Идентификация ингибиторов EGFR и RAS с использованием Caenorhabditis elegans

Резюме

Генетически поддающегося нематоде Caenorhabditis elegans можно использовать в качестве простой и недорогой модели для открытия лекарств. Здесь описан протокол для идентификации противоопухолевых терапевтических средств, которые ингибируют нисходящую передачу сигналов белков RAS и EGFR.

Аннотация

Изменения в локализации плазматической мембраны рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и его последующего эффектора RAS были вовлечены в несколько заболеваний, включая рак. Свободноживущая нематода C. elegans обладает эволюционным и функционально сохраненным сигнальным каскадом EGFR-RAS-ERK MAP, который является центральным для развития вульвы. Усиление функциональных мутаций в гомологе RAS LET-60 и гомологе EGFR LET-23 индуцирует генерацию видимой нефункциональной эктопической псевдовульвы вдоль стенки вентрального тела этих червей. Ранее было показано, что фенотип мультивульвала (Muv) у этих червей ингибируется небольшими химическими молекулами. Здесь мы описываем протокол использования червя в жидкостном анализе для выявления ингибиторов, которые отменяют активность белков EGFR и RAS. Используя этот анализ, мы показываем, что R-фендилин, косвенный ингибитор K-RAS, подавляет фенотип Muv, экспрессируемый у мутантных червей let-60(n1046) и let-23(sa62). Анализ прост, недорог, не занимает много времени для настройки и может быть использован в качестве первоначальной платформы для открытия противоопухолевых терапевтических средств.

Введение

Клеточные пути, которые регулируют события развития внутри организмов, высоко сохраняются среди всех метазоанов. Одним из таких путей является сигнальный каскад EGFR-RAS-ERK, активированный митогеном протеинкиназой (MAPK), который является критическим путем, который управляет пролиферацией, дифференцировкой, миграцией и выживанием клеток^1,2. Дефекты в этом сигнальном пути могут привести к патологическим или болезненным состояниям, таким как рак. Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) показал высокую экспрессию в опухолях человека, включая 50% плоскоклеточных карцином полости рта, и способствует развитию злокачественных опухолей^3,4,5. Принимая во внимание, что мутации в трех изоформах RAS H-, K- и N-RAS являются основными факторами злокачественной трансформации при множественных раковых заболеваниях человека. Среди этих трех изоформ RAS наиболее распространены онкогенные мутации в K-RAS^6,7,8. Чтобы EGFR и RAS функционировали, они должны локализоваться на плазматической мембране (PM). Предотвращение локализации этих молекул к ТЧ может полностью отменить биологическую активность этого сигнального пути^9,10. Следовательно, ингибирование локализации этих белков в ТЧ является терапевтической стратегией для блокирования нисходящей передачи сигналов и возникающих в результате неблагоприятных исходов. С помощью скринингового анализа с высоким содержанием фендилин, блокатор кальциевых каналов L-типа, был идентифицирован как ингибитор активности K-RAS^11. Нанокластерие K-RAS на внутренний листок ТЧ значительно снижается в присутствии фендилина. Кроме того, K-RAS перераспределяется от плазматической мембраны к эндоплазматическому ретикулуму (ER), аппарату Гольджи, эндосомам и цитозолу. Что еще более важно, пролиферация клеточных линий рака поджелудочной железы, толстой кишки, легких и эндометрия, экспрессировающих онкогенный мутант K-RAS, блокируется ингибированием нисходящей передачи сигналов фендилином^11. Эти данные свидетельствуют о том, что фендилин функционирует как специфический противоопухолевый препарат K-RAS, который вызывает неправильную локализацию белка RAS в PM.

Нематода Caenorhabditis elegans была широко изучена в контексте развития. Многие из сигнальных путей, которые управляют развитием червя, являются эволюционными и функционально сохраненными. Например, опосредоваемая EGFR активация RAS и последующая активация сигнального каскада ERK MAPK сохраняется в черве^12. Каскад представлен следующими белками: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 гомологична RAS, в то время как LET-23 гомологична EGFR. У червя этот путь регулирует развитие вульвы^13. Вульва представляет собой эпителиальное отверстие на стенке вентрального тела червя, которое позволяет откладывать оплодотворенные яйца. Формирование вульвы у червя зависит от воздействия на клетки-предшественники вульвы (VPC) градиента активации сигнального каскада EGFR-RAS-MAPK. Во время нормального развития проксимальные VPC получают сильные сигналы от клеток гонадного якоря для дифференцировки в 1° и 2° клеточных судеб, которые дают начало функциональной вульве^12. В то время как дистальные VPC дифференцируются в 3° клеточные судьбы, которые сливаются с подкожным синцитием и не образуют вульву из-за истощения сигналов. При отсутствии сигнализации все VPC дифференцируются в 3° клеточные судьбы, что приводит к образованию вульвы. Однако конститутивная сигнализация приводит к образованию одной или нескольких нефункциональных вульв из-за индукции всех VPC предполагать судьбы клеток 1° и 2°.

Мутации, которые вызывают дефектную или чрезмерную индукцию вульвы, были идентифицированы для многих генов, которые кодируют белки, представляющие этот путь. Дефектная индукция вульвы приводит к фенотипу без вульвы (Vul), в то время как чрезмерная индукция вульвы приводит к фенотипу мультивульвы (Muv), который представлен развитием многочисленных нефункциональных эктопических псевдовульв по всей стенке вентрального тела. Фенотип Muv, экспрессируемый штаммом let-60(n1046), обусловлен усилением мутации функции в RAS, в то время как у штамма let-23(sa62) он обусловлен активирующей мутацией в EGFR^14,15. Было показано, что сильный фенотип Muv в этих мутантных штаммах возмущается фармакологическими вмешательствами, как продемонстрировано лечением червей let-60(n1046) ингибитором MEK-1 U0126^16,17. Интересно, что мы показали, что R-фендилин и ингибиторы, влияющие на метаболизм сфингомиелина, подавляют фенотип Muv у червя^18. Для демонстрации этих ингибиторов блока передачи сигналов let-60 на уровне RAS был использован нулевой штамм lin-1 ^17. Lin-1 является Ets-подобным ингибирующим фактором транскрипции, который функционирует как репрессор в развитии вульвы^19. Сильная реверсия фенотипа Muv у червей let-60(n1046) и отсутствие влияния на нулевых червей lin-1 позволяют предположить, что эти ингибирования происходят на уровне RAS.

В этом протоколе мы демонстрируем использование C. elegans в качестве модели для идентификации ингибиторов белков RAS и EGFR. Используя жидкостный анализ, мы демонстрируем ингибирующие эффекты R-фендилина путем подавления фенотипов Muv в мутантных штаммах let-60(n1046) и let-23(sa62) C. elegans. Этот анализ подтверждает использование C. elegans в качестве инструмента на начальном этапе открытия лекарств для противоопухолевой терапии.

протокол

1. Подготовка пластины среды роста нематоды (NGM)

1. Добавьте 2,5 г пептона и 3 г NaCl к 970 мл деионизированной воды, содержащейся в 2-м лиле колбы Эрленмейера. Перемешайте содержимое с помощью магнитного перемешивания. После этого добавьте в колбу 20 г агарова. Автоклав содержимого колбы при 121 °C и давлении 15 фунтов/в² в течение 30 мин. После стерилизации поместите колбу на перемешиваемую пластину и дайте среде остыть до тех пор, пока температура не достигнет 50 °C.
2. Для приготовления пластин NGM добавляют в охлаждаемую среду следующие реагенты: 25 мл 1 М калийфосфатного буфера (рН = 6,0), 1 мл 1 М МгСО_4,1 мл 1 М CaCl_2,1 мл (5 мг/мл в 95% этаноле) холестерина, 1 мл (10% v/w в этаноле) нистатина и 1 мл 25 мг/мл стрептомицина.
3. Под ламинарной струей перелейте охлажденный носитель в стерильные чашки Петри 60 мм х 15 мм. Дайте пластинам затвердеть в течение 2 ч. Эти пластины можно хранить в течение 1 месяца при 4 °C.

2. Размножение C. elegans

1. Нанесите 100 мкл выращенной на ночь E. coli OP50 на центр каждой пластины NGM и дайте пластинам высохнуть в течение 24 ч в ламинарной вытяжке. Впоследствии пластины можно хранить в полистирольной таре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Культуру E. coli OP50 выращивают в среде Luria-Bertani (LB) при 37 °C до посева пластин. Культуру можно хранить при 4 °C в течение 1–2 месяцев и использовать для периодического посева пластин.
2. Используя стерильную червячную кирку, соберите 10-12 взрослых червей с ранее выращенной пластины под рассекающим микроскопом. Переложите этих червей на свежую пластину NGM, засеянное E. coli OP50, и инкубируют пластину в течение 24 ч при 20 °C.
3. Через 24 ч с помощью стерильной червячной кирки удаляют взрослых червей с пластин. Инкубировать пластины при 20 °C в течение ~ 3 дней. Эмбрионы будут развиваться в гравидных взрослых червей.

3. Подготовка синхронной культуры C. elegans

1. Соберите взрослых червей в коническую трубку 15 мл, промыв 2–4 пластины M9W.
   1. Приготовление M9W: Растворить 5 г NaCl, 6 г Na₂HPO₄и 3 г KH₂PO₄ в деионизированной воде до конечного объема 1 л. Автоклав раствора при 121 °C при давлении 15 фунтов/в² в течение 30 мин. Добавить 1 мл 1 М МгСО₄ в охлажденный раствор.
2. Гранулируют червей центрифугированием в трубке при 450 х г в течение 1 мин. Декантирование супернатанта, не нарушая гранулу червя.
3. Готовят раствор для червячного лизиса, сочетая 400 мкл 8,25% гипохлорита натрия (бытовой отбеливатель) и 100 мкл 5 N NaOH. Добавьте этот раствор в червячную гранулу и проведите по трубке, чтобы перемешать содержимое трубки. Предотвратите перебеливание эмбрионов в трубке, наблюдая лизис червей под рассекающим микроскопом.
4. Добавьте 10 мл M9W в коническую трубку, чтобы разбавить смесь лизиса, когда 70% взрослых червей лизировались.
5. Центрифугировать трубку при 450 х г в течение 1 мин. Замените супернатант на 10 мл M9W.
6. Повторите шаг 3.5 два раза.
7. После завершения этапов промывки добавьте 3–5 мл M9W для повторного суспендирования гранулы яйца. Вращайте трубку в течение ночи со скоростью 18 об/мин на трубном ротаторе при комнатной температуре (RT).
8. После ночной инкубации извлеките трубку из ротатора, гранулируют личинки L1 путем центрифугирования трубки при 450 х г в течение 1 мин. Аспирировать M9W до 250 мкл остается в трубке.
9. Встряхните трубку, чтобы повторно суспендировать личинок. Добавьте три капли по 5 мкл, содержащие личинок, на крышку чашки Петри. С помощью рассекающего микроскопа подсчитайте количество червей в каждой капле и определите количество червей в 1 мкл.

4. Подготовка анализов на наркотики

ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги в этом анализе показаны на рисунке 1.

1. Вырастите 30 мл E. coli OP50 в конической трубке 50 мл при 37 °C в течение ночи в орбитальном шейкере при 150 об/мин.
2. Отжим на ночь выращенной культуры E. coli OP50 при 4000 х г в течение 10 мин, чтобы гранулировать клетки. Удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулы в 3 мл M9W, чтобы сконцентрировать культуру.
3. Перед приготовлением рабочих растворов для анализа препарата добавляют 0,1 мл (5 мг/мл в 95% этаноле) холестерина в 100 мл M9W.
4. Готовят рабочие растворы каждого экспериментального препарата путем разбавления каждого лекарственного средства плюс носитель (диметилсульфоксид; DMSO) в 4,8 мл M9W, дополненных холестерином, для получения соответствующих концентраций. Растворите ДМСО в 4,8 мл M9W, дополненного холестерином, для подготовки контроля транспортного средства.
5. Добавьте 200 мкл концентрированной культуры E. coli OP50 в каждую трубку, содержащую контроль транспортного средства или лекарства и вихревые трубки, чтобы убедиться, что они смешаны.
6. Для выполнения эксперимента добавляют 2 мл каждого рабочего раствора лекарственного средства или контроля транспортного средства в каждую скважину в 12-скважинной тканевой культуре. Проверьте концентрацию каждого препарата и контроль транспортного средства в двух экземплярах.
7. Добавьте ~100 личинок L1 на лунку (см. синхронные этапы культивирования C. elegans) с помощью стерильной микропипетки. Ограничьте объем червей до 10 мкл.
8. Инкубировать пластины при 20 °C.
9. При необходимости дополнив колодцы 50 мкл 10x концентрированной E. coli OP50 на 3-й день анализа.

5. Подготовка агарозной прокладки к микроскопии

1. Готовят 2% мас./об.раствор агарозы, растворяя 0,1 г агарозы в 5 мл деионизированной воды. Нагрейте содержимое в микроволновой печи, чтобы растворить агарозу. Из 5 мл раствора агарозы можно приготовить 20 слайдов.
2. Поместите полоски лабораторной ленты вдоль двух стеклянных слайдов. Лента будет действовать как прокладки, ограничивающие толщину агарозных подушечек. После этого поместите третий чистый стеклянный слайд между заклеенными слайдами.
3. Чтобы сделать агарозную прокладку, нанесите 100 мкл расплавленной агарозы на центр чистого слайда. Поместите еще один чистый стеклянный слайд поперек и поверх агарозы и осторожно надавите вниз, чтобы сформировать подушечку. Снимите верхний слайд, когда подушечка затвердеет.

6. Наблюдение фенотипа Muv в штаммах let-60, let-23 и lin-1

ПРИМЕЧАНИЕ: Только препараты-кандидаты, которые подавляют фенотипы Muv в штаммах let-23 и let-60, будут анализированы с использованием штамма lin-1, чтобы определить, происходит ли ингибирование на уровне RAS или EGFR.

1. Когда будет достигнута соответствующая стадия жизненного цикла (3 дня для штаммов let-60 и let-23, 5 дней для штамма lin-1), удалите пластины из инкубатора. и соберите червей в конические трубки по 15 мл с помощью пипетки.
2. Центрифугировать пробирки по 450 х г в течение 1 мин. Удалите M9W, не нарушая гранулы червя, и добавьте 5 мл свежего M9W.
3. Повторите шаг 6.2 два раза.
4. Не нарушая червячную гранулу, удалите все оставшиеся M9W путем аспирации. После этого добавляют 500 мкл 2 мМ азида натрия или 2 мМ тетрамизола гидрохлорида. Дайте трубкам инкубироваться на RT в течение 15 мин. 2 мМ азида натрия или 2 мМ тетрамизола гидрохлорида обезболивают червей для визуализации.
   ВНИМАНИЕ: Обязательно носите средства индивидуальной защиты (СИЗ) при обращении с азидом натрия. Раствор необходимо готовить под химическим капотом.
5. Добавьте 10 мкл анестезированной суспензии червя в центр агарозной прокладки. Аккуратно положите на суспензию червя #1,5 крышки. При необходимости закрепите обтекание лаком для ногтей, чтобы предотвратить высыхание.
6. Используйте микроскоп DIC для наблюдения за штаммами let-60(n1046), let-23(sa62) и lin-1(sy254). Изобразим червей в 10-кратном и 20-кратном увеличении.
7. Для let-60(n1046) и let-23(sa62) оценивают взрослых червей на основе наличия или отсутствия фенотипа Muv. В то время как для штамма lin-1 подсчитайте количество VPC, которые приняли 1° или 2° клеточные судьбы на вентральной стороне личинок L4, используя микроскоп с высоким разрешением DIC.
8. После оценки микрофотографий для каждого штамма и лечения препаратом, выполните тестСтьюденса, чтобы определить статистические различия между методами лечения.

Результаты

Впервые мы демонстрируем, что R-фендилин способен подавлять фенотип Muv в мутантном штамме let-60(n1046) по сравнению с червями, обработанными DMSO. Наши данные показывают, что R-фендилин способен блокировать фенотип Muv в let-60(n1046) дозозависимым образом(рисунок 2A,B).

Обсуждение

Анализы, которые мы описываем с использованием червя, просты и недороги для выявления ингибиторов функции EGFR и RAS. C. elegans является привлекательной моделью для открытия лекарств, потому что его легко выращивать в лаборатории из-за короткого жизненного цикла (3 дня при 20 ° C) и способно?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Millipore Sigma	A9539-50G
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendiline			Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide	Millipore Sigma	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite			Bleach
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride	Millipore Sigma	L9756
UO126 (MEK inhibitor)	Millipore Sigma	19-147
Consumables
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL	Fisher Scientific	07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	50-197-4804
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
MT2124	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC