Identificazione di inibitori EGFR e RAS utilizzando Caenorhabditis elegans

Riepilogo

Il nematode geneticamente trattabile Caenorhabditis elegans può essere utilizzato come modello semplice ed economico per la scoperta di farmaci. Qui è descritto un protocollo per identificare terapie antitumorali che inibiscono la segnalazione a valle delle proteine RAS ed EGFR.

Abstract

I cambiamenti nella localizzazione della membrana plasmatica del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) e del suo effettore a valle RAS sono stati implicati in diverse malattie tra cui il cancro. Il nematode C. elegans a vita libera possiede una cascata di segnali EGFR-RAS-ERK MAP evolutivamente conservata e funzionalmente conservata che è centrale per lo sviluppo della vulva. Le mutazioni di guadagno di funzione nell'omologo RAS LET-60 e nell'omologo EGFR LET-23 inducono la generazione di pseudovulva ectopica non funzionale visibile lungo la parete corporea ventrale di questi vermi. In precedenza, il fenotipo multivulvale (Muv) in questi vermi ha dimostrato di essere inibito da piccole molecole chimiche. Qui descriviamo un protocollo per l'utilizzo del worm in un test a base liquida per identificare gli inibitori che aboliscono le attività delle proteine EGFR e RAS. Usando questo test, mostriamo che la R-fendilina, un inibitore indiretto di K-RAS, sopprime il fenotipo Muv espresso nei vermi mutanti let-60(n1046) e let-23(sa62). Il test è semplice, poco costoso, non richiede molto tempo per l'installazione e può essere utilizzato come piattaforma iniziale per la scoperta di terapie antitumorali.

Introduzione

Le vie cellulari che regolano gli eventi di sviluppo all'interno degli organismi sono altamente conservate tra tutti i metazoi. Una di queste vie è la cascata di segnalazione della proteina chinasi attivata dal mitogeno EGFR-RAS-ERK (MAPK) che è una via critica che governa la proliferazione cellulare, la differenziazione, la migrazione e la sopravvivenza^1,2. I difetti in questa via di segnalazione possono portare a stati patologici o patologici come il cancro. Il recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) ha dimostrato di essere altamente espresso nei tumori umani, tra cui il 50% dei carcinomi a cellule squamose orali, e contribuisce allo sviluppo di tumori maligni^3,4,5. Mentre le mutazioni nelle tre isoforme RAS H-, K- e N-RAS sono i principali driver per la trasformazione maligna in più tumori umani. Tra queste tre isoforme RAS, le mutazioni oncogeniche in K-RAS sono più diffuse^6,7,8. Affinché EGFR e RAS funzionino, devono localizzarsi sulla membrana plasmatica (PM). Prevenire la localizzazione di queste molecole al PM può abrogare completamente l'attività biologica di questa via di segnale^9,10. Quindi l'inibizione della localizzazione di queste proteine al PM è una strategia terapeutica per bloccare la segnalazione a valle e i conseguenti esiti avversi. Utilizzando un test di screening ad alto contenuto, la fendilina, un bloccante dei canali del calcio di tipo L, è stata identificata come un inibitore dell'attività K-RAS¹¹. La nanoclustering di K-RAS al foglietto interno del PM è significativamente ridotta in presenza di fendilina. Inoltre, K-RAS viene ridistribuito dalla membrana plasmatica al reticolo endoplasmatico (ER), all'apparato di Golgi, agli endosomi e al citosol. Ancora più importante, la proliferazione delle linee cellulari tumorali pancreatiche, del colon, del polmone e dell'endometrio che esprimono il mutante oncogenico K-RAS è bloccata dall'inibizione della segnalazione a valle da parte della fendilina¹¹. Questi dati suggeriscono che la fendilina funziona come una specifica terapia antitumorale K-RAS che causa l'errata localizzazione della proteina RAS al PM.

Il nematode Caenorhabditis elegans è stato ampiamente studiato nel contesto dello sviluppo. Molte delle vie del segnale che governano lo sviluppo nel worm sono evolutive e funzionalmente conservate. Ad esempio, l'attivazione mediata da EGFR di RAS e la successiva attivazione della cascata di segnali ERK MAPK sono conservate nel worm¹². La cascata è rappresentata dalle seguenti proteine: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 è omologo a RAS, mentre LET-23 è omologo a EGFR. Nel verme, questo percorso regola lo sviluppo della vulva¹³. La vulva è un'apertura epiteliale sulla parete del corpo ventrale del verme che consente di depostare le uova fecondate. La formazione della vulva nel worm dipende dall'esposizione delle cellule precursori vulvari (VPC) a un gradiente di attivazione della cascata di segnali EGFR-RAS-MAPK. Durante il normale sviluppo, i VPC prossimali ricevono forti segnali dalle cellule di ancoraggio gonadiche per differenziarsi in destini cellulari di 1° e 2° che danno origine a una vulva funzionale^12. Mentre i VPC distali si differenziano in destini cellulari 3° che si fondono con il sincizio ipodermico e non formano la vulva a causa della segnalazione impoverita. In assenza di segnalazione, tutte le VPC si differenziano in destini cellulari 3° con conseguente formazione di nessuna vulva. Tuttavia, la segnalazione costitutiva porta alla formazione di una o più vulve non funzionali a causa dell'induzione di tutti i VPC ad assumere destini cellulari di 1° e 2°.

Mutazioni che causano un'induzione vulvale difettosa o eccessiva sono state identificate per molti dei geni che codificano per le proteine che rappresentano questa via. L'induzione vulvale difettosa provoca un fenotipo vulvaless (Vul), mentre un'eccessiva induzione vulvare si traduce in un fenotipo multivulva (Muv) che è rappresentato dallo sviluppo di numerose pseudovulve ectopiche non funzionali in tutta la parete del corpo ventrale. Il fenotipo Muv espresso dal ceppo let-60(n1046) è dovuto ad una mutazione gain of function in RAS, mentre nel ceppo let-23(sa62) è dovuto ad una mutazione attivante in EGFR^14,15. Il fenotipo Muv forte in questi ceppi mutanti ha dimostrato di essere perturbato da interventi farmacologici come dimostrato dal trattamento dei vermi let-60(n1046) con l'inibitore MEK-1 U0126^16,17. È interessante notare che abbiamo dimostrato che R-fendilina e inibitori che influenzano il metabolismo della sfingomielina sopprimono il fenotipo Muv nel verme¹⁸. Per dimostrare che questi inibitori bloccano la segnalazione let-60 a livello di RAS, il ceppo nullo lin-1 è stato utilizzato¹⁷. Lin-1 è un fattore di trascrizione inibitorio simile a Ets che funziona come un repressore nello sviluppo della vulva¹⁹. La forte inversione del fenotipo Muv nei vermi let-60(n1046) e nessun effetto sui vermi nulli lin-1 suggeriscono che queste inibizioni si verificano a livello di RAS.

In questo protocollo, dimostriamo l'uso di C. elegans come modello per identificare inibitori delle proteine RAS ed EGFR. Utilizzando un test a base liquida, dimostriamo gli effetti inibitori della R-fendilina sopprimendo i fenotipi Muv nei ceppi mutanti let-60(n1046) e let-23(sa62) di C. elegans. Questo test convalida l'uso di C. elegans come strumento nella fase iniziale della scoperta di farmaci per terapie antitumorali.

Protocollo

1. Preparazione della piastra del mezzo di crescita dei nematodi (NGM)

1. Aggiungere 2,5 g di peptone e 3 g di NaCl a 970 ml di acqua deionizzata contenuta in un matraccio Erlenmeyer da 2 L. Mescolare il contenuto usando una barra di agitazione magnetica. Successivamente, aggiungere 20 g di agar al matraccio. Autoclave il contenuto del matraccio a 121 °C e una pressione di 15 lb/in² per 30 min. Dopo la sterilizzazione, posizionare il matraccio su una piastra di agitazione e lasciare raffreddare il mezzo fino a quando la temperatura raggiunge i 50 °C.
2. Per preparare le piastre NGM aggiungere i seguenti reagenti al mezzo raffreddato: 25 mL di tampone fosfato di potassio 1 M (pH = 6,0), 1 mL di 1 M MgSO₄, 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di colesterolo (5 mg/mL in etanolo al 95%), 1 mL di (10% v/p in etanolo) nistatina e 1 mL di 25 mg/mL di streptomicina.
3. Sotto un flusso laminare, versare il mezzo raffreddato in piastre di Petri sterili da 60 mm x 15 mm. Lasciare solidificare le piastre per 2 ore. Queste piastre possono essere conservate per 1 mese a 4 °C.

2. Propagazione di C. elegans

1. Individuare 100 μL di E. coli OP50 coltivato durante la notte sul centro di ciascuna piastra NGM e lasciare asciugare le piastre per 24 ore in una cappa laminare. Successivamente, le piastre possono essere conservate in un contenitore di polistirolo.
   NOTA: La coltura di E. coli OP50 viene coltivata in mezzi Luria-Bertani (LB) a 37 °C prima della semina delle lastre. La coltura può essere conservata a 4 °C per 1-2 mesi e utilizzata per la semina periodica dei piatti.
2. Usando un worm pick sterile, raccogli 10-12 vermi adulti gravidi da una piastra precedentemente coltivata sotto un microscopio di dissezione. Trasferire questi vermi in una piastra NGM fresca seminata con E. coli OP50 e incubare la piastra per 24 ore a 20 °C.
3. Dopo 24 ore, utilizzando un worm-pick sterile rimuovere i vermi adulti dalle piastre. Incubare le piastre a 20 °C per ~ 3 giorni. Gli embrioni si svilupperanno in vermi adulti gravidi.

3. Preparazione di una coltura sincrona di C. elegans

1. Raccogliere vermi adulti gravidi in un tubo conico da 15 ml lavando 2-4 piastre con M9W.
   1. Preparazione di M9W: Sciogliere 5 g di NaCl, 6 g di Na₂HPO₄e 3 g di KH₂PO₄ in acqua deionizzata ad un volume finale di 1 L. Autoclave la soluzione a 121 °C ad una pressione di 15 lb/in² per 30 min. Aggiungere 1 mL di 1 M MgSO 4 alla_soluzione raffreddata.
2. Pellet i vermi centrifugando il tubo a 450 x g per 1 min. Decantare il surnatante senza disturbare il pellet di verme.
3. Preparare la soluzione di lisi worm combinando 400 μL di ipoclorito di sodio all'8,25% (candeggina domestica) e 100 μL di 5 N NaOH. Aggiungere questa soluzione al pellet a vite senza fine e far scorrere il tubo per mescolare il contenuto del tubo. Prevenire l'overbleaching degli embrioni nel tubo osservando la lisi dei vermi al microscopio sezionante.
4. Aggiungere 10 ml di M9W al tubo conico per diluire la miscela di lisi quando il 70% dei vermi adulti si è sciolto.
5. Centrifugare il tubo a 450 x g per 1 min. Sostituire il surnatante con 10 mL di M9W.
6. Ripetere il passaggio 3.5 due volte.
7. Dopo aver completato le fasi di lavaggio, aggiungere 3-5 ml di M9W per risusciere il pellet di uova. Ruotare il tubo durante la notte ad una velocità di 18 giri / min su un rotatore di tubi a temperatura ambiente (RT).
8. Dopo l'incubazione notturna, rimuovere il tubo dal rotatore, pellet le larve L1 centrifugando il tubo a 450 x g per 1 min. Aspirare l'M9W fino a quando 250 μL non viene lasciato nel tubo.
9. Agitare il tubo per risuspediare le larve. Aggiungere tre gocce da 5 μL contenenti le larve su un coperchio della capsula di Petri. Utilizzando un microscopio sezionante contare il numero di vermi in ogni goccia e determinare il numero di vermi in 1 μL.

4. Preparazione di saggi farmacologici

NOTA: i passaggi di questo test sono illustrati nella Figura 1.

1. Coltivare 30 mL di E. coli OP50 in un tubo conico da 50 mL a 37 °C durante la notte in uno shaker orbitale a 150 giri/min.
2. Spin durante la notte coltivato E. coli OP50 coltura a 4.000 x g per 10 minuti per pellettizzare le cellule. Rimuovere il surnatante e risusciere il pellet in 3 mL di M9W per concentrare la coltura.
3. Prima di preparare le soluzioni di lavoro per il test del farmaco, aggiungere 0,1 ml di colesterolo (5 mg / mL in etanolo al 95%) in 100 ml di M9W.
4. Preparare soluzioni di lavoro di ciascun farmaco sperimentale diluendo ogni farmaco più veicolo (dimetilsolfossido; DMSO) in 4,8 mL M9W integrato con colesterolo per ottenere le concentrazioni appropriate. Sciogliere il DMSO in 4,8 ml di M9W integrato con colesterolo per preparare il controllo del veicolo.
5. Aggiungere 200 μL di coltura concentrata di E. coli OP50 a ciascun tubo contenente il controllo del veicolo o farmaci e tubi a vortice per assicurarsi che siano miscelati.
6. Per eseguire l'esperimento, aggiungere 2 ml di ogni soluzione farmacologica funzionante o controllo del veicolo a ciascun pozzetti in una piastra di coltura tissutale a 12 pozzetti. Testare ogni concentrazione di farmaco e il controllo del veicolo in duplice copia.
7. Aggiungere ~ 100 larve L1 per pozzetti (vedere fasi di coltura sincrona di C. elegans) usando una micropipetta sterile. Limitare il volume dei vermi a 10 μL.
8. Incubare le piastre a 20 °C.
9. Integrare i pozzeli con 50 μL di 10x concentrato E. coli OP50 il giorno 3 del test, se necessario.

5. Preparazione del tampone di agarose per microscopia

1. Preparare una soluzione di agarose al 2% p/v sciogliendo 0,1 g di agarose in 5 ml di acqua deionizzata. Riscaldare il contenuto in un forno a microonde per sciogliere l'agarose. 20 diapositive possono essere preparate da 5 ml di soluzione di agarose.
2. Posizionare strisce di nastro da laboratorio lungo due vetrini. Il nastro fungerà da distanziali limitando lo spessore dei cuscinetti di agarose. Successivamente, posizionare una terza diapositiva di vetro pulita tra le diapositive nastrate.
3. Per creare un tampone di agarose, individuare 100 μL di agarose fuso al centro del vetrino pulito. Posizionare un altro vetrino pulito attraverso e sopra l'agarose e premere delicatamente verso il basso per formare un pad. Rimuovere la diapositiva superiore quando il pad si è solidificato.

6. Osservazione del fenotipo Muv nei ceppi let-60, let-23 e lin-1

NOTA: Solo i farmaci candidati che sopprimono i fenotipi Muv nei ceppi let-23 e let-60 saranno analizzati utilizzando il ceppo lin-1 per determinare se l'inibizione si verifica a livello di RAS o EGFR.

1. Quando viene raggiunta la fase appropriata del ciclo di vita (3 giorni per i ceppi let-60 e let-23, 5 giorni per il ceppo lin-1), rimuovere le piastre dall'incubatore. e raccogliere i vermi in tubi conici da 15 ml utilizzando una pipetta.
2. Centrifugare i tubi a 450 x g per 1 min. Rimuovere M9W senza disturbare il pellet a vite senza fine e aggiungere 5 mL di M9W fresco.
3. Ripetere il passaggio 6.2 due volte.
4. Senza disturbare il pellet di verme, rimuovere tutti i rimanenti M9W per aspirazione. Successivamente, aggiungere 500 μL di 2 mM di azide di sodio o 2 mM di tetramisolo cloridrato. Consentire ai tubi di incubare a RT per 15 min. 2 mM di azide di sodio o 2 mM di tetramisolo cloridrato anestetizzeranno i vermi per l'imaging.
   ATTENZIONE: Assicurarsi di indossare dispositivi di protezione individuale (DPI) quando si maneggia l'azide di sodio. La soluzione deve essere preparata sotto un cappuccio chimico.
5. Aggiungere 10 μL della sospensione di verme anestetizzata al centro di un tampone di agarosio. Posizionare delicatamente una #1,5 sulla sospensione del verme. Se necessario, fissare il coperchio con un po 'di smalto per evitare che si secchi.
6. Utilizzare un microscopio DIC per osservare i ceppi let-60(n1046), let-23(sa62) e lin-1(sy254). Immagina i vermi agli ingrandimenti 10x e 20x.
7. Per let-60(n1046) e let-23(sa62), segnare i vermi adulti in base alla presenza o all'assenza del fenotipo Muv. Mentre per il ceppo lin-1, contare il numero di VPC che hanno adottato destini cellulari di 1° o 2° sul lato ventrale delle larve L4 utilizzando un microscopio DIC ad alta risoluzione.
8. Dopo aver ottenuto il punteggio delle micrografie per ogni ceppo e trattamento farmacologico, eseguire il t-testdello studente per determinare le differenze statistiche tra i trattamenti.

Risultati

Per prima cosa dimostriamo che la R-fendilina è in grado di sopprimere il fenotipo Muv nel ceppo mutante let-60 (n1046) rispetto ai vermi trattati con DMSO. I nostri dati mostrano che la R-fendilina è in grado di bloccare il fenotipo Muv nel let-60(n1046) in modo dose-dipendente (Figura 2A,B). Tuttavia, la non inversione del fenotipo Muv è stata osservata nel ceppo mutante nullo lin-1 in risposta all'aumento delle concentrazioni di R-fendilina (...

Discussione

I saggi che descriviamo usando il worm sono semplici e poco costosi per identificare gli inibitori della funzione EGFR e RAS. C. elegans è un modello interessante per la scoperta di farmaci perché è facile da coltivare in laboratorio a causa del breve ciclo di vita (3 giorni a 20 ° C) e della capacità di generare un gran numero di larve. Ancora più importante, il percorso EGFR-RAS-ERK MAPK è evolutivamente e funzionalmente conservato con mammiferi che forniscono un sistema geneticamente trattabile per ana...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Millipore Sigma	A9539-50G
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendiline			Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide	Millipore Sigma	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite			Bleach
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride	Millipore Sigma	L9756
UO126 (MEK inhibitor)	Millipore Sigma	19-147
Consumables
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL	Fisher Scientific	07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	50-197-4804
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
MT2124	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC