆控制。
5. 在每个含有车辆控制或药物和漩涡管的管中加入 200 μL 浓缩 大肠杆菌 OP50 培养物，以确保它们混合。
6. 要执行实验，在 12 井组织培养板中将每个工作药物溶液或车辆控制中的 2 mL 添加到每个井中。重复测试每个药物浓度和车辆控制。
7. 使用无菌微管添加每口井 100 L1 幼虫（参见同步 C. elegans 培养步骤）。将蠕虫体积限制在 10 μL 以内。
8. 在 20 °C 下孵育板。
9. 如果需要，在检测的第 3 天用 50 微升 10 倍浓缩 大肠杆菌 OP50 补充井。

5. 为显微镜准备的阿加罗斯垫

1. 在 5 mL 的去离子水中溶解 0.1 克藻醇，准备 2% 的葡萄糖 w/v 溶液。加热微波炉中的内容以溶解藻子。20 张幻灯片可以从 5 mL 的阿加罗斯溶液中准备。
2. 将实验室胶带条沿两个玻璃幻灯片放置。胶带将充当隔板，限制玫瑰垫的厚度。之后，在带胶带的幻灯片之间放置第三个干净的玻璃滑梯。
3. 要制作一个玫瑰垫，将 100 μL 的熔融玫瑰点到干净的滑梯中心。将另一个干净的玻璃滑梯穿过，放在玫瑰的顶部，轻轻向下按压以形成垫子。当垫子凝固时，移除顶部滑动。

6. 观察 让-60、让-23和林-1 菌株中的Muv表型

注:只有候选药物，抑制Muv表型在 let-23 和 让-60 菌株将使用 林-1 菌株进行检测，以确定抑制是否发生在RAS或EGFR的水平。

1. 当达到生命周期的适当阶段（让-60和让-23菌株3天，林-1菌株5天），从孵化器中取出板。并使用移液器在 15 mL 圆锥管中收集蠕虫。
2. 以 450 x g 离心管 1 分钟。移除 M9W 而不干扰蠕虫颗粒，并添加 5 mL 的新鲜 M9W。
3. 重复步骤 6.2 两次。
4. 在不干扰蠕虫颗粒的情况下，通过吸入去除所有剩余的 M9W。此后，加入 500 μL 的 2 mM 钠阿齐德或 2 mM 四米盐酸四米索。允许管子在RT孵育15分钟2mM钠阿齐德或2mM四米盐酸四米索将麻醉蠕虫成像。
   注意:在处理钠阿齐德时，一定要佩戴个人防护装备 （PPE）。解决方案必须在化学罩下准备。
5. 将麻醉蠕虫悬架的 10 μL 添加到玫瑰垫的中心。将#1.5 盖片轻轻放在蠕虫悬架上。如果需要，用指甲油固定盖唇，以防止干燥。
6. 使用DIC显微镜观察让-60（n1046），让-23（sa62）和林-1（sy254）菌株。在 10 倍和 20 倍放大倍数下对蠕虫进行成像。
7. 对于 让 60 （n1046） 和 让 23 （sa62）， 根据 Muv 表型的存在或不存在给成年蠕虫打分。而对于 lin-1 菌株，使用高分辨率DIC显微镜计算L4幼虫腹侧采用1°或2°细胞命运的VPC数量。
8. 在为每个菌株和药物治疗评分后，执行学生 t 测试，以确定治疗之间的统计差异。

结果

我们首先证明，与DMSO治疗的蠕虫相比，R-fendiline能够抑制 让-60（n1046） 突变菌株中的Muv表型。我们的数据显示，R-芬迪林能够以依赖剂量的方式阻断 让-60（n1046） 中的Muv表型（图2A，B）。然而，在 林-1 空突变菌株中观察到Muv表型的未逆转，以响应R-芬迪林浓度的增加（图2B）。数据表明，R-芬迪林块激活 让60 信?...

讨论

我们描述使用蠕虫的检测是简单和廉价的，以确定EGFR和RAS功能的抑制剂。 C. elegans 是药物发现有吸引力的模型，因为由于生命周期短（3 天在 20 °C）和产生大量幼虫的能力，在实验室中很容易生长。更重要的是，EGFR-RAS-ERK MAPK通路在进化和功能上得到保护，哺乳动物提供了一个基因可传导系统来分析EGFR和RAS抑制剂的影响。此外，蠕虫的透明性使研究者能够可视化不同的结构，以及绿色荧光...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Millipore Sigma	A9539-50G
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendiline			Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide	Millipore Sigma	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite			Bleach
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride	Millipore Sigma	L9756
UO126 (MEK inhibitor)	Millipore Sigma	19-147
Consumables
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL	Fisher Scientific	07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	50-197-4804
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
MT2124	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC