Caenorhabditis elegans를 사용하여 EGFR 및 RAS 억제제의 식별

요약

유전적으로 통할 수 있는 선충성 Caenorhabditis elegans는 약물 발견을 위한 간단하고 저렴한 모델로 사용될 수 있습니다. 여기에 설명된 RAS 및 EGFR 단백질의 하류 신호를 억제하는 항암 치료제를 식별하는 프로토콜이 있다.

초록

표피 성장 인자 수용체(EGFR)와 다운스트림 이펙터 RAS의 혈장 막 국소화의 변화는 암을 포함한 여러 질병에 연루되어 있다. 자유 살아있는 선충 C. elegans는 외음부의 발달을 위한 중심인 진화적이고 기능적으로 보존된 EGFR-RAS-ERK MAP 신호 폭포를 가지고 있습니다. RAS homolog LET-60 및 EGFR homolog LET-23에서 기능 돌연변이의 이득은 이러한 웜의 복부 바디 월을 따라 눈에 보이는 비기능성 외투 성 의사 물음부의 생성을 유도한다. 이전에는 이러한 웜에서 다발성(Muv) 표현형이 작은 화학 분자에 의해 억제되는 것으로 나타났다. 여기서 우리는 EGFR 및 RAS 단백질의 활동을 폐지하는 억제제를 확인하기 위해 액체 기반 분석에서 웜을 사용하기위한 프로토콜을 설명합니다. 이 분석법을 사용하여, 우리는 R-fendiline, K-RAS의 간접 억제제를 보여주고, let-60 (n1046) 및 let-23 (sa62) 돌연변이 벌레에 표현된 Muv 표현형을 억제합니다. 분석은 간단하고 저렴하며 설정에 시간이 많이 걸리지 않으며 항암 치료제의 발견을위한 초기 플랫폼으로 사용할 수 있습니다.

서문

유기체 내의 발달 사건을 통제하는 세포 통로는 모든 메타조인 사이에서 높게 보존됩니다. 이러한 경로 중 하나는 EGFR-RAS-ERK 미토겐 활성화 단백질 키나아제(MAPK) 신호 캐스케이드이며 세포 증식, 분화, 이주 및 생존^1,2를제어하는 중요한 통로이다. 이 신호 통로에 있는 결점은 암과 같은 병리학 또는 질병 국가로 이끌어 낼 수 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 구강 편평상피 세포 암종의 50%를 포함하여 인간 종양에서 높게 발현되는 것으로 나타났으며, 악성 종양^3,4,5의발달에 기여한다. 3개의 RAS 동위상체에 있는 돌연변이는 H-, K-및 N-RAS는 다중 인간적인 암에 있는 악성 변환을 위한 중요한 동인인 인 반면. 이 세 가지 RAS 동소 형태 중, K-RAS의 종양 발생 돌연변이는^가장널리 퍼진^6,7,8. EGFR과 RAS가 작동하려면 플라즈마 멤브레인(PM)으로 국한되어야 합니다. PM에 이러한 분자의 국소화를 방지하면 이 신호 경로^9,10의생물학적 활성을 완전히 부정할 수 있다. 따라서 PM에 이러한 단백질의 국소화의 억제는 다운스트림 신호 및 결과 불리 한 결과 차단 하는 치료 전략. 고함량 스크리닝 분석법을 사용하여 L형 칼슘 채널 차단제인 펜딜린(fendiline)은 K-RAS^{활동(11)의}억제제로 확인되었다. K-RAS의 나노 클러스터링은 펜딜린의 존재에서 PM의 내부 전단지에 크게 감소된다. 더욱이, K-RAS는 혈장 막에서 내피성 망상(ER), 골기 장치, 내시경 및 사이토솔로 재분배된다. 더 중요한 것은, 종양유발 돌연변이 K-RAS를 발현하는 췌장, 결장, 폐 및 자궁내막암 세포주의의 증식은^{펜딜린(11)에}의한 하류 신호의 억제에 의해 차단된다. 이러한 데이터는 PM에 RAS 단백질의 잘못된 국소화를 일으키는 특정 K-RAS 항암 치료제로서 펜딜린 기능을 제안합니다.

선충 케노르하비티스 엘레간은 개발의 맥락에서 광범위하게 연구되었습니다. 웜의 발달을 지배하는 많은 신호 경로는 진화적이고 기능적으로 보존됩니다. 예를 들어, EGFR은 RAS의 활성화를 중재하고 ERK MAPK 신호 캐스케이드의 후속 활성화는^웜(12)에보존된다. 폭포는 다음과 같은 단백질에 의해 표현된다: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60은 RAS에 동종이며 LET-23은 EGFR에 동종입니다. 웜에서, 이 통로는^{외음부(13)의}발달을 조절한다. 외음부는 수정란을 낳을 수 있도록 벌레의 복부 바디 월의 상피 조리개입니다. 웜내외음부의 형성은 EGFR-RAS-MAPK 신호 캐스케이드의 활성화의 그라데이션에 대한 저속 전구체 세포(VPC)의 노출에 의존한다. 정상 발달 동안 근위 VP는 고나달 앵커 셀로부터 강력한 신호를 수신하여 기능성^{외음부(12)를}야기하는 1° 및 2° 세포 운명으로 분화한다. 탈매 한 VPCs는 피하 싱크티움에 융합하고 고갈 된 신호로 인해 외음부를 형성하지 않는 3 ° 세포 운명으로 분화하는 반면. 신호가 없는 경우 모든 VP는 3° 셀 운명으로 분화하여 외음부가 형성되지 않습니다. 그러나, 구성 신호는 1° 및 2° 세포 운명을 가정하기 위해 모든 VP의 유도로 인해 하나 이상의 비기능 외음부 형성으로 이어집니다.

결함이 있거나 과도한 저속 유도를 일으키는 돌연변이는 이 통로를 나타내는 단백질을 위해 인코딩하는 많은 유전자를 위해 확인되었습니다. 결함이 있는 저속 유도는 외음부(Vul) 표현형을 초래하며, 과도한 저속 유도는 복부 바디 월 전체에 걸쳐 수많은 비기능성 외투성 의사 외음부의 발달로 표현되는 다발음부(Muv) 표현형을 초래한다. let-60(n1046) 균주에 의해 발현된 Muv 표현형은 RAS에서 기능 돌연변이의 이득에 기인하며, let-23(sa62) 균주에서는 EGFR^14,15에서돌연변이를 활성화하기 때문이다. 이러한 돌연변이 균주에서 의 강한 Muv 표현형은 MEK-1 억제제 U0126^16,17을가진 let-60(n1046) 웜의 치료에 의해 입증된 바와 같이 약리학적 개입에 의해 교반되는 것으로 나타났다. 흥미롭게도, 우리는 스핑크고미엘린 대사에 영향을 미치는 R-펜딜린 및 억제제가^{벌레(18)의}Muv 표현형을 억제한다는 것을 보여주었다. 이러한 억제제 블록 let-60 을 RAS 수준에서 시그널링하는 것을 입증하기 위해 lin-1 null 균주는^17을활용하였다. Lin-1은^{외음부(19)의}발달에서 억압자로 기능하는 Ets와 같은 억제 전사 인자이다. let-60(n1046) 웜에서 Muv 표현형의 강력한 복귀와 lin-1 null 웜에 미치는 영향은 이러한 억제가 RAS 수준에서 발생한다는 것을 시사한다.

이 프로토콜에서, 우리는 RAS와 EGFR 단백질의 억제제를 확인하기 위한 모형으로 C. elegans의 사용을 보여줍니다. 액체 계 분석법을 이용하여, 우리는 Let-60(n1046) 및 Let-23(sa62) C. elegans의돌연변이 균주에서 Muv 표현형을 억제함으로써 R-fendiline의 억제 효과를 입증한다. 이 분석은 항암 치료제에 대한 약물 발견의 초기 단계에서 도구로 C. elegans의 사용을 검증합니다.

프로토콜

1. 선충 성장 매체 (NGM) 플레이트 준비

1. 2L 에렌마이어 플라스크에 포함된 970mL의 디온화 된 물에 펩톤 2.5 g와 NaCl 3 g을 추가합니다. 마그네틱 스터드 바를 사용하여 내용물들을 저어줍니다. 그 후 플라스크에 20g의 한고를 넣습니다. 플라스크의 내용내용은 121°C에서, 30분 동안 15파운드/in^2의 압력을 가한다. 살균 후 플라스크를 교반판에 놓고 온도가 50°C에 도달할 때까지 매체를 식힙니다.
2. NGM 플레이트를 준비하기 위해 냉각 된 매체에 다음 시약을 추가 : 1 M 칼륨 인산염 버퍼 (pH = 6.0),1 mL의 1 mL_4,1 M CaCl_2의1 mL, 1 mL (95 % 에탄올에서 5 mg / mL) 콜레스테롤, 1 mL의 (에탄올에서 10% v/w) nystatin, 그리고 1 mL 의 25 mg/mL 연쇄 절제술.
3. 라미나르 의 흐름 아래, 60mm x 15mm 멸균 페트리 접시에 냉각 된 매체를 부어. 플레이트가 2시간 동안 굳어지게 합니다. 이 플레이트는 4°C에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.

2. C. 예인자의 전파

1. 하룻밤 재배된 대장균 OP50의 100 μL을 각 NGM 플레이트의 중앙에 점하고 라미나르 후드에서 플레이트가 24시간 동안 건조되도록 합니다. 이어서, 플레이트는 폴리스티렌 용기에 보관할 수 있다.
   참고: 대장균 OP50 배양은 플레이트의 파종 전에 37°C 배지에서루리아-베르타니(LB) 배지에서 재배된다. 배양은 1-2 개월 동안 4 °C에서 저장하고 플레이트의 주기적인 파종에 사용할 수 있습니다.
2. 멸균 벌레 선택을 사용하여 이전에 재배한 판에서 10-12개의 중력성 성웜을 해부하는 현미경으로 수집합니다. 이러한 웜을 대장균 OP50으로 시드된 신선한 NGM 플레이트로 옮기고 20°C에서 24시간 동안 플레이트를 배양한다.
3. 24 시간 후, 멸균 웜 픽을 사용하여 접시에서 성인 웜을 제거합니다. ~ 3 일 동안 20 °C에서 플레이트를 배양합니다. 배아는 중력 성동물 벌레로 발전할 것입니다.

3. 동기 C. 예인선 문화의 준비

1. M9W로 2-4 플레이트를 세척하여 15mL 원상 관에 중력 성 웜을 수집합니다.
   1. M9W의 제제: NaCl 5g, Na₂HPO₄6g, KH₂PO₄ 3g을 1L. Autoclave의 최종 부피로 121°C의 최종 부피로 용액을 15lb/in^2의 압력으로 30분 동안 용해한다. 냉각된 용액에 1M MgSO_4의 1mL를 추가합니다.
2. 1 분 동안 450 x g에서 튜브를 원심분리하여 벌레를 펠렛. 웜 펠릿을 방해하지 않고 상류제를 장식합니다.
3. 8.25%의 염화나트륨(가정용 표백제)의 400 μL과 5N NaOH의 100 μL을 결합하여 웜 용액을 준비한다. 이 솔루션을 웜 펠릿에 추가하고 튜브의 내용을 혼합하기 위해 튜브를 쓸어 넘깁니다. 해부 현미경의 밑에 벌레의 lysis를 관찰하여 관에 있는 태아의 과표백을 방지합니다.
4. 성인 웜의 70%가 lysed경우 리시스 믹스를 희석하기 위해 원문 튜브에 10mL의 M9W를 추가합니다.
5. 튜브를 450 x g에서 1 분 동안 원심 분리합니다. 상체를 M9W의 10mL로 교체하십시오.
6. 3.5 단계를 두 번 반복합니다.
7. 세척 단계를 완료한 후 3-5mL의 M9W를 추가하여 달걀 펠릿을 다시 놓습니다. 실온(RT)에서 튜브 회전기에서 18rpm의 속도로 하룻밤 동안 튜브를 회전합니다.
8. 하룻밤 동안 배양 후 회전기에서 튜브를 제거하고 L1 애벌레를 원심분리하여 튜브를 1 분 동안 450 x g로 원심분리합니다. 250 μL이 튜브에 남아있을 때까지 M9W를 흡인합니다.
9. 튜브를 흔들어 애벌레를 다시 보냅니다. 페트리 접시 뚜껑에 애벌레가 들어 있는 5μL 방울 3방울을 넣습니다. 해부 현미경을 사용하여 각 낙하의 웜 수를 계산하고 1 μL의 웜 수를 결정합니다.

4. 약물 검사 준비

참고: 이 분석의 단계는 그림 1에표시됩니다.

1. 150 rpm에서 궤도 셰이커에서 하룻밤 동안 37 °C에서 50 mL 원문 튜브에서 대장균 OP50의 30 mL성장.
2. 하룻밤 동안 성장 한 대장균 OP50 배양을 4,000 x g에서 10 분 동안 세포에 펠릿하십시오. 상체를 제거하고 M9W의 3mL에서 펠릿을 재놓아 문화를 집중한다.
3. 약물 분석에 대한 작업 용액을 준비하기 전에 M9W의 100 mL에 콜레스테롤 (95 % 에탄올에서 5 mg / mL) 콜레스테롤의 0.1 mL을 추가하십시오.
4. 각 약물 플러스 차량(디메틸 설프리산화물)을 희석하여 각 실험 약물의 작업 용액을 준비합니다. DMSO) 4.8 mL M9W에서 적절한 농도를 얻기 위해 콜레스테롤을 보충하였다. DMSO를 M9W 의 4.8mL에 녹여 차량 제어를 준비하도록 콜레스테롤을 보충합니다.
5. 200 μL의 집중 된 대장균 OP50 배양을 차량 제어 또는 약물 및 소용돌이 튜브를 포함하는 각 튜브에 추가하여 혼합되었는지 확인하십시오.
6. 실험을 수행하기 위해, 12웰 조직 배양 플레이트에 각 작업 약물 용액 또는 차량 제어의 2mL을 각 우물에 추가한다. 각 약물 농도 및 차량 제어를 복제하여 테스트합니다.
7. 멸균 마이크로파이프를 사용하여 우물당 ~100 L1 애벌레를 추가합니다(동기 C. 예르간 배양 단계 참조). 웜의 부피를 10μL로 제한합니다.
8. 플레이트를 20°C에서 배양합니다.
9. 필요한 경우 분석 3일째에 10배 농축 대장균 OP50의 50μL을 보충합니다.

5. 현미경 검사법을 위한 아가로즈 패드 준비

1. 5mL의 해수에서 아가로즈 0.1g을 용해하여 아가로즈의 2%w/v 용액을 준비한다. 내용물들을 전자레인지에 가열하여 아가로즈를 녹입니다. 아가로즈 용액의 5mL로부터 20개의 슬라이드를 준비할 수 있습니다.
2. 두 개의 유리 슬라이드를 따라 실험실 테이프 스트립을 배치합니다. 테이프는 아가로즈 패드의 두께를 제한하는 스페이서 역할을합니다. 그 후, 녹화 된 슬라이드 사이에 세 번째 깨끗한 유리 슬라이드를 배치합니다.
3. 아가로즈 패드를 만들려면, 깨끗한 슬라이드의 중앙에 녹은 아가로즈 100 μL을 발견하십시오. 아가로즈 를 가로질러 내려와 서서히 눌러 패드를 형성합니다. 패드가 고형화되면 상단 슬라이드를 제거합니다.

6. 렛-60, 렛-23 및 린-1 균주에서 무브 표현형 의 관찰

참고: LET-23 및 let-60 균주에서 Muv 표현형을 억제하는 후보 약물만 lin-1 균주를 사용하여 분석하여 억제가 RAS 또는 EGFR 수준에서 발생하는지 여부를 결정합니다.

1. 수명 주기의 적절한 단계에 도달하면 (let-60 및 let-23 균주에 대한 3 일, 린 -1 균주에 대한 5 일), 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 파이펫을 사용하여 15mL 원물 튜브에서 웜을 수집합니다.
2. 원심 분리튜브를 450 x g에서 1분 동안 제거합니다.
3. 6.2 단계를 두 번 반복합니다.
4. 웜 펠릿을 방해하지 않고, 포부로 남아있는 모든 M9W를 제거하십시오. 그 후, 2mM 나트륨 아지드 또는 2m 테트라미솔 염산염의 500 μL을 추가합니다. 튜브가 15 분 동안 RT에서 배양 할 수 있도록. 2 mM 나트륨 아지드 또는 2 mM 테트라미솔 염산염은 이미징을 위해 벌레를 마취합니다.
   주의: 나트륨 아지드를 취급할 때 개인 보호 장비(PPE)를 착용해야 합니다. 용액은 화학 후드 아래에 준비해야합니다.
5. 마취된 벌레 서스펜션의 10 μL을 아가로즈 패드 중앙에 추가합니다. #1.5 커버슬립을 웜 서스펜션 위에 부드럽게 놓습니다. 필요한 경우, 건조를 방지하기 위해 몇 가지 매니큐어로 커버 슬립을 수정합니다.
6. DIC 현미경을 사용하여 let-60(n1046)및 let-23(sa62) 및 lin-1(sy254) 균주를 관찰한다. 10배 및 20배 배율로 웜을 이미지화합니다.
7. let-60(n1046) 및 let-23(sa62)의 경우, Muv 표현형의 존재 또는 부재에 따라 성인 웜을 점수. lin-1 스트레인의 경우 고해상도 DIC 현미경을 사용하여 L4 애벌레의 복부 측에 1° 또는 2° 셀 운명을 채택한 VPC 수를 계산합니다.
8. 각 균주와 약물 치료에 대한 현미경 검사를 받은 후 학생의 t-테스트를수행하여 치료 간의 통계적 차이를 결정합니다.

결과

우리는 먼저 R-펜딜린이 DMSO 처리 된 웜에 비해 let-60 (n1046) 돌연변이 균주에서 Muv 표현형을 억제 할 수 있음을 입증한다. 우리의 데이터는 R-fendiline이 용량 의존적 방식으로 let-60(n1046)에서 Muv 표현형을 차단할 수 있음을보여줍니다(그림 2A, B). 그러나, Muv 표현형의 비반전은 R-fendiline(도2B)의농도 증가에 대응하여 린-1 널 ?...

토론

우리가 벌레를 사용하여 설명하는 소사는 EGFR 및 RAS 기능의 억제제를 확인하기 위하여 간단하고 저렴합니다. C. elegans는 짧은 수명 주기(20°C에서 3일)와 많은 수의 애벌레를 생성하는 능력으로 인해 실험실에서 쉽게 성장할 수 있기 때문에 약물 발견을 위한 매력적인 모델이다. 더 중요한 것은, EGFR-RAS-ERK MAPK 통로는 EGFR 및 RAS 억제제의 효력을 분석하기 위하여 유전으로 기관시스템을 제공하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Millipore Sigma	A9539-50G
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendiline			Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide	Millipore Sigma	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite			Bleach
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride	Millipore Sigma	L9756
UO126 (MEK inhibitor)	Millipore Sigma	19-147
Consumables
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL	Fisher Scientific	07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	50-197-4804
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
MT2124	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC