获得全种子尺寸树脂部分的简单干截块方法及其应用

摘要

该技术允许快速、简朴地制备全种子大小的树脂部分，用于观察和分析种子不同区域的细胞、淀粉颗粒和蛋白质体。

摘要

种子中细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态、大小和数量决定了种子的重量和质量。它们在不同的种子区域之间有显著差异。为了清晰地查看细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态，并定量分析其形态参数，需要全种子大小的部分。虽然全种子大小的石蜡部分可以研究种子中储存材料的积累，但由于厚段的低分辨率，很难定量分析细胞和储存材料的形态参数。薄树脂部分具有高分辨率，但常规树脂分段方法不适合准备体积大、淀粉含量高的成熟种子全种子尺寸部分。本研究提出了一种简单的干截面方法，用于制备全种子大小的树脂部分。该技术可以准备交叉和纵向全种子大小的部分开发，成熟，发芽，煮熟的种子嵌入在LR白树脂，甚至为高淀粉含量的大种子。全种子大小的部分可以染色荧光增白剂28，碘，和库马西辉煌的蓝色R250，以具体地分别显示细胞，淀粉颗粒和蛋白质体的形态。获得的图像还可以定量分析，以显示不同种子区域细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态参数。

引言

植物种子含有淀粉和蛋白质等储存材料，为人们提供能量和营养。细胞和储存材料的形状、大小和数量决定了种子的重量和质量。种子不同区域的细胞和储存材料具有显著不同的形态，特别是对于一些高淀粉分枝酶Ib^{1、2、3的抑制高淀粉谷类作物}。因此，研究种子不同区域细胞和储存材料的形态是非常重要的。

石蜡分段是准备全种子尺寸部分的一个很好的方法，可以展示种子的组织结构和^{种子4、5、6}等不同区域^{储存材料的积累}。然而，石蜡部分通常有6-8 μm厚度和低分辨率;因此，很难对细胞和储存材料的形态进行清晰观察和定量分析。树脂部分通常有1-2μm的厚度和高分辨率，非常适合观察和分析细胞和存储材料^{的形态7。}然而，常规树脂分节法在制备全种子尺寸部分时有困难，尤其是对于体积大、淀粉含量高的种子;因此，没有办法观察和分析种子不同区域细胞和储存材料的形态。LR白树脂是一种丙烯酸树脂，具有低粘度和强渗透性，在制备种子树脂部分方面具有良好的应用，特别是对于体积大、淀粉含量高的谷类成熟内核。此外，嵌入在LR白树脂中的样品可以很容易地用许多化学染料染色，以清楚地显示细胞和储存材料在光或荧光显微镜^{下7的形态}。在之前的一篇论文中，我们报告了一种干燥分段方法，用于制备嵌入在LR白树脂中的成熟谷仁全种子大小的部分。该方法还可以准备开发、发芽和煮熟的谷仁8的整籽大小^部分。获得全种子大小的部分在微形态观察和分析方面有许多应用，特别是用于清晰观察和定量分析^种子8、9等不同区域细胞和储存材料的^形态差异。

这项技术适合研究人员使用光显微镜观察组织微观结构以及不同种子区域的细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形状和大小。通过形态分析软件，可对专为展示细胞、淀粉颗粒和蛋白质体而染色的整籽大小部分的图像进行定量测量，定量测量种子不同区域细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的形态参数。为了论证技术适用性和全种子尺寸部分应用，我们研究玉米和油菜的成熟种子以及水稻的发育、发芽和熟核。该协议包含四个进程。在这里，我们使用成熟的玉米仁，这是最难准备整个种子大小的部分，由于体积大，淀粉含量高，作为一个样本，以逐步展示的过程。

研究方案

1. 树脂嵌入种子的制备（图1）

1. 在4°C下固定6个玉米成熟内核，在4°C下，在4°C下使用2.5%磷酸盐缓冲的谷氨酰胺（0.1M，pH7.2），48小时。研究人员可以根据研究目标和组织类型选择其他固定性混合物、固定浓度和固定条件。
2. 拿出内核，用锋利的双面刀片纵向或横向切成2-3毫米的厚度，再将它们固定在10 mL的2.5%磷酸盐缓冲性谷氨酰胺（0.1 M，pH 7.2）中，48小时。
3. 每次用 10 mL 的 0.1 M 磷酸盐缓冲液 （pH 7.2） 清洗样品三次 30 分钟。
4. 将乙醇水溶液（10 mL）的等级从30%到50%、70%、90%和100%三次，每次30分钟，使样品脱水。
5. 在 10 mL 中渗透样品，增加用乙醇稀释的 LR 白色树脂溶液的等级，从 25% 到 50%、75% 一次和 100% 两次在 4 °C 下，每次 12 小时。
6. 在嵌入之前，为样本准备基座。将 0.25 mL 的 100% LR 白色树脂加入 2 mL 离心管中，并在 60°C 下聚合 48 小时。
7. 连续添加纯LR白树脂（0.5 mL）和渗透样品到离心管与基座。用解剖针拉直样品，并在烤箱中60°C聚合样品48小时。

2. 用于准备全种子大小的部分的干截面 （图 1）

1. 从离心管中拿出嵌入的内核，使用锋利的刀片切掉样品周围的多余的树脂。
2. 将树脂块夹在超微组 （EM UC7） 的样品架中，用刀片修剪样品表面和样品周围的多余树脂。
3. 用玻璃刀对样品表面进行精细抛光，直到形成完整的部分。
4. 在切割前，将刀片边缘上方约 2 mm 的小铜钩放入 2 μm 部分。挂钩的作用是避免卷曲向上的部分。
5. 将挂钩放在该部分下，以支撑该部分变长时。
6. 在未预处理的滑梯上加入 100 μL 水，用钳子小心地将完整且不间断的部分转移到水中。
7. 为了平滑起皱部分，在50°C的平平桌上加热和干燥样品。
   1. 如果该部分碎裂或撕裂，将样品每次树脂渗透的时间从 12 小时延长到 24 小时或 48 小时。
   2. 如果该部分有一些与刀平行的线，则紧紧夹紧样品块。如果该部分有一些垂直于刀的线，请使用新刀。

3. 染色和观察部分

注:为了观察细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的结构结构和形态，根据研究的目的，用特定的污渍染色部分。在这里，我们使用荧光增白剂28，碘溶液，和库马西明亮的蓝色R250分别染色细胞壁，淀粉颗粒和蛋白质体。

1. 为了观察细胞的形态，在45°C的70 mL紧凑型玻璃染色罐中用40 mL的0.1%（w/v）荧光增白剂28水溶液染色，10分钟，然后用自来水冲洗5分钟。在配备 CCD 摄像机的荧光显微镜下观察和拍摄该部分。
2. 为了观察淀粉颗粒的形态，用40μL的碘溶液（0.07%（w/v）I₂ 和0.14%（w/v）KI在25%（v/v）甘油）中染色1分钟，用盖玻片覆盖含有碘溶液的样品。在配备 CCD 相机的光学显微镜下查看和拍摄样品。
3. 为了观察蛋白质体的形态，在45°C下将40 mL的10%（v/v）醋酸浸入70 mL紧凑型玻璃染色罐中10分钟， 然后在 40 mL 的 1% （w/v） Coomassie 辉煌蓝色 R250 中染色 25% （v/v） 异丙醇和 10% （v/v） 醋酸在 45 °C 下 15 分钟。 用自来水清洗染色部分 5 分钟，然后晾干。在配备 CCD 摄像机的光学显微镜下观察和拍摄该部分。

4. 形态参数的定量分析

1. 按照赵等人9号的程序，使用形态分析软件（Image-Pro Plus^6.0 软件），对种子不同区域的细胞、淀粉颗粒和蛋白质体的区域、长/短轴以及圆度进行处理和定量分析。

结果

简单的干截面方法，用于获取全种子大小的截面
我们建立了一个简单的干截面方法，用于制备嵌入在LR-白色树脂中的种子的整种子大小的部分（图1）。该方法可以制备厚度为2μm的横向和纵向全种子尺寸部分（图2-5，补充图1-4）。例如，油菜的成熟种子可以横向和纵向分段（图2）。

讨论

种子是食品、饲料和工业原料最重要的可再生资源，富含淀粉和蛋白质等储存材料。细胞的形态和数量以及储存材料的含量和结构影响^{种子7、12的重量和质量}。虽然立体学和图像分析技术可以测量组织区域细胞的大小和数量，但许多实验室都缺乏这种技术。石蜡和树脂部分提供二维 （2D） 图像，无法分析细胞的真实大小和数量。然而，细胞在它们的任?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A501931
Compact glass staining jar (5-Place)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E678013
Coomassie brilliant blue R-250	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A100472
Coverslip	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F518211
Double-sided blade	Gillette Shanghai Co., Ltd.	74-S
Ethanol absolute	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500737
Flattening table	Leica	HI1220
Fluorescence microscope	Olympus	BX60
Fluorescent brightener 28	Sigma-Aldrich	910090
Glass strips	Leica	840031
Glutaraldehyde 50% solution in water	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600875
Glycerol	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600232
Iodine	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500538
Isopropanol	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A507048
Light microscope	Olympus	BX53
LR White resin	Agar Scientific	AGR1281A
Oven	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.	9023A
Potassium iodide	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A100512
Slide	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F518101
Tweezers	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F519022
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A607793
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A502805
Ultramicrotome	Leica	EM UC7