Identificación de inhibidores de EGFR y RAS mediante Caenorhabditis elegans

Resumen

El nematodo genéticamente tratable Caenorhabditis elegans se puede utilizar como un modelo simple y económico para el descubrimiento de fármacos. Aquí se describe un protocolo para identificar terapias contra el cáncer que inhiben la señalización aguas abajo de las proteínas RAS y EGFR.

Resumen

Los cambios en la localización de la membrana plasmática del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y su efector aguas abajo RAS se han implicado en varias enfermedades, incluido el cáncer. El nematodo de vida libre C. elegans posee una cascada de señales EGFR-RAS-ERK MAP evolutiva y funcionalmente conservada que es central para el desarrollo de la vulva. Las mutaciones de ganancia de función en el homólogo RAS LET-60 y el homólogo EGFR LET-23 inducen la generación de pseudovulva ectópica no funcional visible a lo largo de la pared del cuerpo ventral de estos gusanos. Anteriormente, se ha demostrado que el fenotipo multivulval (Muv) en estos gusanos es inhibido por pequeñas moléculas químicas. Aquí describimos un protocolo para usar el gusano en un ensayo a base de líquido para identificar inhibidores que abolen las actividades de las proteínas EGFR y RAS. Usando este ensayo, mostramos que la R-fendilina, un inhibidor indirecto de K-RAS, suprime el fenotipo Muv expresado en los gusanos mutantes let-60(n1046) y let-23(sa62). El ensayo es simple, económico, no requiere mucho tiempo de configuración y se puede utilizar como una plataforma inicial para el descubrimiento de terapias contra el cáncer.

Introducción

Las vías celulares que regulan los eventos de desarrollo dentro de los organismos están altamente conservadas entre todos los metazoos. Una de estas vías es la cascada de señalización de la proteína quinasa activada por mitógeno EGFR-RAS-ERK (MAPK), que es una vía crítica que gobierna la proliferación, diferenciación, migración y supervivencia celular^1,2. Los defectos en esta vía de señalización pueden conducir a estados patológicos o de enfermedad como el cáncer. El receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) ha demostrado estar altamente expresado en tumores humanos, incluyendo el 50% de los carcinomas orales de células escamosas, y contribuye al desarrollo de tumores malignos^3,4,5. Mientras que las mutaciones en las tres isoformas RAS H-, K- y N-RAS son los principales impulsores de la transformación maligna en múltiples cánceres humanos. Entre estas tres isoformas RAS, las mutaciones oncogénicas en K-RAS son las más prevalentes^6,7,8. Para que EGFR y RAS funcionen, deben localizarse en la membrana plasmática (PM). Prevenir la localización de estas moléculas al PM puede abrogar completamente la actividad biológica de esta vía de señalización^9,10. Por lo tanto, la inhibición de la localización de estas proteínas en el PM es una estrategia terapéutica para bloquear la señalización aguas abajo y los resultados adversos resultantes. Mediante un ensayo de cribado de alto contenido, se identificó la fendilina, un bloqueador de los canales de calcio de tipo L, como un inhibidor de la actividad de K-RAS¹¹. La nanoagrupanción de K-RAS a la valva interna del PM se reduce significativamente en presencia de fendilina. Además, K-RAS se redistribuye desde la membrana plasmática al retículo endoplásmico (RE), el aparato de Golgi, los endosomas y el citosol. Más importante aún, la proliferación de líneas celulares de cáncer de páncreas, colon, pulmón y endometrio que expresan K-RAS mutante oncogénico está bloqueada por la inhibición de la señalización aguas abajo por fendilina^11. Estos datos sugieren que la fendilina funciona como una terapia específica contra el cáncer K-RAS que causa la mala localización de la proteína RAS al PM.

El nematodo Caenorhabditis elegans ha sido ampliamente estudiado en el contexto del desarrollo. Muchas de las vías de señal que gobiernan el desarrollo en el gusano son evolutivas y funcionalmente conservadas. Por ejemplo, la activación mediada por EGFR de RAS y la posterior activación de la cascada de señal ERK MAPK se conserva en el gusano¹². La cascada está representada por las siguientes proteínas: LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 es homólogo a RAS, mientras que LET-23 es homólogo a EGFR. En el gusano, esta vía regula el desarrollo de la vulva¹³. La vulva es una abertura epitelial en la pared ventral del cuerpo del gusano que permite poner huevos fertilizados. La formación de la vulva en el gusano depende de la exposición de las células precursoras vulvales (VPC) a un gradiente de activación de la cascada de señales EGFR-RAS-MAPK. Durante el desarrollo normal, las VPC proximales reciben fuertes señales de las células de anclaje gonadal para diferenciarse en destinos celulares de 1° y 2° que dan lugar a una vulva funcional¹². Mientras que las VPC distales se diferencian en destinos celulares de 3° que se fusionan con el sincitio hipodérmico y no forman vulva debido al agotamiento de la señalización. En ausencia de señalización, todas las VPC se diferencian en destinos celulares de 3°, lo que resulta en la formación de ninguna vulva. Sin embargo, la señalización constitutiva conduce a la formación de una o más vulva no funcionales debido a la inducción de todas las VPC para asumir destinos celulares de 1° y 2°.

Se han identificado mutaciones que causan una inducción vulvística defectuosa o excesiva para muchos de los genes que codifican para las proteínas que representan esta vía. La inducción vulvar defectuosa da como resultado un fenotipo sin vulva (Vul), mientras que la inducción vulvar excesiva da como resultado un fenotipo multivulva (Muv) que está representado por el desarrollo de numerosas pseudovulvas ectópicas no funcionales en toda la pared del cuerpo ventral. El fenotipo Muv expresado por la cepa let-60(n1046) se debe a una mutación de ganancia de función en RAS, mientras que en la cepa let-23(sa62) se debe a una mutación activadora en EGFR^14,15. Se ha demostrado que el fuerte fenotipo Muv en estas cepas mutantes se ve perturbado por las intervenciones farmacológicas, como lo demuestra el tratamiento de los gusanos let-60(n1046) con el inhibidor de MEK-1 U0126^16,17. Curiosamente, hemos demostrado que la R-fendilina y los inhibidores que afectan al metabolismo de la esfingomielina suprimen el fenotipo Muv en el gusano¹⁸. Para demostrar que estos inhibidores bloquean la señalización let-60 a nivel de RAS, se ha utilizado la cepa nula lin-1 ¹⁷. Lin-1 es un factor de transcripción inhibidor similar a Ets que funciona como represor en el desarrollo de la vulva¹⁹. La fuerte reversión del fenotipo Muv en gusanos let-60(n1046) y ningún efecto sobre los gusanos nulos lin-1 sugieren que estas inhibiciones ocurren a nivel de RAS.

En este protocolo, demostramos el uso de C. elegans como modelo para identificar inhibidores de las proteínas RAS y EGFR. Utilizando un ensayo a base de líquido, demostramos los efectos inhibitorios de la R-fendilina mediante la supresión de los fenotipos Muv en las cepas mutantes let-60(n1046) y let-23(sa62) de C. elegans. Este ensayo valida el uso de C. elegans como herramienta en la fase inicial de descubrimiento de fármacos para la terapéutica contra el cáncer.

Protocolo

1. Preparación de la placa del medio de crecimiento de nematodos (NGM)

1. Añadir 2,5 g de peptona y 3 g de NaCl a 970 ml de agua desionizada contenida en un matraz Erlenmeyer de 2 L. Revuelva el contenido con una barra de agitación magnética. A partir de entonces, agregue 20 g de agar al matraz. Autoclave el contenido del matraz a 121 °C y una presión de 15 lb/in² durante 30 min. Después de la esterilización, coloque el matraz en una placa de agitación y deje que el medio se enfríe hasta que la temperatura alcance los 50 ° C.
2. Para preparar las placas NGM agregue los siguientes reactivos al medio enfriado: 25 mL de tampón de fosfato de potasio 1 M (pH = 6.0), 1 mL de 1 M MgSO₄, 1 mL de 1 M CaCl₂, 1 mL de (5 mg / ml en etanol al 95%) colesterol, 1 ml de (10% v / w en etanol) nistatina y 1 mL de 25 mg / ml de estreptomicina.
3. Bajo un flujo laminar, vierta el medio enfriado en placas de Petri estériles de 60 mm x 15 mm. Deje que las placas se solidifiquen durante 2 h. Estas placas se pueden mantener durante 1 mes a 4 °C.

2. Propagación de C. elegans

1. Coloca 100 μL de E. coli OP50 cultivada durante la noche en el centro de cada placa NGM y deja que las placas se sequen durante 24 h en una campana laminar. Posteriormente, las placas se pueden almacenar en un recipiente de poliestireno.
   NOTA: El cultivo de E. coli OP50 se cultiva en medios Luria-Bertani (LB) a 37 °C media antes de la siembra de las placas. El cultivo puede almacenarse a 4 °C durante 1-2 meses y utilizarse para la siembra periódica de placas.
2. Usando una selección de gusanos estéril, reúna de 10 a 12 gusanos adultos grávidos de una placa previamente cultivada bajo un microscopio de disección. Transfiera estos gusanos a una placa NGM fresca secuesta con E. coli OP50 e incube la placa durante 24 h a 20 ° C.
3. Después de 24 h, usando un gusano estéril, elimine los gusanos adultos de las placas. Incubar las placas a 20 °C durante ~ 3 días. Los embriones se convertirán en gusanos adultos grávidos.

3. Preparación de un cultivo síncrono de C. elegans

1. Recolecte gusanos adultos grávidos en un tubo cónico de 15 ml lavando 2-4 placas con M9W.
   1. Preparación de M9W: Disolver 5 g de NaCl, 6 g de Na₂HPO₄y 3 g de KH₂PO₄ en agua desionizada hasta un volumen final de 1 L. Autoclave la solución a 121 °C a una presión de 15 lb/in² durante 30 min. Añadir 1 ml de 1 M mgSO₄ a la solución refrigerada.
2. Peletizar los gusanos centrifugando el tubo a 450 x g durante 1 min. Decantar el sobrenadante sin molestar la bolita del gusano.
3. Preparar solución de lisis de lombrices combinando 400 μL de hipoclorito de sodio al 8,25% (lejía doméstica) y 100 μL de 5 N NaOH. Agregue esta solución a la bolita de gusano y mueva el tubo para mezclar el contenido del tubo. Evite el blanqueamiento excesivo de los embriones en el tubo observando la lisis de los gusanos bajo un microscopio de disección.
4. Agregue 10 ml de M9W al tubo cónico para diluir la mezcla de lisis cuando el 70% de los gusanos adultos se hayan lisado.
5. Centrifugar el tubo a 450 x g durante 1 min. Reemplace el sobrenadante con 10 ml de M9W.
6. Repita el paso 3.5 dos veces.
7. Después de completar los pasos de lavado, agregue 3-5 ml de M9W para volver a usar el pellet de huevo. Gire el tubo durante la noche a una velocidad de 18 rpm en un rotador de tubo a temperatura ambiente (RT).
8. Después de la incubación durante la noche, retire el tubo del rotador, pelete las larvas de L1 centrifugando el tubo a 450 x g durante 1 min. Aspirar el M9W hasta que queden 250 μL en el tubo.
9. Agite el tubo para volver a sususpend las larvas. Agregue tres gotas de 5 μL que contengan las larvas en la tapa de una placa de Petri. Usando un microscopio de disección, cuente el número de gusanos en cada gota y determine el número de gusanos en 1 μL.

4. Preparación de ensayos farmacológicos

NOTA: Los pasos de este ensayo se muestran en la Figura 1.

1. Cultive 30 ml de E. coli OP50 en un tubo cónico de 50 ml a 37 °C durante la noche en un agitador orbital a 150 rpm.
2. Girar durante la noche el cultivo de E. coli OP50 cultivada a 4.000 x g durante 10 min para gletizar las células. Retire el sobrenadante y vuelva a colocar el pellet en 3 mL de M9W para concentrar el cultivo.
3. Antes de preparar las soluciones de trabajo para el ensayo del fármaco, agregue 0.1 ml de colesterol (5 mg / ml en etanol al 95%) en 100 ml de M9W.
4. Preparar soluciones de trabajo de cada fármaco experimental diluyendo cada fármaco más vehículo (dimetilsulfóxido; DMSO) en 4,8 mL M9W suplementado con colesterol para obtener las concentraciones adecuadas. Disolver DMSO en 4.8 mL de M9W suplementado con colesterol para preparar el control del vehículo.
5. Agregue 200 μL de cultivo concentrado de E. coli OP50 a cada tubo que contenga el control del vehículo o los medicamentos y tubos de vórtice para asegurarse de que estén mezclados.
6. Para realizar el experimento, agregue 2 ml de cada solución de fármaco en funcionamiento o control de vehículo a cada pozo en una placa de cultivo de tejido de 12 pozos. Pruebe cada concentración de drogas y el control del vehículo por duplicado.
7. Agregue ~ 100 larvas L1 por pozo (ver pasos de cultivo sincrónicos de C. elegans) usando una micropipeta estéril. Limite el volumen de gusanos a 10 μL.
8. Incubar las placas a 20 °C.
9. Suplementar los pomos con 50 μL de E. coli OP50 concentrada 10x en el día 3 del ensayo si es necesario.

5. Preparación de la almohadilla de agarosa para microscopía

1. Prepare una solución de agarosa al 2% p/v disolviendo 0,1 g de agarosa en 5 ml de agua desionizada. Calentar el contenido en un microondas para disolver la agarosa. Se pueden preparar 20 diapositivas a partir de 5 ml de solución de agarosa.
2. Coloque tiras de cinta de laboratorio a lo largo de dos portaobjetos de vidrio. La cinta actuará como espaciadores limitando el grosor de las almohadillas de agarosa. A partir de entonces, coloque un tercer portaobjetos de vidrio limpio entre los portaobjetos con cinta adhesiva.
3. Para hacer una almohadilla de agarosa, atelice 100 μL de agarosa fundida en el centro del portaobjetos limpio. Coloque otro portaobjetos de vidrio limpio a través y encima de la agarosa y presione suavemente hacia abajo para formar una almohadilla. Retire la corredera superior cuando la almohadilla se haya solidificado.

6. Observación del fenotipo Muv en las cepas let-60, let-23 y lin-1

NOTA: Solo los fármacos candidatos que suprimen los fenotipos Muv en las cepas let-23 y let-60 se analizarán utilizando la cepa lin-1 para determinar si la inhibición ocurre a nivel de RAS o EGFR.

1. Cuando se alcance la etapa adecuada del ciclo de vida (3 días para las cepas let-60 y let-23, 5 días para la cepa lin-1), retire las placas de la incubadora. y recoger los gusanos en tubos cónicos de 15 ml utilizando una pipeta.
2. Centrifugar los tubos a 450 x g durante 1 min. Retire el M9W sin molestar el pellet de gusano y agregue 5 mL de M9W fresco.
3. Repita el paso 6.2 dos veces.
4. Sin molestar el gránulo del gusano, retire todos los M9W restantes por aspiración. A partir de entonces, agregue 500 μL de azida de sodio de 2 mM o clorhidrato de tetramisole de 2 mM. Permita que los tubos se incuben en RT durante 15 min. 2 mM de azida de sodio o 2 mM de clorhidrato de tetramisole anestesiará a los gusanos para la obtención de imágenes.
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de usar equipo de protección personal (EPP) cuando manipule azida de sodio. La solución debe prepararse bajo una capucha química.
5. Agregue 10 μL de la suspensión de gusano anestesiada en el centro de una almohadilla de agarosa. Coloque un #1.5 suavemente sobre la suspensión del gusano. Si es necesario, fije la cubierta con un poco de esmalte de uñas para evitar que se seque.
6. Utilice un microscopio DIC para observar las cepas let-60(n1046), let-23(sa62) y lin-1(sy254). Imagine los gusanos a los aumentos de 10x y 20x.
7. Para let-60(n1046) y let-23(sa62), puntúe los gusanos adultos en función de la presencia o ausencia del fenotipo Muv. Mientras que para la cepa lin-1, cuente el número de VPC que adoptaron destinos celulares de 1 ° o 2 ° en el lado ventral de las larvas L4 utilizando un microscopio DIC de alta resolución.
8. Después de calificar las micrografías para cada cepa y tratamiento farmacológico, realice la prueba tde Student para determinar las diferencias estadísticas entre los tratamientos.

Resultados

Primero demostramos que la R-fendilina es capaz de suprimir el fenotipo Muv en la cepa mutante let-60(n1046) en comparación con los gusanos tratados con DMSO. Nuestros datos muestran que la R-fendilina es capaz de bloquear el fenotipo Muv en el let-60(n1046) de una manera dependiente de la dosis(Figura 2A,B). Sin embargo, no se observó reversión del fenotipo Muv en la cepa mutante nula lin-1 en respuesta al aumento de las concentraciones de R-fe...

Discusión

Los ensayos que describimos utilizando el gusano son simples y económicos para identificar inhibidores de la función EGFR y RAS. C. elegans es un modelo atractivo para el descubrimiento de fármacos porque es fácil de cultivar en el laboratorio debido al corto ciclo de vida (3 días a 20 °C) y la capacidad de generar un gran número de larvas. Más importante aún, la vía EGFR-RAS-ERK MAPK se conserva evolutiva y funcionalmente con mamíferos que proporcionan un sistema genéticamente tratable para analizar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Media and chemicals
Agarose	Millipore Sigma	A9539-50G
Bacto Peptone	Fisher Scientific	DF0118-17-0
BD Difco Agar	Fisher Scientific	DF0145-17-0
BD Difco LB Broth	Fisher Scientific	DF0446-17-3
Calcium Chloride	Fisher Scientific	BP510-500
Cholesterol	Fisher Scientific	ICN10138201
Magnesium Sulfate	Fisher Scientific	BP213-1
Nystatin	Acros organics	AC455500050
Potassium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP363-500
Potassium pPhosphate Monobasic	Fisher Scientific	BP362-500
R-Fendiline			Commercially Synthesized (Pharmaceutical grade)
Sodium Azide	Millipore Sigma	S2002-25G
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Sodium Hydroxide	Fisher Scientific	SS266-1
8.25% Sodium Hypochlorite			Bleach
Sodium Phosphate Dibasic	Fisher Scientific	BP332-500
Streptomycin Sulfate	Fisher Scientific	BP910-50
(−)-Tetramisole Hydrochloride	Millipore Sigma	L9756
UO126 (MEK inhibitor)	Millipore Sigma	19-147
Consumables
15mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-269
50mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes	Fisher Scientific	12-565-271
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 10mL	Fisher Scientific	07-200-574
Disposable Polystyrene Serological Pipettes 25mL	Fisher Scientific	07-200-575
No. 1.5  18 mm X 18 mm Cover Slips	Fisher Scientific	12-541A
Petri Dish with Clear Lid (60 x 15 mm)	Fisher Scientific	FB0875713A
Petri Dishes with Clear Lid (100X15mm)	Fisher Scientific	FB0875712
Plain Glass Microscope Slides (75 x 25 mm)	Fisher Scientific	12-544-4
12- Well Tissue Culture Plates	Fisher Scientific	50-197-4804
Software
Prism	Graphpad
Bacterial Strains
E. coli OP50
Worm Strains
Strain	Genotype	Transgene	Source
MT2124	let-60(n1046) IV.		CGC
MT7567	lin-1(sy254) IV.		CGC
PS1839	let-23(sa62) II.		CGC