Простой сухой метод секций для получения раздела смолы размером с цельное семя и его применения

Резюме

Этот метод позволяет быстро и просто подготовить раздел смолы размером с цельное семя для наблюдения и анализа клеток, крахмала гранул и белковых тел в различных регионах семян.

Аннотация

Морфология, размер и количество клеток, крахмала гранул и белковых тел в семени определяют вес и качество семян. Они существенно отличаются между различными регионами семян. Для того, чтобы четко просмотреть морфологии клеток, крахмальных гранул и белковых тел и количественно проанализировать их параметры морфологии, необходим раздел размером с цельное семя. Хотя цельносовый парафиновый раздел может исследовать накопление материалов хранения в семенах, очень трудно количественно проанализировать параметры морфологии клеток и материалов хранения из-за низкого разрешения толстого сечения. Тонкий раздел смолы имеет высокое разрешение, но обычный метод секции смолы не подходит для подготовки цельного семенного размера раздела зрелых семян с большим объемом и высоким содержанием крахмала. В этом исследовании мы представляем простой сухой метод сечения для подготовки раздела смолы размером с семя. Техника может подготовить крест и продольные цельного семени размера разделов развивающихся, зрелых, проросли, и приготовленные семена, встроенные в LR белой смолы, даже для больших семян с высоким содержанием крахмала. Раздел размером с семя может быть окрашен флуоресцентным осветлением 28, йодом и Кумасси блестящим синим R250, чтобы конкретно проявлять морфологию клеток, крахмала гранул и белковых тел четко, соответственно. Полученное изображение также может быть проанализировано количественно, чтобы показать параметры морфологии клеток, крахмала гранул и белковых тел в различных регионах семян.

Введение

Семена растений содержат материалы хранения, такие как крахмал и белок, и обеспечивают энергию и питание для людей. Форма, размер и количество клеточных и складских материалов определяют вес и качество семян. Клетки и материалы хранения в разных регионах семян имеют значительно разные морфологии, особенно для некоторых высокоамилозы зерновых культур с ингибированием фермента ветвления крахмала IIb^1,2,3. Поэтому очень важно исследовать морфологии клеток и материалов хранения в разных регионах семян.

Парафин раздел является хорошим методом для подготовки цельного семенного размера раздела и может проявлять структуру тканей семян и накопление материала хранения в различных^{регионах семян 4,5,6}. Тем не менее, парафиновые секции обычно имеют толщину 6-8 мкм с низким разрешением; таким образом, очень трудно четко наблюдать и количественно анализировать морфологию клеточных и складских материалов. Секции смолы обычно имеют толщину 1-2 мкм и высокое разрешение и очень подходят для наблюдения и анализа морфологии клеточных и складских^{материалов 7.} Тем не менее, обычный метод секции смолы имеет трудности в подготовке цельного семенного размера раздела, особенно для семян с большим объемом и высоким содержанием крахмала; таким образом, нет никакого способа наблюдать и анализировать морфологию клеток и материалов хранения в различных регионах семян. LR Белая смола акриловой смолы и проявляет низкую вязкость и сильную проницаемость, что приводит к его хорошее применение в подготовке смолы разделе семян, особенно для зерновых зрелых ядер с большим объемом и высоким содержанием крахмала. Кроме того, образец, встроенный в LR Белая смола может быть легко окрашены со многими химическими красителями, чтобы четко проявлять морфологию клеток и материалов хранения под светом или флуоресцентным^{микроскопом 7}. В нашей предыдущей работе мы сообщали о сухом методе секции для подготовки секций размером с цельное семя зрелых зерновых ядер, встроенных в LR White resin. Метод может также подготовить цельносадового размера раздел развивающихся, проростых и приготовленных зерновых ядра⁸. Полученный раздел размером с цельное семя имеет много применений в микроморфологии наблюдения и анализа, особенно для четкого просмотра и количественного анализа морфологических различий клеток и материалов хранения в различных регионах^{семян 8,9}.

Этот метод подходит для исследователей, которые хотят наблюдать микроструктуры ткани и формы и размера клеток, крахмала гранулы, и белковых тел в различных регионах семян с помощью светового микроскопа. Изображения секций размером с цельное семя, окрашенных специально для экспонирования клеток, крахмальных гранул и белковых тел, могут быть проанализированы программным обеспечением для анализа морфологии для количественного измерения параметров морфологии клеток, крахмальных гранул и белковых тел в различных регионах семян. Для того, чтобы продемонстрировать техническую применимость и цельного семени размера раздела приложений, мы исследовали зрелые семена кукурузы и масличного рапса и развивающихся, проросли, и приготовленные ядра риса в этом исследовании. Протокол содержит четыре процесса. Здесь мы используем зрелое ядро кукурузы, которое является наиболее трудным в подготовке целых семян размера разделов из-за большого объема и высокого содержания крахмала, в качестве образца для выставки процессов шаг за шагом.

протокол

1. Подготовка семян, встроенных в смолу (рисунок 1)

1. Зафиксите шесть зрелых ядер кукурузы в 10 мл 2,5% фосфатного буфера глутаралдегида (0,1 М, рН7,2) при 4 градусов по Цельсию на 48 ч. Исследователя могут выбрать другие фиксаторные смеси, фиксаторные концентрации, и условия фиксации согласно их целям исследования и типам ткани.
2. Выньте ядра и нарежьте их продольно или поперечно до толщины 2-3 мм с помощью резкого двухстороннего лезвия, и зафиксните их в 10 мл 2,5% фосфатно-буферного глутаралдегида (0,1 м, рН 7,2) снова на 48 ч.
3. Мыть образцы три раза с 10 мл 0,1 М фосфат буфера (рН 7,2) в течение 30 минут каждый раз.
4. Обезвоживаемые образцы в высших сортах этанола aqueous раствор (10 мл) от 30% до 50%, 70%, 90% один раз, и 100% три раза в течение 30 минут каждый раз.
5. Проникнуть образцов в 10 мл увеличения классов LR Белая смола раствор разбавлен этанолом от 25% до 50%, 75% один раз, и 100% дважды при 4 кк на 12 ч каждый раз.
6. Подготовь пьедесталы для образцов перед встраиванием. Добавьте 0,25 мл 100% белой смолы LR в 2-метровую центрифугу и полимеризируйте ее при 60 градусах Цельсия за 48 ч.
7. Последовательно добавляйте чистую белую смолу LR (0,5 мл) и проникший образец в центрифугу с пьедесталом. Выпрямите образцы анатомической иглой и полимеризируйте их при температуре 60 градусов по Цельсию в духовке на 48 ч.

2. Сухая секция для подготовки раздела размером с цельное семя(рисунок 1)

1. Выньте встроенные ядра из центрифуги трубки и вырезать избыток смолы вокруг образца с помощью острого лезвия.
2. Зажим блока смолы в образце держателя ультрамикротома (EM UC7), и обрезать излишние смолы на поверхности образца и вокруг образца с лезвием.
3. Польский поверхности образца мелко со стеклянным ножом, пока полный раздел может быть сформирован.
4. Положите небольшой медный крюк около 2 мм над краем лезвия перед резки и вырезать образец в 2 мкм разделе. Роль крючка заключается в том, чтобы избежать керлинга вверх по секции.
5. Положите крючок под раздел, чтобы поддержать его, когда раздел становится длинным.
6. Добавьте 100 мл воды на необработавую горку и тщательно перенесите полный и непрерывный участок в воду с помощью пинцета.
7. Для того, чтобы сгладить морщинистую секцию, нагрейте и высушите образец на уплощающий стол при температуре 50 градусов по Цельсию на ночь.
   1. Если секция рушится или слезы, продлить время для каждого проникновения смолы образца от 12 ч до 24 ч или 48 ч.
   2. Если секция имеет несколько линий параллельно ножу, зажим образца блок плотно. Если секция имеет некоторые линии вертикальной к ножу, пожалуйста, используйте новый нож.

3. Окрашивание и наблюдение за разделом

ПРИМЕЧАНИЕ: Для того, чтобы наблюдать структуру тканей и морфологии клеток, крахмала гранулы, и белковые тела, пятно разделов с конкретными пятнами в соответствии с целью исследования. Здесь мы используем флуоресцентные осветления 28, раствор йода, и Coomassie блестящий синий R250, чтобы испачкать клеточные стенки, крахмал гранулы, и белковые тела, соответственно.

1. Для наблюдения за морфологией клеток, пятно раздела с 40 мл 0,1% (ж / в) флуоресцентные ярче 28 aqueous раствор в 70 мл компактного стекла окрашивания банку при 45 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем промыть его проточной водой в течение 5 минут. Наблюдайте и фотографуйте раздел под флуоресцентным микроскопом, оснащенным камерой CCD.
2. Для наблюдения за морфологией крахмала гранулы, пятно разделе с 40 йл йодного раствора (0,07% (w/v) I₂ и 0,14% (w/v) KI в 25% (v/v) глицерол) в течение 1 мин, и покрыть образец, содержащий раствор йода с крышкой. Просмотр и фотографирование образца под световым микроскопом, оснащенным камерой CCD.
3. Для наблюдения за морфологией белковых тел погрузите секцию с 40 мл 10% (v/v) уксусной кислоты в компактную стеклянную банку для окрашивания 70 мл в течение 10 мин при 45 градусах Цельсия, а затем испачкать его в 40 мл 1% (w/v) Coomassie блестящий синий R250 в 25% (v/v) изопропанол и 10% (v/v) уксусной кислоты в течение 15 мин при 45 градусов по Цельсию. Вымойте окрашенные секции проточной водой в течение 5 минут, и высушить его. Наблюдайте и фотографуйте раздел под световым микроскопом, оснащенным камерой CCD.

4. Количественный анализ параметров морфологии

1. Обработать и количественно проанализировать сфотографированные изображения для области, длинной/короткой оси и округливости клеток, крахмала гранул и белковых тел в различных регионах семян с помощью программного обеспечения для анализа морфологии (Image-Pro Plus 6.0 программное обеспечение) после процедур Чжао и^{др. 9} точно.

Результаты

Простой сухой метод секции для получения раздела размером с цельное семя
Мы устанавливаем простой сухой метод секции для подготовки цельного семенного размера раздела семян, встроенных в LR-белую смолу(рисунок 1). Метод может подготовить поперечные и продольн...

Обсуждение

Семена являются наиболее важным возобновляемым ресурсом для производства продовольствия, кормов и промышленного сырья и богаты такими материалами хранения, как крахмал и белок. Морфология и количество клеток, содержание и конфигурация материалов для хранения влияют на вес и качество...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetic acid	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A501931
Compact glass staining jar (5-Place)	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	E678013
Coomassie brilliant blue R-250	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A100472
Coverslip	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F518211
Double-sided blade	Gillette Shanghai Co., Ltd.	74-S
Ethanol absolute	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500737
Flattening table	Leica	HI1220
Fluorescence microscope	Olympus	BX60
Fluorescent brightener 28	Sigma-Aldrich	910090
Glass strips	Leica	840031
Glutaraldehyde 50% solution in water	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600875
Glycerol	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A600232
Iodine	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A500538
Isopropanol	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A507048
Light microscope	Olympus	BX53
LR White resin	Agar Scientific	AGR1281A
Oven	Shanghai Jing Hong Laboratory Instrument Co.,Ltd.	9023A
Potassium iodide	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A100512
Slide	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F518101
Tweezers	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	F519022
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A607793
Sodium phosphate monobasic dihydrate	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.	A502805
Ultramicrotome	Leica	EM UC7